李亞男, 車曉倩, 王宏偉, 李 茹, 孫慧斌

(山東 青島 266100: 1.青島大學附屬醫(yī)院東區(qū)口腔科; 2.青島大學附屬醫(yī)院東區(qū)檢驗科;3.中國科學院青島生物能源與過程研究所公共實驗室)

機械預備與半導體激光對糞腸球菌殺菌作用的體外研究

李亞男1, 車曉倩1, 王宏偉2, 李 茹3, 孫慧斌1

(山東 青島 266100: 1.青島大學附屬醫(yī)院東區(qū)口腔科; 2.青島大學附屬醫(yī)院東區(qū)檢驗科;3.中國科學院青島生物能源與過程研究所公共實驗室)

目的: 評價半導體激光對感染根管內(nèi)糞腸球菌的殺菌效果。方法：成功建立糞腸球菌感染人單根管恒牙模型50個， 用ProTaper F3銼預備根管后隨機分為5組(n=10)，A組: 空白對照，不照射激光；另4組分別用不同功率、時間半導體激光照射根管內(nèi)壁, B組：1.0 W，10 s；C組：1.0 W，20 s；D組：2.0 W，10 s；E組：2.0 W，20 s。各組標本均于處理前、后在根管內(nèi)壁表面取樣并進行細菌培養(yǎng)計數(shù)；然后再分別用F4、F5銼依次預備并收集兩種深度的牙本質碎屑，經(jīng)厭氧培養(yǎng)后采用麥氏比濁法進行菌落計數(shù)。結果：①各組處理后的根管內(nèi)壁細菌量均較處理前下降(P<0.05)，各激光組細菌清除率均高于對照組(P<0.05)，而各激光組之間兩兩相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); ②各激光組均能使兩種深度牙本質中的細菌量明顯減少(P<0.05)；其中照射10 s 時, 2.0 W比1.0 W的殺菌效果好(P<0.05)，而照射20 s時, 不同功率的殺菌效果無顯著差異(P>0.05)；用1.0 W時，照射20 s比10 s的殺菌效果好(P<0.05)，而用2.0 W時，照射10、20 s的殺菌效果無差異(P>0.05)。結論：半導體激光對根管內(nèi)壁及深層牙本質的糞腸球菌均有殺菌作用，其對牙本質深層的殺菌效果隨著照射時間延長、功率增大而增強。

糞腸球菌; 半導體激光; 根管治療; 殺菌率

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.08.006

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(8):483]

根管治療術是治療牙髓病和根尖周病的有效方法，但即使經(jīng)過完善的根管治療，患牙仍存在4%～15%的失敗率[1]，特別是行根管再治療的患牙，其失敗率更高[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，在難治性和繼發(fā)性感染的根管中，糞腸球菌是最常分離到的細菌種類，其檢出率可達77%[3]，是目前評價各種感染清除措施時最常用的目標菌種。

另有研究表明，糞腸球菌主要以生物膜的形式穩(wěn)定存在于患牙的根管中[4-5]，并能進入牙本質小管不斷釋放致病因子，是根管治療失敗的主要原因。由于根管系統(tǒng)的復雜性，傳統(tǒng)的機械預備及化學消毒均無法徹底清除根管內(nèi)的糞腸球菌。因此，尋找一種即安全，又能有效殺滅根管內(nèi)細菌(特別是糞腸球菌)的滅菌方法，對提高根管治療術的效果尤為重要。

近年來，關于激光對糞腸球菌的殺菌作用已成為研究熱點，激光產(chǎn)生的瞬時高溫足以殺滅根管內(nèi)的細菌，并能清除細菌內(nèi)毒素等代謝產(chǎn)物，尤其對側支根管和彎曲根管也有滅菌作用。鑒于半導體二極管激光970 μm的波長所產(chǎn)生的能量能充分被軟組織內(nèi)的水、血紅蛋白及黑色素所吸收，適合應用于口腔治療。本實驗通過建立穩(wěn)定的糞腸球菌感染根管模型，評價半導體二極管激光處理對根管內(nèi)糞腸球菌的殺菌效果，以期為臨床推廣應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

糞腸球菌標準菌株凍干粉(ATCC29212，美國)；機用ProTaper鎳鈦銼(登士柏，美國)；激光治療儀(西諾德，德國) ；掃描電鏡(S- 4800，Hitachi，日本)； CO2培養(yǎng)箱(DY- 2，浙江義烏冷凍機總廠)；CrystalspecTM比濁儀(Becton Dickinson, 美國)。

1.2 標本制備

1.2.1離體牙的選擇和預處理

臨床收集新鮮拔除的人單根管恒牙54個(均根尖孔發(fā)育完全、未行根管治療、 無根裂等)，置于52.5 g/L NaClO中浸泡消毒24 h后，用慢速切鋸截去牙冠，并分別截取其10 mm長的牙根。用ProTaper鎳鈦銼將各牙根的根管逐步擴大到F3(ISO標準)后，170 g/L EDTA 和10 g/L NaCIO交替超聲震蕩清洗根管，以去除玷污層。預備完成的所有樣本經(jīng)高溫高壓滅菌后，隨機抽取2個樣本，用1 mL無菌PBS溶液沖洗根管，并收集沖洗液進行接種培養(yǎng)；確定無細菌生長后用于感染根管模型的建立。

1.2.2 感染根管模型的建立

本實驗感染根管模型建立參照郭惠杰等[6]報道的方法：將糞腸球菌標準株凍干粉常規(guī)復蘇后劃線接種于腦-心浸液(BHI)瓊脂培養(yǎng)皿，置于37 ℃、 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h后，挑取數(shù)個單菌落轉至1 mL BHI液體培養(yǎng)基中，增菌培養(yǎng)48 h。然后取20 μL菌懸液分別注入上述各根管后，將牙根放入含1 mL BHI液體培養(yǎng)基的無菌EP管中(每管1個)，并置于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)；每3 d更換1次菌懸液，連續(xù)培養(yǎng)4周。培養(yǎng)結束后隨機抽取2個樣本，分別沿頰舌向劈開并放入25 mL/L戊二醛中固定48 h后，依次放入300、500、700、800、900、1 000 mL/L乙醇中各15 min 進行逐級脫水；然后常規(guī)干燥、噴金，用掃描電鏡(×5 000～10 000)對各樣本的根管內(nèi)壁進行觀察。確認根管內(nèi)壁及牙本質小管中糞腸球菌生長(模型建立成功)后用于以下實驗。

1.3 實驗分組和處理

將上述50個成功建立感染根管模型的樣本隨機分為A、B、C、D、E 5組(n=10)，其中A組用ProTaper F3銼再次預備，作為空白對照組；其余4組按以下方法進行激光處理，B組: 1.0 W激光照射2次; C組: 1.0 W激光照射4次; D組: 2.0 W激光照射2次; E組: 2.0 W激光照射4次；每次照射5 s，間隔5 s。各激光照射組在每次照射時先將光纖置于根尖孔上方0.5～1 mm處，然后以S形的走向從下往上提拉并逐步退出，不要長時間指向某一點。

1.4 殺菌效果的觀察

1.4.1 感染根管內(nèi)壁細菌量的評估

分別于單純機械預備(對照組)和激光處理(實驗組)前、后取各組感染根管樣本，用#30無菌紙尖干燥根管，分別在各根管內(nèi)注入PBS緩沖液，并將#30無菌紙尖插入根管至根尖孔處(保持紙尖與根管壁相接觸)；停留1 min后取出紙尖并立即放入裝有PBS溶液的EP管中，用小型振蕩器振蕩1 min；然后從每個EP管中各吸取5 μL液體，10倍系列稀釋后接種培養(yǎng)48 h，分別計算各組的菌落數(shù)和細菌清除率。

1.4.2 牙本質小管內(nèi)殺菌效果的評估

取上述處理取樣后的根管標本，分別用ProTaper F4、F5銼收集2個不同深度的牙本質碎屑(牙本質壁下100、200 μm)；然后將碎屑轉至裝有BHI液體培養(yǎng)基的EP管中進行厭氧培養(yǎng)，并于培養(yǎng)24 h后采用麥氏比濁法進行菌落計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 糞腸球菌感染根管模型的建立

根管樣本經(jīng)滅菌后抽樣檢查發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)皿上均未見細菌生長。根管內(nèi)注入糞腸球菌菌懸液培養(yǎng)4周后，隨機抽取2個樣本用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，根管內(nèi)壁有糞腸球菌生物膜形成(圖1)，并可見糞腸球菌侵入牙本質小管內(nèi)定植生長(圖2)；提示糞腸球菌感染根管模型建立成功。

圖2 糞腸球菌定植于牙本質小管(SEM, ×10 000)

2.2 機械預備和激光對感染根管內(nèi)壁細菌的清除作用

處理前各組感染根管內(nèi)壁的原始細菌量相比，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；經(jīng)機械處理(對照組)和激光處理后(實驗組)，各組的細菌量均較其處理前顯著下降(P<0.05)，其中A組的細菌清除率為39.45%， B、C、D、E組的細菌清除率分別為92.01%、93.18%、92.64%、92.94%；各激光組分別與對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)，而各激光組之間兩兩相比，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。提示機械預備和激光處理對根管內(nèi)壁的糞腸球菌均有清除作用，且激光的除菌效果更好，但不同能量不同時間激光照射對根管內(nèi)壁表面的殺菌效果無差異。

表1 各組根管內(nèi)壁糞腸球菌菌落數(shù)的比較

*與同組內(nèi)處理前相比P<0.05；不同字母組間兩兩相比P<0.05

2.3 機械預備和激光對牙本質小管內(nèi)細菌的清除作用

各組兩種深度部位的牙本質碎屑經(jīng)厭氧培養(yǎng)后，麥氏比濁法進行菌落計數(shù)顯示：與對照組相比，不同功率的激光照射不同時間后，均能使兩種深度牙本質中的糞腸球菌量明顯減少(P<0.05)；其中照射10 s時, 2.0 W比1.0 W的殺菌效果好(P<0.05)，而照射20 s時, 不同功率的殺菌效果無差異(P>0.05)；用1.0 W時，照射20 s比10 s的殺菌效果好(P<0.05)，而用2.0 W時，照射10、20 s的殺菌效果無差異(P>0.05)(表2)。以上結果提示，半導體激光有一定的穿透能力，能殺滅侵入牙本質小管內(nèi)的細菌，其殺菌效果在一定范圍內(nèi)隨著時間延長、功率增大而增強。

表2 各組感染牙本質小管內(nèi)糞 腸球菌菌落數(shù)比較

組間相比不同字母P<0.05; MCF為比濁麥氏濃度單位

3 討論

根管系統(tǒng)的復雜性決定了根管消毒的重要性，細菌感染是造成根管治療失敗的主要原因。糞腸球菌作為根管治療后可能分離到的最多的細菌[7-8]，其存在與再治療根管的臨床癥狀或體征密切相關[9]。糞腸球菌是G+兼性厭氧菌，可侵入到牙本質小管深層，同時還能在根尖部通過形成生物膜[10]而抵制抗菌劑的作用、增強細菌的致病能力及耐藥性[11],并使其在寡能量、低體積分數(shù)的次氯酸鈉及弱堿性環(huán)境下均能生長[12]。因此，糞腸球菌可以在常規(guī)沖洗劑及診間氫氧化鈣封藥中存活下來，從而造成頑固性或繼發(fā)性根管內(nèi)感染。

常規(guī)機械根管預備完成后，根管內(nèi)的壞死牙髓組織和根管內(nèi)壁附著的感染物已被大部分去除，但牙本質小管深層和根管側支等器械和沖洗液達不到的部位仍有殘余的細菌、毒素存在。有研究發(fā)現(xiàn)，通過機械的方法預備后雖可使根管內(nèi)的糞腸球菌總量減少，但不能完全去除，而且不同的預備技術和不同器械清除細菌的能力無顯著性差異[13]。所有器械均不能完全去除根管內(nèi)碎屑和玷污層，尤其是根尖1/3[14]。因此，近年來我們將激光照射引入根管消毒中，以期減少糞腸球菌的數(shù)量，提高根管治療的成功率。

目前，激光已廣泛應用于口腔軟組織外科手術、黏膜病及牙周抗炎治療、牙體牙髓治療等各個領域。激光輔助牙體牙髓治療主要包括齲病的預防、診斷，去齲備洞，根管治療，牙漂白及牙本質過敏等。激光照射產(chǎn)生的瞬時高溫能氣化根管壁殘存的碎屑和玷污層，并可通過熔融和封閉牙本質小管而降低牙本質通透性；從而有利于根充材料更緊密接觸根管壁，使根管充填更完善、降低根尖滲漏的發(fā)生率，防止炎癥復發(fā)。另外，激光還能改善尖周組織的血液循環(huán)，減輕炎癥的滲出速度及程度，并使局部組織中的5-羥色胺含量減少，有明顯的消炎止痛作用。

本實驗在建立糞腸球菌感染根管模型的基礎上，觀察不同功率的半導體激光照射不同時間后，對根管內(nèi)糞腸球菌的清除效果，并與單純機械預備的根管作對比。結果顯示，機械預備和激光處理均可使根管內(nèi)壁的糞腸球菌量明顯下降，各激光照射組與單純機械預備相比殺菌效果更為顯著; 進一步證實了單純機械預備不能完全清除根管內(nèi)感染，和其他學者的研究結果一致[15-17]。但各激光組之間相比，無論是增大激光功率，還是延長激光照射時間，均不能顯著提高其對根管內(nèi)壁表面糞腸球菌的殺菌率。

本實驗發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌可侵入牙本質小管深層定植生長，故采用F4、F5鎳鈦銼收集不同深度的牙本質碎屑，以觀察各組對不同深度牙本質小管中糞腸球的清除效果?？紤]鎳鈦銼錐度的可變性，認為收集的碎屑大致來自根管壁牙本質100、200 μm的深度。兩種深度牙本質碎屑內(nèi)的糞腸球菌量均較對照組明顯減少，說明激光能穿透牙本質而起殺菌作用，并且與時間、功率呈正相關；但當時間或功率超過一定程度后，其中一種因素的變化將不能顯著提高殺菌效果。本實驗中時間和功率最大值組(20 s，2.0 W)也不能完全殺滅牙本質小管深層的細菌，且殺菌效果不如根管內(nèi)壁理想，這可能與激光產(chǎn)生的瞬時高熱使牙本質熔融后封閉了牙本質小管，從而導致牙本質通透性降低有關。

綜上所述，半導體激光能夠有效殺滅感染根管內(nèi)壁、牙本質小管內(nèi)的糞腸球菌，且操作簡便、高效。雖然隨著激光功率的增大、照射時間的延長對牙本質深層的殺菌效果更好，但其瞬時產(chǎn)生的能量也越大，有可能對根尖周組織產(chǎn)生熱損傷；故建議臨床上應在達到殺菌效果的基礎上選取較小功率的激光進行多次照射。

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Antibacterial efficacy of mechanical preparation and diode laser onenterococcusfaecalisin vitro

LI Ya- nan*, CHE Xiao- qian, WANG Hong- wei, LI Ru, SUN Hui- bin

(*DepartmentofStomatology,AffiliatedhospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266100,China)

AIM: To evaluate the antibacterial efficacy of mechanical preparation and diode laser onenterococcusfaecalisin infected root canals in vitro. METHODS: 50 single-rooted teeth of in vitro root canalenterococcusfaecalisinfection model were randomly divided into 5 groups (n=10). The root canals of the teeth in the control group were prepared by Protaper F3. After F3 preparation, the tooth canals in the other 4 groups were treated with diode laser for 10 s and 20 s with 1.0 W or 2.0 W, respectively. Microbiological samples were collected from the root canals before and after irrigation. The dentin debris from two depths of the root canals were collected and cultured for turbidimetric count. A one- way ANOVA with the Tukey Test was conducted for the comparisons among the groups. RESULTS: The numbers ofE.faecalisin all the groups decreased after treatment (P<0.05). The bacterieidal ration (BR) of the treatment groups was higher than that of the control(P<0.05). Between each 2 laser groups,P>0.05. The number ofE.faecalisfrom two different depths of dentin reduced in all the laser groups(P<0.05). Under the condition of 10 s jrradiation, the disinfection was more effective with 2.0 W than that with 1.0 W, and there was no significant difference between 10 s irradiation and 20 s irradiation under the conditions of 2.0 W irradiation. With 1.0 W the disinfection was more effective by 20 s irradiation than by 10 s, and with 2.0 W there was no significant difference between 10 s and 20 s irradiation. CONCLUSION: Diode laser is effective on root canal disinfection due to its effective penetration in dentins. The bactericidal effect enhances with increase of irradiation time and energy.

enterococcus faecalis; diode laser; root canal treatment; bactericidal ratio

2015-02-05

青島大學附屬醫(yī)院青年科研基金

李亞男(1988-)，女，漢族，山東濟南人。碩士生(導師：孫慧斌)

孫慧斌，E-mail：shb353.qindao@163.com

R780.2

A

1005-2593(2015)08-0483-05