張凱麗，翁瑞旋，李 雙，王 赟，張桂花，李玉鵬*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院/云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203）

云南球花石斛提取物體外自由基清除活性研究

張凱麗1，2，翁瑞旋1，李 雙1，王 赟1，張桂花1，李玉鵬1*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院/云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203）

采用DPPH自由基清除法對(duì)云南球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum） 95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇5種提取物的體外自由基的清除作用進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，球花石斛乙酸乙酯粗提物的自由基清除效果最顯著，其IC50為0.11 mg/mL。球花石斛提取物在抗氧化方面有一定的應(yīng)用價(jià)值，該研究工作對(duì)球花石斛的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

球花石斛；藥用植物；自由基清除活性

石斛是常用名貴中藥材，為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium Sw.）多種植物的新鮮或干燥莖的統(tǒng)稱。在中國(guó)76種石斛屬植物中有30多種作藥用。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，石斛被列為上品，具有滋陰清熱、生津益胃、潤(rùn)肺止咳、明目強(qiáng)身等功效［1］。球花石斛［2］（Dendrobium thyrsiflorum Rchb.f）為蘭科石斛屬（Dendrobium Sw）多年生草本植物，附生于海拔1 100～1 800 m的山地林中樹(shù)干上。分布于云南南部至西南部，印度東北部、緬甸、泰國(guó)、老撾、越南亦產(chǎn)。為滿足石斛商品市場(chǎng)的需要，于1998年被收入江蘇省藥材標(biāo)準(zhǔn)。從球花石斛分得聯(lián)芐、菲類、芴酮、香豆素和多糖等類型的化學(xué)成分［3～11］。為了開(kāi)發(fā)和應(yīng)用該藥用植物，尋找到該植物藥用物質(zhì)基礎(chǔ)，在對(duì)云南產(chǎn)束花石斛體外抗氧化活性研究的基礎(chǔ)上［12］，筆者對(duì)云南產(chǎn)球花石斛體外自由基清除活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

儀器：722 s型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化），F(xiàn)A 2004型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。試劑：DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼自由基，Sigma-Fluka公司產(chǎn)品）；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)貴州生物試劑公司）；95%乙醇（分析純，天津化學(xué)試劑有限公司），其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 植物來(lái)源

球花石斛于2013年5月15日采自云南思茅，標(biāo)本保存于昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 提取與分離

球花石斛0.30 kg，用95%乙醇提取5次，減壓回收至無(wú)乙醇味，得乙醇提取物41.0 g。乙醇提取物用水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇進(jìn)行萃取，減壓濃縮后分別得到石油醚5.0 g、乙酸乙酯5.5 g、正丁醇9.5 g、甲醇13.0 g 5個(gè)部分，乙醇提取物和萃取的各部分分別取20 mg進(jìn)行體外自由基清除活性測(cè)試。

1.4 自由基清除活性測(cè)定

1.4.1 DPPH液的配制

準(zhǔn)確稱取DPPH試劑25 mg，用95%分析純的乙醇溶解，并定量轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為100 mg/L的DPPH儲(chǔ)備液，置于冰箱中冷藏備用。

1.4.2 樣品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取待測(cè)試樣品20 mg，溶解在分析純的乙醇中，并轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用乙醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為200 mg/L的樣品溶液，置于冰箱中冷藏備用。

1.4.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取蘆丁2.5 mg，溶解在分析純的乙醇中，并轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用乙醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為25 mg/L的樣品溶液，置于冰箱中冷藏。

1.4.4 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

準(zhǔn)確量取1.2 mL DPPH液，加入2.8 mL 95%乙醇溶液，混勻，在λ=520 nm測(cè)吸光度作為Ac值，自由基清除率為零。分別準(zhǔn)確量取各樣品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL，加入1.2 mL DPPH液及2.6 mL、2.4 mL、2.2 mL、2.0 mL、1.8 mL、1.6 mL、1.4 mL、1.2 mL的95%乙醇溶液混合均勻，在λ=520 nm測(cè)吸光度作為Ai值。另外分別準(zhǔn)確量取各樣品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL，加入3.8 mL、3.6 mL、3.4 mL、3.2 mL、3.0 mL、2.8 mL、2.6 mL、2.4 mL的95%乙醇溶液后混合均勻，在λ=520 nm測(cè)吸光度作為空白校正Aj值。以蘆丁作為陽(yáng)性對(duì)照。按下式計(jì)算自由基清除率K值。

K（%）＝［1-（Ai-Aj）/Ac］×100

2 結(jié)果與分析

表1結(jié)果顯示，球花石斛乙醇提取物及其不同溶劑萃取部分對(duì)DPPH自由基的清除率隨著量的加大有逐步增強(qiáng)的趨勢(shì)；但不同提取物自由基清除作用差別較大，乙酸乙酯萃取部分相對(duì)其它提取物清除率略高。

從表2中可看出，球花石斛的乙醇粗提物、乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH自由基清除活性IC50值比其它提取物的IC50值小，表現(xiàn)了較強(qiáng)的自由基清除活性，但比蘆丁弱。

表1 球花石斛提取物DPPH自由基清除率

表2 球花石斛提取物清除DPPH自由基活性的IC50值

3 討論

研究表明，球花石斛的乙酸乙酯提取物活性較好，自由基清除IC50為0.11 mg/mL，進(jìn)一步研究該部分化學(xué)成分，可能得到自由基清除活性較強(qiáng)的化合物。筆者首次用DPPH自由基清除活性研究方法對(duì)球花石斛不同溶劑提取物自由基清除活性進(jìn)行研究，該研究為其研究開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。在此研究基礎(chǔ)上，筆者將進(jìn)一步采用新的藥理活性篩選方法跟蹤，分離得到新的活性成分。

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1985.

［2］陳心啟，吉占和，羅毅波.中國(guó)野生蘭科植物彩色圖鑒［M］.北京：科學(xué)出版社，1998，

［3］張光濃，張朝鳳，王崢濤，等.球花石斛的化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)天然藥物，2004，2（2）：78-81.

［4］張光濃，張朝鳳，羅英，等.球花石斛的化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)天然藥物，2005，3（5）：287-290.

［5］Wrigleyt C.Ayapin.scopoletin and 6，7-dimethoxy coumarin from Dendrobium thyrsiflorum［J］.Nature，1960，188：1108.

［6］Liu YY，Yu H，Chen YG.CHEMICALCONSTITUENTSOFDendrobiumthyrsiflorum［J］.Chemistry of Natural Compounds，2011，47（2）：275-276.

［7］Zhang GN，Zhong LY，Annie Bligh SW，et al.Bi-bicyclic and bi-tricyclic compounds from Dendrobium thyrsiflorum［J］.Phytochemistry，2005，66：1113-1120.

［8］鄭艷，徐珞珊，王崢濤，等.球花石斛莖中香豆素類成分的定位與相對(duì)定量［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（3）：236-240.

［9］鄭艷，徐珞珊，王崢濤，等.香豆素類成分在球花石斛根中的分布和相對(duì)含量［J］.激光生物學(xué)報(bào)，2005，14（2）：87-90.

［10］張光濃，張勉，史永鋒，等.HPLC-UV測(cè)定球花石斛中濱蒿內(nèi)酯和澤蘭內(nèi)酯含量［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2006，41（5）：388-391.

［11］宋寧，陸瑛，邱明華.球花石斛多糖免疫調(diào)節(jié)作用的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2006，18：445-448.

［12］文小玲，俆俊駒，陳麗君，等.云南藥用植物束花石斛提取物體外抗氧化活性研究［J］.昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35：4-5.

2014-07-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21202066）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃基金資助項(xiàng)目（2012FB156）；云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（2013C247）；云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放研究基金資助項(xiàng)目（2013G009）。

張凱麗（1991-），女，碩士研究生，主要從事天然藥物化學(xué)成分和藥理活性研究。

*為通訊作者：李玉鵬，男，碩士研究生導(dǎo)師，副教授，主要從事天然藥物化學(xué)成分和藥理活性研究，E-mail：liyupeng26@126.com。