于鯤，霍曉慧，許陽，杜先鋒

(安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽合肥，230036)

退火處理是指一定水分含量(40%～90%)的淀粉在高于其玻璃化溫度且低于其糊化溫度環(huán)境下，經(jīng)加熱處理后而引起其結構及性質(zhì)改變的物理修飾過程［1］。退火處理增強了無定形區(qū)直鏈淀粉分子鏈段的流動，進而引起分子的重排［2］，形成直鏈－直鏈淀粉分子和直鏈－支鏈淀粉分子局部雙螺旋結構［3］?？梢娡嘶鸶淖兞说矸鄣脑Y晶結構，必引起其物理化學特性的改變。

谷物淀粉顆粒由交替的半結晶區(qū)和無定形區(qū)組成，而結晶區(qū)主要由支鏈淀粉的雙螺旋形成，而不是直鏈淀粉［4］。淀粉顆粒的通道主要分布在半結晶區(qū)和無定形區(qū)，這些通道與淀粉糊化時直鏈淀粉的釋放有密切關系，而且孔洞可能很容易被酶侵蝕，影響淀粉顆粒的酶解特性［5－7］。谷物淀粉中小麥淀粉最為常見，其酶解特性的研究為谷物食品在人體內(nèi)消化特性的研究提供了依據(jù)。

退火處理除了可以改善淀粉類食品的品質(zhì)如面包的抗老化性、面團的筋力外［8］，對淀粉顆粒的酶解作用也會產(chǎn)生影響。本研究通過退火處理，對淀粉顆粒結構進行物理修飾，采用差示量熱掃描儀(DSC)［9］、電子掃描顯微鏡(SEM)、X－衍 射(XRD)［10］對其結構和性質(zhì)進行表征，建立基于淀粉的酶解機理與淀粉顆粒結構的對應關系，探究退火處理與小麥淀粉酶解機理的相關性提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥淀粉:Sigma公司;葡萄糖淀粉酶:酶活力為120 U/mg，來源于黑曲霉;α－淀粉酶:酶活力為50 U/mg，來源于豬胰腺;其他試劑均為分析純。

DSC 8000，美國 PE公司;UV－5500紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司;MS－2000激光粒度分析儀，英國Malvern儀器;TTR－ⅢX射線衍射儀，日本Rigaku理學公司;JSM－6490LV掃描電子顯微鏡，日本電子公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 退火小麥淀粉樣品的制備

將小麥淀粉配制成60%水分含量的淀粉乳分別放置在 35、40、45、50 ℃ 條件下分別退火 0.5、4、12、24、48 h后取出冷卻，室溫干燥至接近原淀粉水分含量，研磨過 200 目篩后密封保存［8，11］。

1.2.2 原小麥淀粉與退火小麥淀粉的酶解［7］

酶解研究選用葡萄糖淀粉酶和α－淀粉酶2種酶分別對處理樣品進行酶解，稱取1～2 g的原淀粉、退火處理樣品于磨口三角瓶中加入95 mL的緩沖溶液在40℃以1 500 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌保溫10 min后加入兩種酶反應。葡萄糖淀粉酶酶解中使用的緩沖液是20 mmol/L pH 4.5的雙乙酸鈉緩沖溶液，α－淀粉酶酶解中使用的緩沖液是20 mmoL/L pH 6.9的磷酸鹽緩沖溶液。酶解過程中的加酶量均為200 U。每隔一定時間取出5 mL的酶解液加20%NaOH 0.1 mL滅酶并立即冷卻離心，利用3，5－二硝基水楊酸法測定其中還原糖的含量。酶解后剩余的淀粉在室溫下烘干后研磨過200目篩回收待測。

1.2.3 酶解小麥淀粉顆粒的熱力學特性［9］

利用差示量熱掃描儀(DSC)測定退火處理淀粉酶解后的熱力學特性。用銦和鋅校正儀器，測量時以空的鋁坩堝為參照。準確稱量25%的待測淀粉乳7.0～10.0 mg于鋁坩堝內(nèi)密封，4℃靜置過夜。掃描程序是從20℃到120℃以10℃/min的速度升溫。利用儀器配備的軟件自動計算出淀粉的糊化起始溫度(T0)、峰值溫度(TP)、終止溫度(TC)及糊化焓(△H)。

1.2.4 酶解小麥淀粉的顆粒形貌

利用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察原淀粉、退火淀粉和不同退火處理樣品酶解后的顆粒形貌變化。將所有待測樣品研磨后過200目篩，輕輕敷在專用的雙面膠上，用洗耳球吹散使其均勻分布，將固定好的樣品放入鍍金器中噴金2次，每次50 s。測定時選用3 kV電子槍加速，選定合適的放大倍數(shù)拍照［10］。

1.2.5 酶解小麥淀粉顆粒結晶性質(zhì)分析［13］

使用Rigaku TTR－III X射線衍射裝置測定原淀粉、退火淀粉和不同處理樣品酶解后的結晶型及結晶度。將處理樣品均研磨過200目篩，將樣品倒于樣品板上至稍有堆起，在其上用玻璃板緊壓。衍射條件選擇X－衍射管為銅對陰極，Ni過濾器，電壓40 kV，電流200 mA，掃描速率為8°/min，測量范圍為2θ=3°～50°。根據(jù)所得X射線衍射圖譜，劃分結晶區(qū)和非晶區(qū)并進行面積積分后進行結晶度的計算:

式中:Ac，X射線衍射圖上結晶區(qū)面;Aa，X射線衍射圖上非晶區(qū)面積。

2 結果與分析

2.1 不同退火時間處理的小麥淀粉經(jīng)兩種酶酶解后生成還原糖的速率對比

由圖1和圖2可以看出，經(jīng)過退火處理小麥淀粉的酶解速率明顯高于原小麥淀粉，且隨著退火處理時間的變化，酶解速率也有所不同。退火時間4 h時小麥淀粉的酶解速率最高，WANG等在研究葡萄糖淀粉酶和α－淀粉酶對西米淀粉顆粒的酶解過程的影響中表明退火之后淀粉的酶解變得更加容易，原因是由退火處理破壞了結晶區(qū)和無定形區(qū)之間的氫鍵且使其無定形區(qū)輕微的膨脹［14］。Nakazawa等研究表明退火使得淀粉的水解率變快且使得淀粉形成了一種更易被滲透的結構，這種結構可能導致其酶解速率的加快［15］。低于4 h退火的小麥淀粉的酶解速率與原小麥淀粉無明顯區(qū)別，淀粉是大分子聚合物，其內(nèi)部結構的改變是通過鏈段運動形成的，鏈段之間的聚合與時間的關系服從 Avrami方程［16］，可以解釋0.5 h退火小麥淀粉的酶解率與原小麥淀粉的無明顯區(qū)別。而退火時間高于4 h時小麥淀粉的酶解速率會隨時間的增加而降低并逐漸趨近于原小麥淀粉。淀粉分子在水分子的作用下發(fā)生重排，而隨退火時間增加直鏈淀粉與支鏈淀粉的排布更加緊密，形成更加堅固的直鏈－直鏈與直鏈－支鏈的雙螺旋結構，使得淀粉顆粒的酶解通道較少，酶解變得緩慢。

圖1 退火時間變化對葡萄糖淀粉酶酶解小麥淀粉速率的影響Fig.1 Effects of annealing time on EHRs of wheat starches by glucoamylase

圖2 退火時間變化對α－淀粉酶酶解小麥淀粉速率的影響Fig.2 Effects of annealing time on EHRs of wheat starches by α－amylase

2.1 不同退火溫度處理的小麥淀粉經(jīng)兩種酶酶解后生成還原糖的速率對比

圖3 退火溫度變化對葡萄糖淀粉酶酶解小麥淀粉速率的影響Fig.3 Effects of annealing temperature on EHRs of wheat starches by glucoamylase

圖4 退火溫度變化對α－淀粉酶酶解小麥淀粉速率的影響Fig.4 Effects of annealing temperature on EHRs of wheat starches by α－amylase

圖3和圖4是不同退火溫度處理的淀粉與原淀粉的酶解速率對比。經(jīng)過退火處理淀粉的酶解速率明顯高于原淀粉，且不同退火溫度淀粉的酶解速率之間也存在一定的差異。Tester和Debon研究表明，淀粉經(jīng)退火之后雖無定形區(qū)和結晶區(qū)變得更加完善，但可能經(jīng)退火之后淀粉顆粒酶解通道被打開使其更易受到酶的攻擊［1］。退火處理的溫度越高淀粉的酶解速率越高，35、40℃退火處理淀粉基本無差別，對于淀粉這樣的大分子溫度在其分子的運動中起關鍵的作用，溫度越高分子運動越劇烈［17］。也就是在退火處理過程中溫度的升高加劇了無定形區(qū)直鏈淀粉分子的鏈段運動［18］，使得淀粉充分溶脹，淀粉的酶解通道被擴大酶攻擊位點暴露，使淀粉的酶解速率加快。相反，溫度低則淀粉分子在相同的時間內(nèi)不能夠充分溶脹，無定形區(qū)直鏈淀粉的鏈段運動受限［18］，導致低溫處理的退火淀粉的酶解速率相對于高溫的低。

2.3 酶解淀粉顆粒的熱力學特性結果

表1是利用DSC測定的原淀粉和不同退火條件處理的淀粉酶解前后的糊化特性。原淀粉和退火淀粉經(jīng)酶解后的糊化峰值溫度均有所升高，且酶解后淀粉的糊化焓與未酶解淀粉相比大體呈現(xiàn)降低趨勢。隨著退火處理的持續(xù)，較弱或不完善的結晶會逐漸消失，余下的結晶由于重結晶和熔融而變得更加完善［18］。在淀粉糊化的特征參數(shù)中，糊化起始溫度(T0)代表淀粉顆粒內(nèi)部有序性最微弱微小結晶熔融溫度，退火增強微晶的有序性，引起其糊化起始溫度(T0)和糊化峰值溫度(TP)均有升高。酶解后淀粉的TP升高代表酶解促進了淀粉結晶區(qū)的熔融，酶解后的淀粉顆粒的熔融是無定形區(qū)和結晶區(qū)同時進行的。而隨退火時間的延長和退火溫度的升高，酶解后淀粉顆粒的糊化峰值溫度與酶解前的差距越來越小，說明經(jīng)過退火處理的淀粉的熔融開始主要是在無定形區(qū)。退火處理提高了TP及使得淀粉的糊化溫程變窄，而酶解的原淀粉和退火淀粉顆粒仍保持著這樣的熱學特性。研究發(fā)現(xiàn)酶解后的淀粉顆粒的糊化焓明顯降低是因為淀粉的結晶結構和雙螺旋－結構在酶解過程中被破壞［7，14］。而退火淀粉酶解后的糊化焓會因其退火條件的不同而有不同程度的升高或降低，說明退火處理淀粉在酶解過程中仍保持其退火后的特性。α－淀粉酶與葡萄糖淀粉酶相比在相同時間內(nèi)對淀粉顆粒的作用效果更明顯。

表1 原淀粉和退火淀粉水解后的糊化特性Table 1 Gelatinization properties of hydrolyzed native and annealed starches by glucoamylase and α-amylase

續(xù)表1

2.4 酶解后淀粉顆粒的形貌圖

圖5和圖6分別是經(jīng)葡萄糖淀粉酶和α－淀粉酶酶解13 h后的不同淀粉樣品的電鏡圖。退火后的淀粉顆粒形貌與原淀粉相比基本無變化，且各酶解淀粉樣品的電鏡圖也無明顯區(qū)別。通過電鏡圖可以得出α－淀粉酶對淀粉酶解的效果更加明顯，且兩種酶對原淀粉和退火淀粉的酶解作用位點并無改變。兩種酶均是從淀粉顆粒赤道溝附近的特殊區(qū)域開始水解并以點狀開始很快下陷，并逐漸擴大，形成一個通道進入淀粉顆粒內(nèi)部，導致小麥淀粉顆粒由橢球形變成扁球形。

2.5 酶解前后淀粉顆粒的結晶結構

圖5 葡萄糖淀粉酶酶解原淀粉與不同退火條件處理淀粉的13 h后電鏡圖原淀粉(a，b)，35 ℃退火48 h的淀粉(c，d)，45 ℃退火48 h 的淀粉(e，f)，50 ℃退火48 h的淀粉(g，h)，50 ℃退火4 h的淀粉(m，n);放大倍數(shù)為1 500 ×(a，c，e，g，m)和5 000 ×(b，d，f，h，n)Fig.5 SEM photographs of native and annealed wheat starches hydrolyzed by glucoamylase for 13 h

圖6 α－淀粉酶酶解原淀粉與不同退火條件處理淀粉的13 h后電鏡圖原淀粉 (a，b)，35℃退火48 h的淀粉 (c，d)，45℃退火48 h的淀粉(e，f)，50℃退火48 h的淀粉(g，h)，50℃退火4 h的淀粉(m，n);放大倍數(shù)為1 500×(a，c，e，g，m)和 5 000 × (b，d，f，h，n)Fig.6 SEM photographs of native and annealed wheat starches hydrolyzed by α－amylase for 13 h

核磁共振研究表明［20－21］，淀粉顆粒內(nèi)的結晶片層是由支鏈淀粉的雙螺旋形成的，支鏈淀粉的支點位于無定形區(qū)。X－衍射的結果表明經(jīng)過退火的小麥淀粉的相對結晶度高于原淀粉，退火處理促進無定形區(qū)直鏈淀粉分子的流動，并使其與支鏈淀粉形成雙螺旋結構，導致淀粉的相對結晶度的升高(圖7)。酶解之后的淀粉的X－衍射圖的峰強度明顯降低，且經(jīng)過退火之后的淀粉酶解顆粒與原淀粉酶解顆粒相對結晶度有明顯的差別(圖7和表2)。退火處理淀粉酶解顆粒的結晶度明顯高于原淀粉酶解顆粒的無論是葡萄糖淀粉酶酶解還是α－淀粉酶酶解(表2)，可能的原因是經(jīng)過退火后的淀粉顆粒的半結晶片層中的無定形區(qū)直鏈－直鏈或直鏈－支鏈雙螺旋結構的形成阻礙了結晶片層酶解，使得無定形區(qū)大部分酶解，導致相對結晶度的升高。而原淀粉則可能是結晶層與無定形層同時酶解，相對結晶度升高的速率相對較慢。這個結果與前面退火之后淀粉的酶解速率高于原淀粉的結果和DSC測的熱學特性結果均基本一致。

表2 原淀粉與48 h退火淀粉酶解前后結晶度對比Table 2 Relative crystallinity of native and annealed wheat starches after glucoamylase and α-amylase for 13 h

3 結論

試驗表明，退火處理小麥淀粉的酶解速率比原淀粉的更快，且不同退火條件處理的小麥淀粉的酶解速率也有差異。退火時間的變化對淀粉顆粒的酶解速率的影響較為顯著，退火4 h的淀粉顆粒的酶解速率明顯高于原淀粉。而溫度變化時高溫退火處理的淀粉酶解速率較低溫處理淀粉的高。退火處理降低了淀粉酶解前后的糊化峰值溫度差距，且退火淀粉酶解顆粒的熔融開始主要在無定形區(qū)。退火處理前后的小麥淀粉顆粒酶解電鏡圖無明顯差異，只是相同酶解時間α－淀粉酶的作用效果高于葡萄糖淀粉酶。退火提高了原淀粉的相對結晶度，且退火淀粉酶解顆粒的相對結晶度高于原淀粉酶解顆粒的相對結晶度。

圖7 原淀粉與48 h退火淀粉酶解前后的X－衍射圖Fig.7 X－ray diffraction patterns of unhydrolyzed and hydrolyzed native and annealed wheat starches

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