郭善嫻 黃先明 蔡 勇 簡(jiǎn) 艷 劉志良 蔡 云 詹勤元 鈄方芳

肺癌是全世界腫瘤致死率最高的惡性腫瘤，在所有的肺癌中約85%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)［1］。盡管在早期檢測(cè)和治療方面的進(jìn)步，患者預(yù)后仍然較差，其 5年生存率低于15%［2］。因此，尋找新的抑癌基因，并探討它們的臨床意義是非小細(xì)胞肺癌研究的一個(gè)重要組成部分。

NR4A3也稱作Nor-1，屬于孤兒核受體家族成員之一。該家族成員之所以被稱作“孤兒”受體是因?yàn)槟壳吧形窗l(fā)現(xiàn)它們的內(nèi)源性配體，而主要依賴生理信號(hào)所產(chǎn)生，包括:脂肪酸、前列腺素、生長(zhǎng)因子、鈣、炎癥因子、肽激素及神經(jīng)遞質(zhì)等。它們被激活后作用于靶基因參與細(xì)胞周期、凋亡、炎癥、代謝、DNA修復(fù)及腫瘤生成等調(diào)節(jié)。文獻(xiàn)報(bào)道NR4A3為髓系白血病發(fā)生的腫瘤抑制基因［3］。減少NR4A1和NR4A3和基因的表達(dá)量會(huì)導(dǎo)致小鼠發(fā)生骨髓增殖性腫瘤［4］。對(duì)實(shí)體瘤的研究表明甲狀腺濾泡狀癌組織中Nor-1的表達(dá)水平明顯低于濾泡狀甲狀腺瘤［5］。國(guó)內(nèi)薛騫等還發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方益胃飲通過(guò)上調(diào)Nor-1表達(dá)水平抑制胃癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］，目前Nor-1在肺癌中的表達(dá)及作用還不清楚。

CD133+肺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的成瘤及自我更新能力，故被認(rèn)為是肺癌干細(xì)胞［7］。CD133高表達(dá)的NSCLC患者具有耐藥表型，且預(yù)后較差［8-10］。揭示肺癌干細(xì)胞中CD133表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，針對(duì)CD133+細(xì)胞的治療對(duì)于探索肺癌治療的新方法具有重要意義［11］。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織中Nor-1的表達(dá)情況，以探討其與NSCLC發(fā)生、發(fā)展及腫瘤干細(xì)胞相關(guān)抗原CD133表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

隨機(jī)選取江西省腫瘤醫(yī)院胸外科2012年8月-2014年8月收治的NSCLC病例84例，其中男性58例，女性26例;年齡47～75歲，平均59.8歲，均經(jīng)術(shù)后病理檢測(cè)證實(shí)。術(shù)前均未接受放療和化療，臨床資料完整。另選擇相應(yīng)距腫瘤邊緣5 cm以外的正常肺組織作為對(duì)照。

1.2 免疫組織化學(xué)法

所有蠟塊做3 μm厚連續(xù)切片，每個(gè)蠟塊均切7張，1張行HE染色組織學(xué)診斷，其余6張做免疫組化染色，排除染色不佳及飛片等情況，2名病理學(xué)專家對(duì)HE染色的病理切片進(jìn)行篩選，找出腫瘤組織中有代表性的區(qū)域，并在相應(yīng)石蠟塊上作標(biāo)記。應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)標(biāo)本中的NR4A3與CD133蛋白。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，光鏡觀察。

1.3 結(jié)果判定

由2名病理科醫(yī)生在對(duì)臨床資料均不知情的背景下獨(dú)立完成結(jié)果判定。根據(jù)腫瘤細(xì)胞顯色的比例及染色強(qiáng)度對(duì)NR4A3表達(dá)做半定量判定，按陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，10%～50%為2分;＞50%為3分;按顯色程度評(píng)分:染色弱為1分;中等染色為2分;強(qiáng)染色為3分。將2種評(píng)分結(jié)合起來(lái)分為9級(jí)，大于3級(jí)可以認(rèn)為是陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用卡方檢驗(yàn)評(píng)估各臨床病理參數(shù)CD133，NR4A3表達(dá)的關(guān)系，n＜5時(shí)采用Fisher精確概率檢驗(yàn)，CD133與NR4A3蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NR4A3與CD133蛋白的表達(dá)定位

免疫組化顯示NR4A3蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要定位于胞核，部分位于細(xì)胞漿，呈現(xiàn)棕黃色顆粒。在正常肺組織標(biāo)本中可見(jiàn)NR4A3蛋白強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而NR4A3在NSCLC組織中表達(dá)或缺失，或弱至中等強(qiáng)度陽(yáng)性。NR4A3在NSCLC中的陽(yáng)性表達(dá)率為23.8%，與正常肺組織(92.7%)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CD133的免疫組化陽(yáng)性定位于胞膜和胞質(zhì)中，在鏡下呈散在，小簇狀分布，在癌周正常肺組織及癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率分別為 11.9%(10/84)和73.8%(62/84)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 NR4A3陽(yáng)性表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

NR4A3在NSCLC組織中的表達(dá)與患者腫瘤細(xì)胞分化程度有關(guān)，隨著腫瘤細(xì)胞分化減低，NR4A3表達(dá)呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)(P＜0.05);與不吸煙的患者相比，吸煙患者中NR4A3表達(dá)明顯減低;而NR4A3表達(dá)與患者的性別、年齡、病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期等均無(wú)關(guān)(P ＞0.05)(表1)。

2.3 NR4A3與CD133表達(dá)的關(guān)系

NR4A3和 CD133共同表達(dá)陽(yáng)性者為18例(21.43%)，共同表達(dá)陰性者為 20例(23.81%);NR4A3表達(dá)陽(yáng)性，CD133表達(dá)陰性者2例(2.38%)，NR4A3表達(dá)陰性，CD133表達(dá)陽(yáng)性者 44例(52.38%)，兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(γ =-0.219，P＜0.05)(圖1)。

圖1 肺癌組織中NR4A3與CD133表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)

3 討論

肺癌是全世界致死率最高的腫瘤，盡管診斷和治療方法不斷改進(jìn)，NSCLC的5年生存率仍然較低。而如此低的生存率主要與腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)是腫瘤組織中一小部分具有自我更新，無(wú)限增殖和多向分化能力的腫瘤細(xì)胞 ，是腫瘤發(fā)生發(fā)展，轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的根源。有關(guān)的臨床研究表明，肺癌組織中CD133表達(dá)量高的NSCLC 患者具有耐藥表型［12］，且預(yù)后較差［8-10］。因此，揭示肺癌干細(xì)胞中CD133表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于探索這種肺癌治療方法具有重要意義。

表1 NR4A3和CD133陽(yáng)性表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

NR4A受體在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用，近年來(lái)引發(fā)了不同研究領(lǐng)域的興趣。Wenzl等的研究表明NR4A1(NUR77)和NR4A3(NOR-1)受體在造血系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要的作用［13］。近期研究中發(fā)現(xiàn)核受體NR4A1是TGF-α信號(hào)一個(gè)強(qiáng)有力的激活因子［14］，并參與乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制。NR4A1在腎腺癌細(xì)胞系中表現(xiàn)出親癌活性［15］，并認(rèn)為其可作為腎細(xì)胞癌靶向治療的靶點(diǎn)，與其高度同源的家族成員NR4A3在肺癌中的分布及其與CD133的相關(guān)意義目前暫未有類似研究。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)結(jié)果表明肺癌組織中NR4A3(Nor-1)表達(dá)陽(yáng)性率(14.6%)明顯低于相應(yīng)的遠(yuǎn)癌正常肺組織(92.7%);因此我們推測(cè)NR4A3(Nor-1)作為核受體超家族孤兒受體的一員，與肺癌的發(fā)生和發(fā)展存在著密切的聯(lián)系。在我們的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與肺癌患者腫瘤細(xì)胞分化程度有關(guān)，隨著腫瘤細(xì)胞分化程度減低，表達(dá)呈現(xiàn)遞減趨勢(shì);其表達(dá)水平與患者吸煙與否相關(guān)，吸煙組NR4A3蛋白表達(dá)減弱或缺失較非吸煙組高;而與年齡、性別、組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期等均無(wú)關(guān)。

本研究表明NR4A3和CD133在NSCLC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，提示二者可能在功能上存在一定相關(guān)性，有研究表明，NR4A3的生物學(xué)功能主要是通過(guò)對(duì)其靶基因表達(dá)的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的，其過(guò)表達(dá)后能抑制其靶基因Smad3的表達(dá)［16-17］，而Smad3參與CD133啟動(dòng)子去甲基化而影響 CD133基因轉(zhuǎn)錄［18］，提示NR4A3和CD133可能協(xié)同參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展。結(jié)合已有的報(bào)道及我們的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探討NSCLC中NR4A3、CD133基因表達(dá)關(guān)系及作用機(jī)制提供了線索，值得進(jìn)一步深入的研究。

［1］Siegel R，DeSantis C，Virgo K，et al.Cancer treatment and survivorship statistics，2012〔J〕.CA Cancer J Clin，2012，62(4):220-241.

［2］Cho S，Park TI，Lee EB，et al.Poor prognostic factors in surgically resected stage i non-small cell lung cancer:Histopathologic and immunohistochemical analysis〔J〕.Korean J Thorac Cardiovasc Surg，2012，45(2):101-109.

［3］Jeong Y，Xie Y，Xiao G，et al.Nuclear receptor expression defines a set of prognostic biomarkers for lung cancer〔J〕.PLoS Med，2010，7(12):e1000378.

［4］Ramirez-Herrick AM，Mullican SE，Sheehan AM，et al.Reduced nr4a gene dosage leads to mixed myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms in mice〔J〕.Blood，2011，117(9):2681-2690.

［5］Borup R，Rossing M，Henao R，et al.Molecular signatures of thyroid follicular neoplasia〔J〕.Endocr Relat Cancer，2010，17(3):691-708.

［6］薛 騫，柴可群，周永列，等.益胃飲含藥血清對(duì)胃癌細(xì)胞mfc增殖凋亡及nr4a3/hgf表達(dá)的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29(6):1326-1331.

［7］Sullivan JP，Minna JD，Shay JW.Evidence for self-renewing lung cancer stem cells and their implications in tumor initiation，progression，and targeted therapy〔J〕.Cancer Metastasis Rev，2010，29(1):61-72.

［8］Xu YH，Zhang GB，Wang JM，et al.B7-h3 and cd133 expression in non-small cell lung cancer and correlation with clinicopathologic factors and prognosis〔J〕.Saudi Med J，2010，31(9):980-986.

［9］Wu S，Yu L，Wang D，et al.Aberrant expression of cd133 in non-small cell lung cancer and its relationship to vasculogenic mimicry〔J〕.BMC Cancer，2012，12:535.

［10］Mizugaki H，Sakakibara-Konishi J，Kikuchi J，et al.Cd133 expression:A potential prognostic marker for non-small cell lung cancers〔J〕.Int J Clin Oncol，2014，19(2):254-259.

［11］Chen K，Huang YH，Chen JL.Understanding and targeting cancer stem cells:Therapeutic implications and challenges〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2013，34(6):732-740.

［12］Salnikov AV，Gladkich J，Moldenhauer G，et al.Cd133 is indicative for a resistance phenotype but does not represent a prognostic marker for survival of non-small cell lung cancer patients〔J〕.Int J Cancer，2009，126(4):950-958.

［13］Wenzl K，Troppan K，Neumeister P，et al.The nuclear orphan receptor nr4a1 and nr4a3 as tumor suppressors in hematologic neoplasms〔J〕.Curr Drug Targets，2015，16(1):38-46.

［14］Zhou F，Drabsch Y，Dekker TJ，et al.Nuclear receptor nr4-a1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating tgf-beta signalling〔J〕.Nat Commun，2014，5:3388.

［15］Hedrick E，Lee SO，Kim G，et al.Nuclear receptor 4a1(nr4a1)as a drug target for renal cell adenocarcinoma〔J〕.PLoS One，2015，10(6):e0128308.

［16］Beard JA，Tenga A，Chen T.The interplay of nr4a receptors and the oncogene-tumor suppressor networks in cancer〔J〕.Cell Signal，2015，27(2):257-266.

［17］Yin H，Lo JH，Kim JY，et al.Expression profiling of nuclear receptors identifies key roles of nr4a subfamily in uterine fibroids〔J〕.Mol Endocrinol，2013，27(5):726-740.

［18］You H，Ding W，Rountree CB.Epigenetic regulation of cancer stem cell marker cd133 by transforming growth factor-beta〔J〕.Hepatology，2010，51(5):1635-1644.