柳斌斌

摘 要：實驗采用傳統(tǒng)植物內生菌分離方法，從一株藍果樹科植物的根、枝、葉片上分離得到16株內生真菌；通過對峙抑菌試驗篩選得到2株具有抑菌活性的內生真菌，編號為G-1、G-4，并對這2株內生真菌進行發(fā)酵，對發(fā)酵液做抑菌試驗，結果顯示，此2株內生菌具有較明顯的抑菌作用。

關鍵詞：植物內生真菌；抑制作用；發(fā)酵液試驗

中圖分類號 Q94 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）21-43-03

The Endophytic Fungi Isolated from a Blue Fruit Plant and the Determination of Inhibitory Effect

Liu Binbin

（Soil and Fertilizer Station of Suzhou City，Suzhou 234000，China）

Abstract：In this experiment，we obtained 16 endophytic fungiuse isolated from the roots，branches and leaves of a blue fruit plant，using the traditional method of endophyte separation；we obtained two endophytic fungi with antibacterial activity through the antimicrobial test，G-1，G-4，and ferment this two endophytic fungi，test the antibacterial of the fermentation broth，the results showed that the two endophyte with more pronounced bacteriostasis.

Key words：Endophytic fungi；Inhibited effect；Fermentation broth test

植物內生真菌作為生物防治菌株有多方面的優(yōu)勢，在防治真菌、細菌引起的病害以保護宿主植物中起著非常重要的作用。所謂植物內生真菌（endophyte），是存在于健康植物組織內的對植物組織沒有明顯病害癥狀的一類真菌微生物[1]，近年來研究表明，其通常會產生與其宿主植物相同或相似的生理活性物質[2]，在宿主的生長發(fā)育和系統(tǒng)演化過程中起重要的作用[3]。真菌產生的生物活性物質存在極大的多樣性（如抗腫瘤、抗病毒、抗細菌、抗真菌、抗蟲等物質），利用植物內生真菌來研究開發(fā)生物農藥，是解決化學農藥‘3R問題（抗性、殘留和再猖獗）的有效途徑之一[4]。植物內生真菌能夠產生功能特殊的次生代謝產物，是新化合物新藥物的潛在資源，它們在醫(yī)藥、工業(yè)、農業(yè)等領域具有重要的應用前景[5]，利用微生物防治植物病害就是利用微生物對病原物的抑制作用。為此，筆者對從植物中分離出的菌株進行液體培養(yǎng)，并對其發(fā)酵產物進行了殺菌活性的測定。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

1.1.1 植物病原菌 番茄灰霉（FQhm），番茄枯萎（FQkw），茄黑紋（Qhw），蘋果輪紋（PGlw），葡萄灰霉（PThm），梨黑心（Lhx），蘋果腐爛菌（PGfl），葡萄黑豆（PThd），棗炭疽（Ztj），均由安徽農業(yè)大學植病實驗室提供。

1.1.2 植物內生菌 G-1、G-4，從一株藍果樹體內分離，由本實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 分離培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1 000mL，ph自然。

1.2.2 PDA培養(yǎng)基制備方法 取新鮮馬鈴薯200g洗凈，去皮，切成1cm見方的小塊，放入1 000mL水中煮沸30min，用2層紗布過濾。加入稱量好的葡萄糖（或蔗糖）和瓊脂，加熱攪拌至瓊脂完全融化，加蒸餾水配制成1 000mL溶液。趁熱用分裝漏斗分裝于500mL三角瓶中，橡皮紙封口注上標簽；高壓蒸汽滅菌121℃滅菌30min備用。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基PDA液體培養(yǎng)基 方法同上，不加瓊脂。

1.3 內生真菌的分離 取樣品適當大?。ㄖl長度5cm左右，葉片為全葉的1/2大小，種子整粒）按以下步驟處理：自來水表面清洗4～5次→消毒紙巾吸干水分→75%酒精漂洗4～5min→無菌水沖洗2～3次→消毒紙巾吸干水分→0.1%升汞漂洗10～30s→無菌水沖洗4～5次，無菌條件下將枝條韌皮部切去再切成5mm×5mm小塊，種子切成5mm×10mm大小，葉片5mm×5mm大小，置于平板培養(yǎng)基上28℃避光恒溫培養(yǎng)；最后一次沖洗無菌水設為對照培養(yǎng)，若無培養(yǎng)物生長說明樣品消毒徹底。

1.4 內生菌的純化保存

1.4.1 純化 平板培養(yǎng)2～3d后，其邊緣長出菌絲，用接種針挑取邊緣生長良好的菌絲，分別接種在新的固體培養(yǎng)基上，待新接種的菌絲長成菌落后，再挑取其邊緣的菌絲培養(yǎng)，如此反復純化，得到純化的菌株。觀察記錄菌落的生長情況及特征。

1.4.2 保存 純化后的內生菌平板活化，取生長旺盛的內生菌接種到斜面低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 篩選

1.5.1 初篩 將內生菌平板活化，在菌落邊緣打取菌碟（直徑7mm）接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，采用對峙培養(yǎng)測定法，在培養(yǎng)基的4個角接病原菌，距離2.5cm左右，以不接內生菌的單皿單菌碟的病原菌為對照，28℃下培養(yǎng)，每天觀察，記錄下有抑菌作用的內生菌，保存下來以備復篩。

1.5.2 復篩 將初篩所得的內生菌轉接活化3～4d，采用對峙培養(yǎng)測定法，把活化好的內生菌置于含供試病原菌的PDA培養(yǎng)基上，內生菌菌碟與病原菌菌碟在培養(yǎng)皿的直徑上，兩者相距2.5cm左右。設3個重復，用只接病原菌菌碟的PDA培養(yǎng)基作對照，28℃培養(yǎng)3～4d，記錄抑菌半徑。

1.6 發(fā)酵試驗 取活力旺盛的內生真菌G-4、G-1的菌碟（直徑7mm），無菌條件下放入250mL裝有100mLPD培養(yǎng)基的搖瓶里，每瓶3塊菌碟，3個重復；28℃，160r/min搖床發(fā)酵7d。發(fā)酵液8 000r/min離心，無菌過濾（平行試驗除菌方法為121℃高壓滅菌30min）上清液1mL加入培養(yǎng)皿，然后把冷卻到50℃左右的PDA9mL倒入同一皿中立即搖勻。凝固后接入病原菌菌碟，以不加上清液的為對照，28℃黑暗培養(yǎng)3～4d測量菌絲直徑。

1.7 測量計算方法 用十字交叉法測量菌絲直徑m1、m2，然后按以下公式計算抑菌率：

菌落半徑m=（m1+m2）/4；

抑菌率（%）=（對照半徑-處理半徑）/對照半徑×100

2 結果與分析

2.1 內生菌分離結果 經分離觀察發(fā)現，植株根部、莖部和葉片都發(fā)現有內生真菌，但不同部位內生真菌的數量不同，從表1可知：根部比莖部的數量要多，葉片最多。

2.2 篩選結果 用平板對峙法，測定了內生真菌各菌株對病原真菌的拮抗作用。由表2可知：G-1、G-4對9種病原菌均有不同程度的抑制作用。其中G-4對番茄灰霉和蘋果腐爛病具有較明顯的抑制作用，抑制率分別為82.8%、79.5%，對茄黑紋抑制作用最強，抑制率達89.7%，并產生明顯抑菌帶；對葡萄黑痘病抑制作用較弱，抑制率為40.8%。G-1對蘋果腐爛病抑制率最高，達77.0%，對葡萄黑痘病抑制率最弱，為38.1%。從表2可以看出，G-1、G-4對番茄灰霉和蘋果腐爛病均有較強的一致作用，對葡萄黑痘病的作用則較弱。

2.3 發(fā)酵抑菌試驗結果 從發(fā)酵試驗結果看，G-4和G-1對幾種病原菌基本上都有較明顯的抑制作用。相對而言G-4的抑制效果更好一點，其中G-4對番茄枯紋病菌、番茄灰霉病菌、早炭疽病菌、葡萄黑豆病菌、梨黑心病菌的抑制效果更好點，都在40%以上；G-1對葡萄灰霉病菌、葡萄黑豆病菌、蘋果螺紋病菌的抑制效果更好點，都在40%以上；G-4和G-1對蘋果腐爛病菌的抑制效果最差，都在20%左右。

3 討論

G-4菌種可能有某種抑制作用，但希望不大，如果發(fā)酵液亦無抑制效果，將放棄該菌；G-1菌種的價值較高，但其孢子體較多，易從菌絲上脫落，接菌時容易同菌株污染。

在篩選時，為了防止漏篩，需要選擇合適的供試微生物，選擇供試菌要考慮：（1）是否具有代表性；（2）是否具有科研價值與經濟價值；（3）宿主植物是否對其有明顯的抑制活性；（4）是否為宿主植物的病原菌等。前2種因素可以有效降低漏篩風險，后2種因素是基于植物內生真菌與其宿主植物的次生代謝存在相似性以及植物內生真菌可以提高宿主植物抗病性的原理。

目前，內生真菌研究的基本步驟為：植物組織的表面消毒，在營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)植物組織，內生真菌的分離和純化，根據經典形態(tài)學方法鑒定菌種。在內生真菌研究過程中，存在以下2個方面的問題：（1）即使用不同的營養(yǎng)培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物組織，也不能保證所有生活在植物組織內的真菌全部被分離出來，可能有的內生真菌不能在人工培養(yǎng)基上生長。另外，雖然在分離營養(yǎng)培養(yǎng)基中加入一些抑制真菌瘋長的化學物質，但還是有一些生長緩慢的真菌常被生長快的菌所覆蓋，同樣不能分離到這類生長緩慢的真菌；（2）有的菌株在人工培養(yǎng)基上不產生有性孢子或無性孢子，這些不產孢菌株是無法用經典形態(tài)學方法進行鑒定，為了克服現行研究方法帶來的缺陷，就需要應用分子生物學方法來彌補研究方法的不足。

參考文獻

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[2]谷蘇，邵華，蔣曉華，等.藥用植物內生真菌多樣性及其活性成分的潛在應用價值[J].中國藥學雜志，2001，36（1）：14.

[3]曾松榮，徐成東，王海坤，等.藥用植物內生真菌及其具宿主相同活性成分的機制初探[J].中草藥，2000，31（4）：306.

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[5]鄒文欣，譚仁祥.植物內生菌研究新進展[J].植物學報，2001，43（9）：881. （責編：張宏民）