翟晚?xiàng)鳎?彭，賀劍鋒，高利生

（公安部物證鑒定中心，北京 100038）

·論 著·

超高效液相色譜檢測(cè)黃樟素方法研究

翟晚?xiàng)鳎?彭，賀劍鋒，高利生

（公安部物證鑒定中心，北京 100038）

本文建立了檢測(cè)黃樟素的超高效液相色譜定量分析方法。將黃樟素樣本以甲醇稀釋，1500 r/min振蕩10 min或超聲3 min，以0.22 μm濾膜過濾后供儀器分析，對(duì)流動(dòng)相梯度程序進(jìn)行了考察和優(yōu)化。采用島津ODS-SP型（250 mm×4.6 mm， 5 μm）色譜柱，以高純水（A）-乙腈（B）體系作為流動(dòng)相，梯度程序?yàn)?0%B（0.01 min）～66.5%B（13 min）～95%B（13.01 min）～95%B（20 min），流速1 mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量5μ L，主定量波長(zhǎng)210 nm，輔定量波長(zhǎng)235 nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著有機(jī)相初始濃度的升高，黃樟素色譜峰的理論塔板數(shù)減小、峰高增加、保留時(shí)間縮短；隨著梯度陡度的增加，黃樟素色譜峰的理論塔板數(shù)和峰高均增加、保留時(shí)間縮短。經(jīng)過方法優(yōu)化，所測(cè)黃樟素樣品色譜行為良好，在2～200 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，外標(biāo)工作曲線為Y=1833.39X+5675.32，相關(guān)系數(shù)高于0.9999。以信噪比S/N＞3計(jì)算，檢測(cè)限為0.1 μg/mL。日內(nèi)精密度≤1.26%，日間精密度≤2.08%。加標(biāo)回收率在98.21%～102.18%之間，RSD為0.35%～0.96%。在室溫放置96 h、-20℃放置15 d以及在室溫和-20℃反復(fù)凍融3次的條件下均可保持穩(wěn)定。該方法快速、簡(jiǎn)便、高效、可靠。

超高效液相色譜；黃樟素；定量分析

黃樟素，又名黃樟油素、薩富羅爾、黃樟腦、黃樟醚、丙烯基二氧甲苯酯，化學(xué)名為1-烯丙基-3，4-二氧亞甲基苯，化學(xué)式C10H10O2，結(jié)構(gòu)式見圖1，相對(duì)分子質(zhì)量162.19，CAS號(hào)94-59-7，是無色或淡黃色液體，具有茴香味或樟木味。它是合成苯環(huán)上具有亞甲二氧基環(huán)的苯丙胺類興奮劑（如MDMA、MDA）的原料，也可用于香料、添加劑、殺蟲劑、防腐劑等化工生產(chǎn)［1］。黃樟素天然存在于黃樟油、大葉樟油等天然芳香油中，可從這些天然芳香油中或黃樟樹的根、葉莖中分離或萃取，再經(jīng)蒸餾精制得到［1，2］。黃樟素可直接用溴化氫進(jìn)行溴化反應(yīng)，得到的中間體再進(jìn)一步用來合成MDMA、MDA。

圖 1 黃樟素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of safrole

目前，黃樟素分析方法主要有氣相色譜法［3，4］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［5，6］和液相色譜法［7］。由于實(shí)際辦案中遇到的檢材多為液態(tài)，液相色譜法與氣相色譜法相比，在定量時(shí)無需萃取步驟，可大幅提高準(zhǔn)確度和工作效率，因此更適合作為定量檢測(cè)的手段。超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography， UPLC）以高效液相色法（high performance liquid chromatography， HPLC）的理論及原理為基礎(chǔ)，通過減小填料顆粒粒徑、降低系統(tǒng)體積及應(yīng)用快速檢測(cè)手段等方式增加了分析通量、靈敏度及分離度，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。本研究以超高效液相色譜為檢測(cè)手段，探索黃樟素的定量分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀（日本島津公司Prominenece UFLC，包括LC-20AD XR型泵、SIL-20AC XR型進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器、CTO-20AC型柱溫箱、數(shù)據(jù)處理軟件LC solution）；十萬分之一電子分析天平（瑞典METTLER公司）；渦旋混合器（EYELA型，日本EYELA公司）；超聲振蕩器（KQ3200型，昆山市超聲儀器有限公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國SIGMA公司）；純水制備系統(tǒng)（Synergy UV型，美國Millipore公司）；移液槍（100～1000 μL，德國Eppendorf公司）；瓶口移液器（標(biāo)稱容量10 mL，德國Brand公司）。

甲醇（前處理使用分析純、液相色譜流動(dòng)相使用色譜純，分別購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和美國Fluka公司）；乙腈購自美國Fisher Scientific公司；黃樟素標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Cerilliant公司；黃樟素樣品來源于案件中收繳。

1.2 色譜質(zhì)譜條件

液相色譜條件：采用島津ODS-SP型（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；采用梯度洗脫方式，以高純水（A）-乙腈（B）體系作為流動(dòng)相，梯度程序?yàn)?0%B（0.01 min）～66.5%B（13 min）～95%B（13.01 min）～95%B（20 min），流速1 mL/min，柱溫40℃；紫外檢測(cè)器設(shè)定210 nm為主定量波長(zhǎng)、235 nm為輔定量波長(zhǎng)；進(jìn)樣量5μ L。

1.3 樣品前處理方法

取適量黃樟素樣本，以適量甲醇稀釋，1500 r/ min振蕩10 min或超聲3 min，以0.22μm濾膜過濾后取1.5 mL裝瓶供儀器分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

實(shí)驗(yàn)中對(duì)黃樟素的溶解性進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，一方面，黃樟素易溶于甲醇、乙醚、苯、氯仿等有機(jī)溶劑，難溶于水和甘油。而另一方面，雖然黃樟素易溶于乙腈，但由于方法最終確定的流動(dòng)相是高純水和乙腈，以乙腈稀釋時(shí)會(huì)產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，峰形差。采用甲醇提取時(shí)溶解性佳、峰形好，且甲醇的毒性相對(duì)較小，故選擇甲醇作為提取溶劑。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

為實(shí)現(xiàn)對(duì)不同波長(zhǎng)下色譜響應(yīng)的考察，采用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）對(duì)黃樟素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了分析，獲取的保留時(shí)間-吸收波長(zhǎng)-吸光度三維等高線視圖和光譜圖見圖2、圖3?？紤]到低檢測(cè)波長(zhǎng)易受到流動(dòng)相本底干擾，可能對(duì)基線、色譜峰形和峰面積造成不利影響，在參考了信噪比數(shù)據(jù)之后，最終選擇210 nm作為主定量波長(zhǎng)，235 nm作為輔定量波長(zhǎng)。

2.3 色譜條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中對(duì)黃樟素的液相色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。由于黃樟素極性較弱，故選擇反相色譜、C18色譜柱，見圖4～圖7，隨有機(jī)相初始濃度的升高，黃樟素色譜峰的理論塔板數(shù)減小、峰高增加、保留時(shí)間縮短；隨梯度陡度的增加，黃樟素色譜峰的理論塔板數(shù)和峰高均增加、保留時(shí)間縮短。綜合考慮柱效高、響應(yīng)強(qiáng)、分析時(shí)間短、抗干擾性強(qiáng)等因素，有機(jī)相占比應(yīng)較高，而梯度陡度應(yīng)較平緩（主要是為確保目標(biāo)物與雜質(zhì)的分離度），最終確定的梯度程序?yàn)?0%（0.01 min）～66.5%（13 min）～95%（13.01 min）～95%（20 min），流速1 mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量5μ L。優(yōu)化條件下的黃樟素標(biāo)準(zhǔn)品（20μ g/mL）的色譜圖見圖8。

圖 2 黃樟素保留時(shí)間-吸收波長(zhǎng)-吸光度三維等高線視圖Fig.2 3D contour view of safrole's wavelength-absorbance retention time-absorption

圖 3 黃樟素的光譜圖Fig.3 Spectrum of safrole

圖 4 有機(jī)相初始濃度對(duì)理論塔板數(shù)的影響Fig.4 Effect of organic phase's initial content on theoretical plate number

圖 5 有機(jī)相初始濃度陡度對(duì)峰高的影響Fig.5 Effect of organic phase's initial content on peak height

圖 6 梯度陡度對(duì)理論塔板數(shù)的影響Fig.6 Effect of gradient steepness on theoretical plate number

圖 7 梯度陡度對(duì)峰高的影響Fig.7 Effect of gradient steepness on peak height

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍和工作曲線結(jié)合辦案實(shí)際需要，實(shí)驗(yàn)考察了黃樟素在2～200 μ g/mL濃度范圍內(nèi)的線性情況，并建立了外標(biāo)工作曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，目標(biāo)物在2～200 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，工作曲線為Y=1833.39X+5675.32，線性相關(guān)系數(shù)高于0.9999。以信噪比S/N＞3計(jì)算，檢測(cè)限為0.1 μg/mL。

2.4.2 精密度測(cè)定制備濃度為200.0、20.0 μg/mL、2.0 μg/mL的混標(biāo)溶液，每日進(jìn)樣6次，以外標(biāo)工作曲線計(jì)算含量，得到日內(nèi)精密度（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD）；連續(xù)測(cè)量6 d，以外標(biāo)工作曲線計(jì)算含量，得到日間精密度（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD）。結(jié)果表明，黃樟素日內(nèi)精密度均小于1.26%，日間精密度均小于2.08%。

2.4.3 加標(biāo)回收率測(cè)定為驗(yàn)證所建立的方法是否存在系統(tǒng)性偏差，實(shí)驗(yàn)中對(duì)加標(biāo)回收率進(jìn)行了考察。分別選擇3.2%、15.3%兩種含量的樣品，各精密稱取3份，分別加入約為已知含量的50%、100%的標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇稀釋，振蕩混勻后經(jīng)液相色譜分析，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果表明，加標(biāo)回收率98.21%～102.18%，RSD 0.35%～0.96%，方法不存在系統(tǒng)性偏差。

圖 8 黃樟素標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC色譜圖Fig.8 UPLC chromatogram of safrole standard

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取等量的20.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液18份，其中6份于室溫下分別放置3、6、12、24、48、96 h，分別進(jìn)樣，黃樟素色譜峰面積RSD 0.35%～1.02%；3份于- 20℃冰箱中分別放置5、10、15 d，峰面積RSD 0.58%～1.67%；另外3份于- 20℃冰凍和恢復(fù)至室溫條件下反復(fù)3次，峰面積RSD 0.26%～0.93%。結(jié)果表明，黃樟素在上述條件下均可保持穩(wěn)定。

2.5 案例應(yīng)用

某案件中繳獲1桶未知成分淺黃色液體。振蕩混勻后平行取兩個(gè)各50μL的樣品，分別以20 mL甲醇稀釋，采用前文確定的樣品處理方法和優(yōu)化的色譜條件對(duì)其進(jìn)行分析，所得液相色譜圖見圖9。樣品保留時(shí)間為10.95 min，與黃樟素標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰保留時(shí)間相差不超過1%。經(jīng)計(jì)算，黃樟素含量平均值為7.08%。同時(shí)，經(jīng)GC-MS分析，確證該目標(biāo)物為黃樟素。

結(jié)果表明，使用本文建立的方法，黃樟素色譜行為良好，方法快速、簡(jiǎn)便、高效、可靠，適于推廣應(yīng)用于公安辦案中黃樟素樣品的定量分析。

圖 9 某黃樟素液體樣本的超高效液相色譜圖Fig.9 UPLC chromatogram of safrole liquid sample

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Determination of Safrole by Ultra Performance Liquid Chromatography

ZHAI Wanfeng， LI Peng， HE Jianfeng， GAO Lisheng
（Institute of Forensic Science， Ministry of Public Security， Beijing 100038， China）

To establish a quantitative method for determination of safrole by ultra performance liquid chromatography（UPLC）， safrole samples were diluted by methanol， oscillated with the speed of 1500r/min for 10 minutes or ultrasoundassisted oscillated for 3 minutes， then fi ltered the solution with 0.22 μm membrane and drew 1.5 mL for automatic injection. The separation was optimized and performed on a Shimadzu ODS-SP column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase was pure water （A）-acetonitrile （B） and the mode of elution was gradient. The initial condition was 60%B， and the gradient steepness of organic phase was 0.5%/min between 0～13 min， then the organic phase's content was raised to 95% immediately and held on for 7 minutes. The complete gradient elution procedure was 60%B （0.01 min）～66.5% B （13 min）～95%B （13.01 min）～95% B （20 min）. Flow rate was set as 1 mL/min， column temperature was set as 40℃ and injection volume was set as 5 μL. The primary quantitative wavelength of UV detector was set as 210 nm and the auxiliary one was set as 235 nm. When the organic phase's initial content increased， theoretical plate number and retention time decreased， but peak height increased. When the gradient steepness increased， theoretical plate number and peak height increased， but retention time decreased. Using the optimized method， good linearity was achieved over the range of 2～200 μg/mL. External standard working curve Y=1833.39X+5675.32， r2＞0.9999. Limit of detection was 0.1 μg/mL under the condition of S/N＞3. The precision was good with the intra-day RSDs less than 1.26% and inter-day RSDs less than 2.08%. The accuracy was also satisfi ed. The recovery rates were in the range of 98.21% to 102.18%， with RSDs between 0.35% and 0.96%. The test samples showed good stability under room temperature， freeze condition and three cycles of freeze-thaw condition. The RSDs of peak area of 6 samples placed at room temperature for 3， 6， 12， 24， 48， 96 hours were between 0.35% and 1.02%. The RSDs of 3 samples placed in refrigerator at -20℃ for 5， 10， 15 days were between 0.58% and 1.67%. The RSDs of 3 samples which were frozen and thawed three times were between 0.26% and 0.93%. The method was proved to be good when applied to case samples. For example， once we received an unknown sample seized by police， and then used the extraction and chromatography methods to analyze the sample， the major analyte's retention time was consistent with safrole standard and the quantitative result was 7.08%. This method was rapid， simple， effective and suited for quantitative determination of safrole.

ultra performance liquid chromatography ； safrole； quantitative analysis

DF795.1

A

1008-3650（2015）03-0204-04

2014-12-15

格式： 翟晚?xiàng)鳎?李彭， 賀劍鋒， 等. 超高效液相色譜檢測(cè)黃樟素方法研究 ［J］. 刑事技術(shù)， 2015，40（3）：204-207.

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（No. 2013JBYY002）

翟晚?xiàng)鳎?987—），女，山東曲阜人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向?yàn)槎酒窓z驗(yàn)。 E-mail： 1004503680@qq.com

10.16467/j.1008-3650.2015.03.008