金利群，郭東京，廖承軍

（1.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江杭州310014；2.浙江華康藥業(yè)股份有限公司，浙江衢州324302）

固定化葡萄糖異構(gòu)酶的研究進(jìn)展

金利群1，郭東京1，廖承軍2

（1.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江杭州310014；2.浙江華康藥業(yè)股份有限公司，浙江衢州324302）

高果糖漿作為一種天然甜味劑，被廣泛應(yīng)用于食品和飲料中。葡萄糖異構(gòu)酶是生產(chǎn)高果糖漿的關(guān)鍵酶之一，是重要的工業(yè)用酶，其固定化技術(shù)十分成熟，被認(rèn)為是固定化酶制劑的一個范本。主要介紹了葡萄糖異構(gòu)酶及其固定化方法以及葡萄糖異構(gòu)酶在高果糖漿生產(chǎn)中的應(yīng)用。

葡萄糖異構(gòu)酶；固定化技術(shù)；高果糖漿

前言

高果糖漿（High Fructose Corn Syrup，HFCS）又稱果葡糖漿，是一種以玉米淀粉為原料，經(jīng)液化、糖化、連續(xù)異構(gòu)化加工成的由葡萄糖和果糖組成的混合糖漿。高果糖漿風(fēng)味純正，口味同蜂蜜相似，作為食品、飲料等的甜味劑［1］，完全可以保證食品的營養(yǎng)和風(fēng)味，并且不會改變?nèi)藗兊娘嬍碃I養(yǎng)結(jié)構(gòu)。HFCS憑借其優(yōu)良的口感和使用方便性，正在被越來越多的廠家和消費(fèi)者了解。每年，世界上生產(chǎn)的高果糖漿就有千萬噸，人們對高果糖漿日益增長的需求和高果糖漿產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，推動了人們對葡萄糖異構(gòu)酶的深入研究和固定化葡萄糖異構(gòu)酶技術(shù)的飛速發(fā)展。

葡萄糖異構(gòu)酶（Glucose isomerase，GI），又稱木糖異構(gòu)酶，可以將葡糖糖異構(gòu)化成果糖，是食品工業(yè)中用酶法生產(chǎn)HFCS的關(guān)鍵酶。GI是水溶性的酶，固定化后具有易分離、穩(wěn)定性好、易控制等優(yōu)點(diǎn)，更適合工業(yè)上連續(xù)化生產(chǎn)高果糖漿。固定化GI是重要的工業(yè)酶制劑之一。酶的固定化方法基本分為4種：吸附、共價、包埋、和交聯(lián)。在此基礎(chǔ)上，兩種或兩種以上的方法聯(lián)合使用，又衍生出很多種。但是不同酶都有其適合的固定化方法，而這些方法中真正可以工業(yè)應(yīng)用的很少。葡萄糖異構(gòu)酶的固定化一直是固定化技術(shù)應(yīng)用中非常成功且值得借鑒的一個例子。

1　葡萄糖異構(gòu)酶簡介

1957年，Marshall和Kooi從Pseudomonas hydrophila中分離到GI，發(fā)現(xiàn)其具有將D-葡萄糖異構(gòu)化成D-果糖的能力。D-葡萄糖異構(gòu)酶/木糖異構(gòu)酶（D-木酮糖異構(gòu)酶，EC5.3.1.5），可以異構(gòu)化木糖生成木酮糖，也可以異構(gòu)化葡萄糖生成果糖，是工業(yè)上生產(chǎn)HFCS的關(guān)鍵酶，習(xí)慣上稱為葡萄糖異構(gòu)酶。

圖1　葡萄糖果糖異構(gòu)酶異構(gòu)化葡萄糖生成果糖

GI廣泛分布在自然界中，存在于許多微生物如細(xì)菌、放線菌、真菌中，至今被鑒定的產(chǎn)GI的微生物菌株就有上百種之多，尤以放線菌和細(xì)菌居多。GI的產(chǎn)生菌株一般為嗜溫菌，也有一些嗜熱菌如海棲熱袍菌屬的Thermotoga neapolitana，最適溫度分別為97℃和105℃［2］，其催化葡萄糖生成果糖的反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率在26%～59%的范圍內(nèi)。表1為商品化GI的生產(chǎn)菌株。GI依據(jù)一級結(jié)構(gòu)中N末端序列的不同分為Ⅰ型和Ⅱ型［3］。目前商業(yè)化GI大多數(shù)是Ⅰ型酶，其在60℃左右有較好的催化效率，對葡萄糖的親和力高［4］。

GI的最適pH通常為中性微偏堿性，在偏酸性的條件下，大多數(shù)GI活力很低。GI最適反應(yīng)溫度一般在60～90℃，Ⅱ型GI的熱穩(wěn)定性能優(yōu)于Ⅰ型GI［7］。在GI的活性中心有兩個金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，對催化過程有直接作用。金屬離子的結(jié)合對GI的活力和穩(wěn)定性都具有重要的影響［8］。

表1　商品酶中使用的葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)生菌［5-6］

2　葡萄糖異構(gòu)酶的固定化方法

1970年代后期固定化GI的技術(shù)已經(jīng)成熟。近年來主要是一個鞏固發(fā)展的階段。固定化GI的方法主要可以歸納為以下四種：交聯(lián)法、吸附法、共價結(jié)合法和包埋法。

2.1交聯(lián)法

交聯(lián)法是采用雙功能試劑或多功能試劑進(jìn)行酶分子（或細(xì)胞）之間的交聯(lián)，使酶分子（或細(xì)胞）和雙功能或者多功能試劑之間形成共價鍵，得到酶分子（或細(xì)胞）之間相互交聯(lián)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。1973年，日本學(xué)者Takasaki等［9］用熱固定技術(shù)固定了表達(dá)GI的Streptomyces sp.細(xì)胞。將產(chǎn)酶細(xì)胞在高溫（60～80℃）條件下短時間處理，形成由細(xì)胞內(nèi)失活的蛋白和其他組分組成的交聯(lián)基質(zhì)。這種方法使細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶在高溫下失活，減少了其對GI的分解作用。戊二醛是最為普遍的非常有效的交聯(lián)試劑。在當(dāng)今商品化GI制劑如諾維信的SweetzymeT和杰能科（杜邦公司）GensweeIGI［4］中都有應(yīng)用，這也是目前占據(jù)固定化GI市場主導(dǎo)地位的兩個產(chǎn)品。1973年，戊二醛交聯(lián)法首次描述用于S.olivaceus細(xì)胞的固定。1976年，該方法得到進(jìn)一步的改善。基本過程是用均質(zhì)化的B. coagulans細(xì)胞，與戊二醛交聯(lián)過后，交聯(lián)復(fù)合物經(jīng)過脫水，用軸向擠壓機(jī)機(jī)械塑型，擠壓成顆粒，在流化床干燥。該法可以結(jié)合使用陽離子絮凝劑如殼聚糖，多官能胺如聚乙烯亞胺，無機(jī)載體如膨潤土、高嶺土、硅藻土等，進(jìn)一步提高產(chǎn)品的質(zhì)量和性能。圖2為杰能科（杜邦公司）產(chǎn)品GensweeIGI的生產(chǎn)工藝流程，這樣制成的固定化GI極其穩(wěn)定，在60℃填充床上使用，半衰期可以超過一年。

圖2　Gensweet? IGI的生產(chǎn)工藝

國內(nèi)也有相關(guān)的研究，吳敬等［10］以產(chǎn)GI的重組構(gòu)建的大腸桿菌xylA/pET-24a/BL21（DE3）作為生產(chǎn)菌株，在初始培養(yǎng)基中添加適量的Co2+發(fā)酵生產(chǎn)GI。直接向發(fā)酵液中添加殼聚糖溶液，使菌體絮凝。絮凝后的菌體再用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，擠壓成型后烘干過夜。固定化后GI的酶活為2 579 U/g，酶活回收率達(dá)到70.5%，添加金屬離子后，在75℃下半衰期為29 h。在相同的轉(zhuǎn)化時間內(nèi)，以50%葡萄糖為底物連續(xù)操作10次，其相對轉(zhuǎn)化率為71%。該固定化方法簡單易行，固定化酶顆粒的性能優(yōu)異，可為工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

除戊二醛外，可以使用的交聯(lián)劑還有鹽溶液、檸檬酸、聚氮雜環(huán)丁烷、氰尿酰氯、二環(huán)氧化物、二異氰酸酯等。

2.2吸附法

基于吸附的固定化方法是最早發(fā)展起來的酶的固定化方法之一。幾乎是交聯(lián)法發(fā)展的同時，樹脂離子吸附GI的固定化方法也在進(jìn)行著。盡管從宿主細(xì)胞中釋放和純化游離酶的過程會產(chǎn)生額外的費(fèi)用，但是這種產(chǎn)品的物理形式具有相當(dāng)大的操作優(yōu)勢。Antri等［11］發(fā)明了一種可再生的產(chǎn)品，載體為顆粒狀的DEAE-纖維素-聚苯乙烯-氧化鈦樹脂，顆粒大小在400到800 μm范圍內(nèi)。從S.rubiginosus中分離并且高度純化的GI，靜電吸附到樹脂上獲得的固定化GI，具有高催化密度，酶活可以達(dá)到1 500 U/g。固定化酶穩(wěn)定性也比較好，在工廠操作條件下，半衰期超過1 800 h。這個方法的特點(diǎn)是固定化酶具有可再生的能力，可以通過添加游離的GI來補(bǔ)償隨著時間損失的酶。賀家明等［12］用嗜熱放線菌Streptomyces M1033制備固定化GI生產(chǎn)HFCS，該菌胞外產(chǎn)酶占90%以上，用離子交換樹脂（大孔強(qiáng)堿性苯乙烯系季氨基陰離子交換樹脂）吸附發(fā)酵液中的酶，即固定化GI，酶活力8 000～10 000 U/g（干重），酶活回收率65%～70%。辛嘉英等［13］以A12O3為載體，采用先吸附后交聯(lián)的方法固定化GI，制得了酶活性損失少和穩(wěn)定性較高的固定化GI。

2.3共價結(jié)合法

共價結(jié)合法是酶蛋白分子或細(xì)胞表面上的活性功能團(tuán)（不在酶活性位點(diǎn)或底物結(jié)合位點(diǎn)的氨基或羧基）和固體載體表面的反應(yīng)基團(tuán)之間形成化學(xué)共價鍵連接。該法的優(yōu)點(diǎn)是酶與載體結(jié)合緊密，穩(wěn)定性好，不易從載體上脫落。缺點(diǎn)是反應(yīng)條件激烈、對酶活影響較大、酶活回收率低。已建立的方法包括：重氮法、烷基化法、肽鍵法和芳基化法［14］。郭楊龍［15］，陳棟等［16］制備了可以用于GI的醛基介孔分子篩和環(huán)氧基介孔分子篩，使酶分子可以直接以共價結(jié)合的方式固定在分子篩表面，提高酶的性能。Corning玻璃廠發(fā)明了共價吸附固定的方法，使用無機(jī)載體如鋁、氧化鈦、可控制孔徑大小的玻璃等。該法用氨基硅烷表面修飾無機(jī)載體，耦合試劑如碳二亞胺介導(dǎo)共價吸附固定酶。得到的固定化酶活力有幾百個單位。這種方法又稱為類共價吸附固定法，兩性分子通過疏水相互作用把它們吸附在疏水載體表面，余下的親水部分用于結(jié)合酶。如Eaton等［17］發(fā)明的一種方法，將GI固定在多孔的MgO/Al2O3上。在復(fù)合材料中使用氧化鎂的優(yōu)點(diǎn)是可以提供GI需要的鎂離子，提供pH有利的微環(huán)境。

2.4包埋法

酶的包埋是借助化學(xué)或物理的方法（如交聯(lián)或凝膠化）將酶包埋在載體中的過程，包埋載體一般在固定化過程中形成。酶或細(xì)胞可以被物理包埋或共價連接到載體上。用交聯(lián)的基質(zhì)包埋酶或細(xì)胞是一種非常普遍的固定化方法。早期主要致力于將游離的GI固定于三乙酸纖維素纖維和膠原蛋白膜上。1976年，Gist-Brocades公司將表達(dá)GI的細(xì)胞A.missouriensis包埋在戊二醛交聯(lián)的明膠基質(zhì)中，并商品化生產(chǎn)?；具^程是：將含有GI的菌絲體與明膠混合，在40℃條件下，隨后邊攪拌邊加入到與水不混溶的溶劑中，形成凝膠顆粒，直徑1 mm。顆粒用與水可混溶的溶劑（如乙醇）洗滌。然后用2.5%戊二醛在冷水中處理，用乙醇或丙酮沖洗，干燥或是存儲于含有0.3%甲醇的NaCl溶液中。濕顆粒的活力可達(dá)6 000 U/g，連續(xù)轉(zhuǎn)化半衰期可達(dá)500 h。包埋法固定化酶或細(xì)胞可以根據(jù)不同的應(yīng)用和包埋方法比較容易地制成各種各樣的形式，可以用于分批、固定床、擴(kuò)張床等各種反應(yīng)器中。

3　固定化GI在HFCS生產(chǎn)中的應(yīng)用

HFCS作為甜味劑占據(jù)著有營養(yǎng)作用的甜味劑的70%的市場份額。甜味劑是重要的調(diào)味品之一，可改進(jìn)食品的可口性并有預(yù)防和治療作用。HFCS是一種天然的營養(yǎng)型甜味劑，風(fēng)味獨(dú)特，甜度是蔗糖的1.1倍，而卡路里含量卻更低，同時還具有不同于蔗糖的優(yōu)良食品加工性，且可用廉價的原料通過GI簡單方便的生產(chǎn)。由于傳統(tǒng)甜味劑蔗糖價格上升，憑借其諸多優(yōu)良的性能，高果糖漿正成為其替代品，成為廣大消費(fèi)者追求健康生活的首選糖源。高果糖漿被廣泛應(yīng)用于飲料、烘焙、調(diào)味品、罐頭、糖果、保健品、雪糕等生產(chǎn)中。

1967年，美國Clinton Corn Processing公司首次成功地進(jìn)行GI異構(gòu)化葡萄糖工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用。1974年，該公司首先應(yīng)用DEAE-纖維素制備的固定化GI生產(chǎn)HFCS。異構(gòu)化過程由生產(chǎn)初期的間歇法轉(zhuǎn)向用固定化酶的連續(xù)生產(chǎn)。目前，工業(yè)生產(chǎn)HFCS主要以玉米淀粉為原料通過三步酶法即淀粉經(jīng)α-淀粉酶液化，β-糖苷酶糖化，得到的葡萄糖漿再經(jīng)GI異構(gòu)化，得到果糖含量為42%的HFCS［18］。后經(jīng)色譜濃縮、分離得到果糖濃度為55%的HFCS，如圖3所示。

圖3　酶法生產(chǎn)高果糖漿工藝流程

葡萄糖異構(gòu)化過程使用填充床連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)。GI催化工藝底物濃度40%～45%（干基重，約95%的葡萄糖），粘度高，需要在高溫下進(jìn)行操作，且高溫可以避免微生物污染。在進(jìn)入填充床異構(gòu)化反應(yīng)前，對水解工藝得到的葡萄糖漿需要進(jìn)行過濾、活性炭吸附、離子交換處理。除去對GI有抑制作用的Ca2+，加入有激活作用的Mg2+。圖4為固定化GI在填充床上連續(xù)轉(zhuǎn)化葡萄糖漿的工藝流程［19］，果糖生產(chǎn)能力為100 t/a。用并聯(lián)的填充床反應(yīng)器，管束中裝有不同失活程度的酶。每個酶批次的使用時段和溫度都進(jìn)行調(diào)整，用于調(diào)節(jié)并穩(wěn)定生產(chǎn)能力。

圖4　葡萄糖異構(gòu)酶催化生產(chǎn)高果糖漿工藝流程

4　展望

從葡糖糖到HFCS的GI工藝，是最大的生物催化工藝，每年全世界的生產(chǎn)量超過1 000萬噸，這也使得固定化GI成為世界上最重要的工業(yè)酶制劑之一。國外GI的固定化技術(shù)研究較早，技術(shù)成熟。而我國的固定化GI市場一直被國外公司壟斷，造成果葡糖漿的生產(chǎn)成本過高。國內(nèi)固定化GI的水平還有很大的上升空間。

HFCS工藝的一個公開技術(shù)挑戰(zhàn)是設(shè)計出在一定溫度下操作充分穩(wěn)定的GI，在此溫度下，能使平衡更適于在柱中直接轉(zhuǎn)化為55%的果糖。因?yàn)檐涳嬃吓c食品需要55%的果葡糖漿以獲得與相同量的蔗糖同等的甜度，因此不得不用色譜法濃縮。如果酶在90～95℃依然穩(wěn)定，就能直接得到55%的果葡糖漿，可省略費(fèi)用昂貴的濃縮步驟。因此，研究高溫下GI的穩(wěn)定性和催化性能具有重要意義。

溫度升高，葡糖糖異構(gòu)化生成果糖的反應(yīng)平衡向果糖移動，反應(yīng)速度加快，這樣就可以減少固定化GI在填充床中的停留時間，從而減少副產(chǎn)物的生成，也降低了反應(yīng)所需的酶量，同時還可以增加難溶物質(zhì)如淀粉類、纖維素類等的溶解性和可利用性，降低有機(jī)化合物的黏度而利于反應(yīng)進(jìn)行。對反應(yīng)的冷卻系統(tǒng)要求降低，因而降低了能耗，既可降低成本，又可減少冷卻過程對環(huán)境造成的污染［20-21］。

人們對GI的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了大量的研究。商品酶Sweetzyme? T的菌種來源于S.murinus，該酶的最適溫度為85℃。Jorgensen等研究了該酶在55℃到90℃下酶活和產(chǎn)量的變化，反應(yīng)在填充柱中進(jìn)行。盡管酶活力隨著溫度的升高而增大，產(chǎn)量確實(shí)隨著溫度的升高而降低。因?yàn)槊冈诟邷叵碌乃ネ怂俾史浅４螅瑴囟仍礁?，使用時間越短。HFCS的產(chǎn)量來不及大量積累，酶已基本失活。Lim等［22］研究了固定化GI和游離酶的熱失活機(jī)制，發(fā)現(xiàn)GI的巰基氧化反應(yīng)以及GI和糖之間的美拉德反應(yīng)是引起酶熱失活的部分原因。Bandlish等［23］的研究中，比較了兩種來源于極端嗜熱菌酶和一種來源于S.murinus的耐熱GI。利用固定化耐熱GI（共價固定在玻璃珠上），在80℃，添加金屬離子的情況下轉(zhuǎn)化葡萄糖，1 kg酶大約可生產(chǎn)2 000 kg的果糖，得到了一個既有高轉(zhuǎn)化率又有商業(yè)化可能產(chǎn)量的固定化極端耐熱GI。這一結(jié)果為高溫條件催化得到55%果糖濃度的HFCS帶來希望，但是需要進(jìn)一步的研究熱穩(wěn)定性和熱活力的關(guān)系，以及維持高溫下果糖穩(wěn)定性的辦法。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Progress in immobilized glucose isomerase

JIN Liqun1，GUO Dongjing1，LIAO Chengjun2
（1.Institute of Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；2.Zhejiang Huakang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Quzhou 324302，China）

High fructose corn syrup，a natural sweetener，has been widely used in foods and beverages.Glucose isomerase is one of the key enzymes in the production of high fructose corn syrup.It is an important industrial enzyme in commerce today.Its immobilization technology is very mature and considered to be the paradigm for enzyme immobilization This paper described the glucose isomerase and its immobilization，and its application in the production of high fructose corn syrup was also introduced.

glucose isomerase；immobilization；high fructose corn syrup

Q814.2

A

1674-2214（2015）03-0047-05

2015-05-13

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31401527）

金利群（1976—），女，浙江東陽人，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锎呋c酶工程，E-mail：jlq@zjut.edu.cn.