司素華，熊二夢(mèng)，杜鳳儀，彭琬昕，龔愛(ài)華

（1.如皋市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇如皋226500；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

干擾乳酸脫氫酶A表達(dá)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖與遷移的影響

司素華1，熊二夢(mèng)2，杜鳳儀2，彭琬昕2，龔愛(ài)華2

（1.如皋市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇如皋226500；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：觀察靶向乳酸脫氫酶A（1actate dehydrogenase-A，LDHA）的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞系的干擾效率及其對(duì)細(xì)胞增殖與遷移的影響。方法：設(shè)計(jì)合成LDHA及對(duì)照eGFP shRNA序列，克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pLKO.1-TRC，質(zhì)粒抽提純化后測(cè)序鑒定。重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系，采用反轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR和免疫印跡檢測(cè)LDHA的表達(dá)，驗(yàn)證shRNA的干擾效率。采用CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾LDHA后細(xì)胞增殖的變化，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾LDHA對(duì)細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果：成功構(gòu)建針對(duì)LDHA和對(duì)照eGFP的shRNA表達(dá)質(zhì)粒。與轉(zhuǎn)染sh-eGFP組相比，轉(zhuǎn)染sh-LDHA組HepG2細(xì)胞中LDHA mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P均＜0.05）。與sh-eGFP組相比，sh-LDHA組72，96 h細(xì)胞增殖明顯降低，克隆形成數(shù)減少，細(xì)胞遷移距離短（P均＜0.05）。結(jié)論：LDHA的干擾質(zhì)粒能有效干擾LDHA在肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)，明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖活力和遷移能力。

肝細(xì)胞肝癌；乳酸脫氫酶A；RNA干擾

肝細(xì)胞肝癌簡(jiǎn)稱肝癌，在世界致死性腫瘤中位居第三，每年死亡人數(shù)約70萬(wàn)［1］。由于肝癌患者確診晚、伴有肝病和缺乏有效的治療方式，只有30％～40％患者適合治療［2］。瓦伯格效應(yīng)（Warburg Effect）是指癌細(xì)胞生長(zhǎng)很快，使得細(xì)胞經(jīng)常處于一種缺氧狀態(tài)，于是癌細(xì)胞就關(guān)閉了線粒體的有氧氧化，通過(guò)葡萄糖無(wú)氧酵解提供能量的現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞依賴糖酵解產(chǎn)生ATP，抑制糖酵解干擾能量代謝治療腫瘤成為可能［3］。瓦伯格效應(yīng)的最后一步是丙酮酸經(jīng)乳酸脫氫酶A（1actate dehydrogenase-A，LDHA）催化轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?。研究表明LDHA在胰腺癌、胃癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)［4］。但LDHA在肝癌細(xì)胞中的作用尚不清楚。本研究旨在探討干擾人肝癌HepG2細(xì)胞中LDHA的表達(dá)后細(xì)胞增殖與遷移的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；pLKO.1-TRC環(huán)形質(zhì)粒（美國(guó)Addgene公司）；DMEM及胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；LipofectamineTM2000和Stb13感受態(tài)細(xì)胞（美國(guó)Invitrogen公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒，簡(jiǎn)稱CCK-8（美國(guó)Sigma公司）；內(nèi)切酶AgeⅠ、EcoRⅠ和T4連接酶（美國(guó)Neb公司）；總RNA抽提用Trizo1、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒及膠回收試劑盒（日本TaKaRa公司）；質(zhì)粒大提及小提試劑盒（美國(guó)Omega公司）；鼠抗人α-微管蛋白抗體、兔抗人LDHA抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠和羊抗人二抗（美國(guó)Biowor1d公司）；引物及測(cè)序由上海生工生物公司完成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

人肝癌細(xì)胞HepG2接種于含10％胎牛血清的DMEM中，37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代24 h后按照LipofectamineTM2000推薦的操作步驟轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后用0.25％胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 干擾質(zhì)粒構(gòu)建

登錄www.broad.mit.edu/genome_bio/trc/rnai. htm1網(wǎng)站搜索與pLKO.1質(zhì)粒相兼容的LDHA shRNA序列，上游序列：5′-CCGGGCCTGTGCCATCAGTATCTTACTCGAGTAAGATACTGATGGCACAGGCTTTTTG-3′，下游序列：5′-AATTCAAAAAGCCTGTGCCATCAGTATCTTACTCGAGTAAGATACTGATGGCACAGGC-3′；對(duì)照eGFP shRNA上游序列：5′-CCGGTACAACAGCCACAACGTCTATCTCGAGATAGACGTTGTGGCTGTTGTATTTTTG-3′，下游序列：5′-AATTCAAAAATACAACAGCCACAACGTCTATCTCGAGATAGACGTTGTGGCTGTTGTA-3′，由上海生工合成，按Moffat等［5］報(bào)道的方法構(gòu)建sh-RNA表達(dá)載體，構(gòu)建好的載體經(jīng)測(cè)序確認(rèn)。

1.4 反轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR

在轉(zhuǎn)染后48 h Trizo1法提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA， RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞LDHA mRNA的表達(dá)，灰度值分析LDHA的干擾效率。LDHA的上游引物為5′-CCAACATGGCAGCCTTTTCC-3′，下游引物為5′-TCACGTTACGCTGGACCAAA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為149 bp；GAPDH的上游引物為5′-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′，下游引物為5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為121 bp；PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min，然后進(jìn)入以下28個(gè)循環(huán)：94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s。循環(huán)完畢，72℃延伸5 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠中電泳。SmartGe1凝膠成像分析系統(tǒng)成像，Lane 1D Ver 4.0軟件進(jìn)行半定量分析。

1.5 免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72 h后提取蛋白，行10％SDSPAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜。4℃孵育一抗過(guò)夜，LDHA抗體按1∶1 000稀釋，α-微管蛋白抗體（內(nèi)參）按1∶10 000稀釋，二抗1∶10 000稀釋，室溫孵育1 h，用化學(xué)發(fā)光試劑顯示陽(yáng)性條帶，圖像分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以1 000個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板（100 μL/孔），每組6孔，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。于24、48、72、96 h，每孔分別加10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)每孔光密度（D）值，記錄結(jié)果，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以500個(gè)/孔接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)14 d，經(jīng)固定、結(jié)晶紫染色后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，記錄含有50個(gè)細(xì)胞以上的克隆數(shù)量。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以50 000個(gè)/孔接種于24孔板中，待接近形成細(xì)胞單層時(shí)，用10 μL槍頭在24孔板內(nèi)均勻劃直線，PBS洗滌3次；加入含1％胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別測(cè)量0 h和48 h劃痕寬度，平均遷移距離=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/2。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組sh-LDHA和sh-eGFP質(zhì)粒

構(gòu)建好的干擾質(zhì)粒sh-LDHA和對(duì)照質(zhì)粒sheGFP經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，與設(shè)計(jì)完全相符。

2.2 轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后LDHA mRNA和蛋白表達(dá)

結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2，與sh-eGFP組細(xì)胞相比，sh-LDHA組LDHA mRNA表達(dá)水平明顯降低，下降了76.6％（t=6.045，P＜0.05）；蛋白表達(dá)水平也明顯降低，下降了82.6％（t=7.007，P＜0.05）。由此表明，LDHA干擾效果明顯。

圖1 RT-PCR檢測(cè)LDHA mRNA的表達(dá)

圖2 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)LDHA蛋白的表達(dá)

2.3 干擾LDHA后細(xì)胞增殖活力和克隆形成能力的改變

如圖3所示，干擾HepG2細(xì)胞中LDHA的表達(dá)，與sh-eGFP組相比，sh-LDHA組細(xì)胞增殖逐漸減慢，轉(zhuǎn)染72 h后兩組D值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 5.840，P＜0.05），96 h時(shí)sh-LDHA組細(xì)胞增殖活力受到明顯抑制，抑制率為64.5％。

圖3 兩組HepG2細(xì)胞的增殖能力比較

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖4），sh-eGFP組克隆數(shù)為（429.3±19.8），而sh-LDHA組克隆數(shù)為（204.0±10.4），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.557，P＜0.05），表明干擾LDHA可以明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖。

圖4 兩組HepG2細(xì)胞克隆形成的比較

2.4 下調(diào)LDHA表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5，sh-eGFP組平均遷移距離是（211.3±17.1）μm，而sh-LDHA組平均遷移距離是（83.7±4.9）μm，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6. 026，P＜0.05），由此表明，干擾LDHA能明顯抑制HepG2細(xì)胞的遷移能力。

圖5 兩組HepG2遷移能力的比較

3 討論

LDHA是糖酵解途徑中將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的關(guān)鍵酶，是糖酵解途徑的關(guān)鍵檢驗(yàn)點(diǎn)，高表達(dá)于多種類型的腫瘤，包括淋巴瘤、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、胰腺癌和黑色素瘤等。LDHA的表達(dá)與腫瘤的增殖、維持與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在小鼠模型的研究中已經(jīng)表明，腫瘤細(xì)胞依賴于LDHA而正常組織細(xì)胞依賴于氧化磷酸化，敲除LDHA的小鼠癌旁細(xì)胞增殖速率約是癌細(xì)胞的100倍，而過(guò)表達(dá)LDHA則可逆轉(zhuǎn)該增殖抑制［10］。另外，Xie等［11］研究表明LDHA在肺癌A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。因此，抑制LDHA的表達(dá)可能限制腫瘤的能量供應(yīng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力。肝癌是發(fā)展迅速的實(shí)體瘤，腫瘤中存在大片的缺氧區(qū)域，同時(shí)患者血漿中乳酸活性較健康人異常增強(qiáng)，提示肝癌細(xì)胞存在糖酵解活性增強(qiáng)的現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，降低LDHA的表達(dá)可明顯抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖與轉(zhuǎn)移能力，與Rong等［4］報(bào)道在胰腺癌中下調(diào)LDHA表達(dá)可抑制腫瘤增殖活力與轉(zhuǎn)移一致。LDHA遺傳缺陷患者只有在劇烈運(yùn)動(dòng)后才會(huì)出現(xiàn)肌紅蛋白尿癥［10］，因此，在正常情況下抑制LDHA的表達(dá)可能不會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，LDHA有望成為癌癥治療的靶點(diǎn)。

綜上，本研究結(jié)果顯示干擾LDHA后肝癌細(xì)胞HepG2的增殖活力及轉(zhuǎn)移能力受到了明顯的抑制，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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Effects of LDHA knockdown on proliferation and migration of HepG2 cells by RNA interference

SI Su-hua1，XI0NG Er-meng2，DU Feng-yi2，PENG Wan-xin2，G0NG Ai-hua2
（1.Department of Laboratory Medicine，Rugao Hospita1 of Traditiona1 Chinese Medicine，Rugao Jiangsu 226500；2.Medica1 Co11ege of Jiangsu University，ZhenJiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To exp1ore the pro1iferation and migration effects of 1actate dehydrogenase-A（LDHA）short hairpin RNA（shRNA）on hepatoce11u1ar carcinoma HepG2 ce11s.Methods：LDHA and eGFP shRNA sequences were designed and inserted into pLKO.1-TRC p1asmid.HepG2 ce11s were transfected with the recombinant p1asmids that were identified by sequencing.Reverse transcription（RT）-PCR and Western b1otting were used to eva1uate the si1encing effect，CCK-8 experiment and c1one formation assay for pro1iferation，wound hea1ing assay for migration.Results：In HepG2 ce11s，LDHA shRNA significant1y reduced the expression of LDHA，the efficiency of si1encing were 76.6％and 82.6％on the transcription of LDHA gene and the expression of LDHA protein respective1y.Compared with the sh-eGFP group，sh-LDHA group showed decresed ce11uar vitab1it1y，1ower 1eve1s of the formed c1ones，shorter migration distance（both P＜0.05）.Conclusion：LDHA shRNA was successfu11y constructed and cou1d effective1y knockdown target gene in HepG2 ce11s.Inhibition of LDHA expression evident1y resu1ted in inhibition of HepG2 pro1iferation and migration.

hepatoce11u1ar carcinoma；1actate dehydrogenase-A；RNA interference

R735.7

A

1671-7783（2015）06-0487-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150180

2015-08-14 ［編輯］劉星星

司素華（1979—），男，江蘇如皋人，主管檢驗(yàn)師，主要從事腫瘤細(xì)胞生物學(xué)的研究。