柳陳堅(jiān)，劉曉峰，張海燕，羅義勇，李曉然

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明，650500)

豆豉以大豆或黃豆為主要原料，利用毛霉、曲霉或者細(xì)菌蛋白酶的作用，分解大豆蛋白質(zhì)，達(dá)到一定程度時(shí)，加鹽、加酒、干燥等方法，抑制酶的活力，延緩發(fā)酵過程而制成。豆豉不僅含有大豆中原有的豐富營養(yǎng)素，而且通過微生物發(fā)酵作用又產(chǎn)生很多種對人體有極高保健作用的功能性物質(zhì)，因此其具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，易于消化吸收［1］。

目前，云南地區(qū)的豆豉是以家庭作坊式為主，是開放式自然制曲，因此在發(fā)酵過程中不僅有主要參與發(fā)酵過程的微生物，還伴隨著其他次要微生物的生長。而得益于云南獨(dú)特的地理位置以及氣候環(huán)境，使得豆豉中具有許多獨(dú)特而寶貴的微生物資源。最初研究豆豉中微生物群落多樣性主要采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法，這也是實(shí)驗(yàn)室最常用的一種方法。但是自然界中存在許多獨(dú)特而難培養(yǎng)的微生物，利用微生物培養(yǎng)法只能分離到自然界中極少數(shù)的微生物，并不能真實(shí)地反映環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)，這成為微生物資源開發(fā)利用的一個(gè)限制性因素，使得微生物的多樣性資源難以得到全面開發(fā)和利用。近年來，利用不依賴培養(yǎng)的方法研究微生物群落多樣性的實(shí)驗(yàn)越來越普遍?；?6S rDNA的分子生物學(xué)技術(shù)的興起對依賴培養(yǎng)的技術(shù)進(jìn)行了補(bǔ)充，并得到長足的發(fā)展。在微生物群落多樣性的研究方法不斷改進(jìn)的同時(shí)，測序技術(shù)也取得了巨大進(jìn)展。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，被稱為“第二代測序(next-generation sequencing，NGS)”技術(shù)在過去幾年中不斷涌現(xiàn)，主要包括羅氏454公司的GS-FLX測序平臺、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測序平臺和ABI公司的Solid測序平臺［2］。第二代測序技術(shù)高通量，低成本，可以同時(shí)對多個(gè)單獨(dú)的DNA分子進(jìn)行測序分析的特點(diǎn)為研究微生物群落多樣性提供了極大的便利?，F(xiàn)在高通量測序技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用到微生物群落多樣性的分析中，尤其以焦磷酸測序(pyrosequencing)的應(yīng)用最為普遍。

本研究通過不依賴培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法并結(jié)合高通量測序研究了云南省普洱市的豆豉微生物群落多樣性，為進(jìn)一步利用和開發(fā)豆豉中微生物資源及發(fā)酵食品的質(zhì)量與安全奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆豉購于云南省普洱市菜市場，為當(dāng)?shù)匕傩兆孕邪l(fā)酵制成。購買后置于冰盒中運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，－80℃保存。

DNA提取裂解緩沖液:0.1 mol/L Tris/HCl，0.1 mol/L EDTA，0.75 mol/L蔗糖;TE緩沖液:10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA ，pH 8.0;Premix Ex TaqTM大連TaKaRa公司;QIAquick Gel Extraction Kit德國Qiangen公司;有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Sigma 3-18K離心機(jī)，美國Sigma公司;ABI 7200PCR儀，美國ABI公司;羅氏GS-FLX測序儀，瑞士Roche公司;Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)，美國Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

DNA提取參考Schmidt等［3］的方法并做了部分改變。取約0.2 g豆豉置于無菌的1.5 mL離心管中，加入450 μL裂解緩沖液，加入10 μL 50 mg/mL 溶菌酶(Lysozyme)和 10 μL 20 mg/mL 溶壁酶(Lyticase)，充分混合均勻后，37℃水浴30 min。加入25 μL 20%SDS和5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，充分混合均勻后，55℃水浴2 h以上。加入80 μL 5mol/L NaCl和60 μL 10%CTAB/NaCl，小心混勻后，65℃水浴20 min。加入700 μL苯酚、氯仿與異戊醇混合液［V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1］，顛倒混勻后于 12 000 r/min離心10 min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，加入等體積的氯仿與異戊醇混合液［V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1］，顛倒混勻后于12 000 r/min離心10 min。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，－20℃沉淀過夜后于12 000 r/min離心15 min，倒掉液體，用500 μL預(yù)冷的70%乙醇洗沉淀，去掉液體后，打開離心管蓋子，放置于60℃烘干箱干燥30 min，每10 min輕彈管壁，促進(jìn)液體揮發(fā)，待液體全部揮發(fā)后取出，加入50 μL TE緩沖液溶解DNA。提取好的DNA存放于－20℃冰箱。

1.3.2 細(xì)菌16S rDNA和真菌ITS區(qū)域擴(kuò)增及焦磷酸測序

進(jìn)行DNA擴(kuò)增的細(xì)菌16S rDNA通用引物為338F(5’-ACH YCT ACG GGA GGC HGC-3’)和907R(5’-CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT-3’)，擴(kuò)增真菌ITS區(qū)域的引物為NSI1(5’-GATTG AATGGCTTAGTGAGG-3’)和58A2r(5’-CTGCGTTCTT CATCGAT-3’)。為了減少PCR產(chǎn)物中非特異性擴(kuò)增的異源雙鏈DNA的含量，將PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為模版后按照原來的條件再做5個(gè)循環(huán)［4］。PCR擴(kuò)增采用 Premix Ex TaqTM。具體體系及程序:在50 μL的PCR反應(yīng)體系中:ddH2O 18 μL，F(xiàn)orward 引物(5 μmol/L)2 μL，Reverse 引物(5 μmol/L)2 μL，Premix Ex TaqTM25 μL，模板15 ng。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，56℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min，4℃保存。

將PCR產(chǎn)物在10 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后將凝膠浸泡于含有20 μg/mL EB的TAE緩沖液中10 min后在紫外燈(216 nm)照射下呈現(xiàn)橙色條帶，目標(biāo)條帶割下后使用QIAquick Gel Extraction Kit對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。使用nanodrop ND-1000分光光度計(jì)(Thermo，美國)對完成純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物定量。使用GS-FLX(Roche，瑞士)測序系統(tǒng)對DNA進(jìn)行測序。

1.3.3 測序結(jié)果分類鑒定

對于焦磷酸測序的測序結(jié)果分析質(zhì)量文件，去掉測序質(zhì)量不好的序列以及細(xì)菌和真菌序列長度分別小于400 bp和300 bp的序列。根據(jù)barcode將序列分配所屬的樣品中，同時(shí)去除barcode和引物序列。對于細(xì)菌序列使用 Mothur v1.25.1［5］的 classify.seqs 命令，采用Silva的核糖體小亞基(SSU)rRNA序列數(shù)據(jù)庫V102［6］的分類信息，得到序列的分類信息。對于真菌序列則從每個(gè)OTU中選擇代表性序列，與NCBI的GenBank進(jìn)行Blast比對，確定真菌序列的分類信息。

1.3.4 多樣性指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育分析

對所有序列使用Mothur v1.25.1［5］進(jìn)行比對，以0.03為Cutoff值劃分可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。計(jì)算Cutoff為0.03時(shí)的ACE和Chao1值，并繪制稀釋曲線。細(xì)菌的16S rDNA和真菌ITS區(qū)域的在樣品中覆蓋度用公式C=［1－(n1/N)］)×100來計(jì)算。其中，n1代表Singleton(只有1條序列的OTU)的數(shù)量，N則表示總序列數(shù)［7］。

從細(xì)菌16S rDNA序列中每個(gè)OTU選取代表序列，將其在NCBI的GenBank進(jìn)行Blast比對，將結(jié)果中具有確定分類信息的序列用ClustalX 1.83［8］進(jìn)行比對，將比對的結(jié)果用 Mega v4.0［9］中的 Neighbourjoining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列信息和多樣性指數(shù)

焦磷酸測序后的細(xì)菌和真菌序列經(jīng)過質(zhì)量和長度刪選后，分別得到1 008和3 733條高質(zhì)量的序列。以0.03為cutoff對這些序列進(jìn)行分析，共得到細(xì)菌OTU 25個(gè)，其中，Singleton 14個(gè);真菌OTU 12個(gè)，有6個(gè)Singleton。樣品中細(xì)菌和真菌的稀釋曲線如圖1所示，在cutoff為0.05時(shí)，細(xì)菌和真菌的稀釋曲線均呈現(xiàn)出了接近平臺的趨勢，而在cutoff為0.03時(shí)，曲線的上升趨勢還很明顯，說明在種的水平上，測序量可能還不能完全反映樣品中的微生物群落多樣性(圖1)。

表1 豆豉中細(xì)菌和真菌的豐度(cutoff 0.03)Table 1 Bacterial and fungal richness with cutoff of 0.03

圖1 根據(jù)Rarefaction方法估計(jì)豆豉樣品細(xì)菌和真菌的多樣性Fig.1 Estimated OTU numbers，according to the rarefaction method，depending on OTUs identified with a 3%cut-off

2.2 細(xì)菌群落多樣性分析

根據(jù)Silva的SSUrRNA序列數(shù)據(jù)庫對篩選出的1 008條細(xì)菌序列進(jìn)行分類。經(jīng)分析，1 008條細(xì)菌序列全部屬于厚壁菌門(Firmicutes)，共檢測到厚壁菌門的5個(gè)細(xì)菌科，分別是:腸球菌科(Enterococcaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、肉桿菌科(Carnobacteriaceae)和乳桿菌科(Lactobacillaceae)。其中，占總序列數(shù)93%的序列屬于腸球菌科，6%的序列屬于葡萄球菌科，而屬于明串珠菌科、肉桿菌科和乳桿菌科的序列均不足1%，其中以屬于乳桿菌科的序列最少，僅有1條。在屬的分類水平上，92.5%的序列屬于四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)，6%的序列屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，而屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、蜜蜂球菌屬(Melissococcus)和Fructobacillus均不足1%，見圖2。

圖2 豆豉中細(xì)菌在不同分類水平的分布Fig.2 The major families and genera in fermented soybean

2.3 真菌群落多樣性分析

以0.03為cutoff，共得到12個(gè)OTU，從除Singleton和Doubleton(含有2條序列的OTU)之外的6個(gè)OTU中，各選取1條代表性序列，在 NCBI的 Gen-Bank進(jìn)行Blast比對，確定每個(gè)OTU的分類信息。所分析的3 733條真菌序列均屬于假絲酵母屬(Candida)，其中有3個(gè)OTU，占總序列數(shù)85.5%(3 192條)的序列屬于 C.etchellsii，OTU PE_ITS_3(8%)屬于C.apicola，還有占總序列數(shù)6%(244條)的2個(gè)OTU屬于皺狀假絲酵母(C.versatilis)(表2)。

2.4 細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

以0.03為cutoff，確定了樣品1 008條細(xì)菌序列的25個(gè)OTU。除去Singleton和Doubleton后，對剩余的10個(gè)OTU與其在GenBank數(shù)據(jù)庫中的相近序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。豐度最高的OTU是P1，占總序列數(shù)的86.7%，具有絕對的優(yōu)勢，經(jīng)比對，OTU P1的序列與嗜鹽四聯(lián)球菌(T.halophilus)，具有97%的相似度。有43條序列屬于OTU P9，這也是豐度第二高的OTU，屬于這個(gè)OTU的序列與葡萄球菌屬Staphylococcus sp.具有較高的相似度。OTU P7有19條序列，也屬于葡萄球菌屬，與肉葡萄球菌(S.carnosus)具有較高的相似度。有16條序列劃分在OTU P3中，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上并未與已知分類信息的細(xì)菌呈現(xiàn)較高的相似度。OTU P6有15條序列，與嗜鹽四聯(lián)球菌也具有97%的相似度。另外，其余的五個(gè) OTU占總序列數(shù)的比例均 ＜1%。其中，OTUP2、P5、P8、P10，均與嗜鹽四聯(lián)球菌具有較高的相似度，而OTUP4則與Leuconostoc fallax具有99%的相似度。從系統(tǒng)進(jìn)化樹上可看出，所有序列均屬于厚壁菌門。

表2 真菌OTU及其分類信息Table 2 Fungal OTUs and the closest taxonomic annotations

3 討論

不同類型的發(fā)酵食品，其中的微生物群落結(jié)構(gòu)也各有差異，例如，發(fā)酵玉米食品的優(yōu)勢細(xì)菌屬于乳桿菌屬，優(yōu)勢真菌是熱帶假絲酵母(C.tropicalis)［10］;發(fā)酵可可豆中的優(yōu)勢細(xì)菌是乳桿菌屬和醋菌屬(Acetobacter)，優(yōu)勢真菌類型為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和漢森氏酵母屬(Hanseniaspora)［11］;發(fā)酵海產(chǎn)品的優(yōu)勢細(xì)菌是乳桿菌屬和魏斯氏菌屬，還檢測到嗜鹽古菌的存在［12］。

在本研究中，豆豉的細(xì)菌群落多樣性明顯高于真菌群落的多樣性。在豆豉的細(xì)菌群落中，豐度相對較高的10個(gè)OTU分別屬于厚壁菌門的5個(gè)菌科。豐度最高的OTU P1及另外4個(gè)豐度較低的OTU，都與嗜鹽四聯(lián)球菌具有較高的相似度。嗜鹽四聯(lián)球菌是一種能夠適應(yīng)高鹽等極端環(huán)境［13］的乳酸菌，嗜鹽乳酸菌通常存在于發(fā)酵的魷魚肝醬［14］、豆瓣醬［15］及咸魚［16］等食品中。豐度第二高的OTU是P9，經(jīng)比對屬于葡萄球菌，但是并沒有具體到種的分類信息。葡萄球菌屬中至少有40個(gè)不同的菌種，除了有從發(fā)酵食品中分離到的，也有一部分潛在致病菌，因此，確定其是否為致病菌需要進(jìn)一步分離鑒定。這也暗示了豆豉中可能存在潛在的致病風(fēng)險(xiǎn)。與OTUP7相似度最高的是肉葡萄球菌，最初分離自干香腸中，與肉制品的生產(chǎn)也具有一定的關(guān)系［17］。2009年德國科學(xué)家Rosenstein等［18］從肉品發(fā)酵劑中分離到肉葡萄球菌，說明肉葡萄球菌在發(fā)酵過程中可能具有某種作用。

豆豉的真菌群落中豐度最高的OTU屬于C.etchellsii，另外的2個(gè)OTU分別屬于C.apicola和C.versatilis，這3株酵母菌都是耐鹽菌［19］分離自大豆醬等高鹽環(huán)境中，對于食品發(fā)酵中的香氣物質(zhì)產(chǎn)生具有重要作用［20］。這表明云南省普洱市的豆豉含鹽量極高，檢測到了極高比例的耐鹽菌，因此只有能夠適應(yīng)高鹽環(huán)境的微生物才能大量繁殖。

普洱市地處熱帶，不論是豆豉的細(xì)菌群落還是真菌群落，其優(yōu)勢菌都是耐鹽菌，除了表明豆豉極高的含鹽量之外，也暗示了人們在食用此類豆豉時(shí)要注意食鹽攝入量，避免引起高血壓等疾病。多數(shù)乳酸菌能夠產(chǎn)生細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)，可以考慮在制作豆豉過程中通過人為添加產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的方法來減少制作過程中食鹽的添加。葡萄球菌屬中雖然有的細(xì)菌能夠參與豆豉的發(fā)酵過程，但是并未做具體實(shí)驗(yàn)證明它不存在潛在致病性，需要做進(jìn)一步的研究來確定。

［1］盧露，鄭曉瑩.豆豉發(fā)酵中微生物及其功能研究進(jìn)展［J］. 糧食與食品工業(yè)，2011，18(1):42－45.

［2］賀紀(jì)正，袁超磊，沈菊培，等.土壤基因組學(xué)研究方法與進(jìn)展［J］.土壤學(xué)報(bào)，2012，49(1):155－164.

［3］Schmidt T M，DeLong E F，Pace N R.Analysis of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing［J］.Journal of Bacteriology，1991，173(14):4 371 －4 378.

［4］Thompson J R，Marcelino L A，Polz M F.Heteroduplexes in mixed-template amplifications:formation，consequence and elimination by ＇reconditioning PCR ＇［J］.Nucleic Acids Research，2002，30(9):2 083 －2 088.

［5］Schloss P D，Westcott S L，Ryabin T，et al.Introducing mothur:open-source，platform-independent， communitysupported software for describing and comparing microbial communities［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75(23):7 537 －7 541.

［6］Pruesse E，Quast C，Knittel K，et al.SILVA:a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB［J］.Nucleic Acids Research，2007，35(21):7 188 －7 196.

［7］Good I J.The population frequencies of species and the estimation of population parameters［J］.Biometrika，1953，40(3－4):237－264.

［8］Thompson J，Gibson T，Plewniak F，et al.The CLUSTAL_X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools［J］.Nucleic Acids Research，1997，25(24):4 876 －4 882.

［9］Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA4:Molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007，24(8):1 596 －1 599.

［10］Obinna-Echem P C，Kuri V，Beal J.Evaluation of the microbial community，acidity and proximate composition of akamu，a fermented maize food［J］.Science of Food and Agriculture，2013，94(2):331 －340.

［11］de Melo Pereira G V，Magalh~aes-Guedes K T，Schwan R F.rDNA-based DGGE analysis and electron microscopic observation of cocoa beans to monitor microbial diversity and distribution during the fermentation process［J］.Food Research International，2013，53(1):482 －486.

［12］RohS W，KimK H，Nam Y D，et al.Investigation of archaeal and bacterial diversity in fermented seafood using barcoded pyrosequencing［J］.The ISME Journal，2010，4(1):1 －16.

［13］Juste A，Lievens B，F(xiàn)rans I，et al.Genetic and physiological diversity of Tetragenococcus halophilus strains isolated from sugar-and salt-rich environments［J］.Microbiology-Sgm，2008，154(9):2 600－2 610.

［14］Satomi M，Kimura B，Mizoi M，et al.Tetragenococcus muriaticus sp.nov.，a new moderately halophilic lactic acid bacterium isolated from fermented squid liver sauce［J］.I nternational Journal of Systematic Bacteriology，1997，47(3):832－836.

［15］Tanasupawat S，Thongsanit J，Okada S，et al.Lactic acid bacteria isolated from soy sauce mash in Thailand［J］.Journal of General and Applied Microbiology，2002，48(4):201－209.

［16］Villar M，de Ruiz Holgado A P，Sanchez J J，et al.Isolation and characterization of Pediococcus halophilus from salted anchovies(Engraulis anchoita)［J］.Applied and Environmental Microbiology，1985，49(3):664 －666.

［17］Schleifer K H，F(xiàn)ischer U.Description of a new species of the genus Staphylococcus:Staphylococcus carnosus［J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1982，32(2):153－156.

［18］Rosenstein R，Nerz C，Biswas L，et al.Genome analysis of the meat starter culture bacterium Staphylococcus carnosus TM300［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75(3):811 －822.

［19］Ozaki S，F(xiàn)ukuda S，F(xiàn)ujita T，et al.RAPD analysis of salttolerant yeasts from contaminated seasoned pickled plums and their growth inhibition using food additives［J］.Biocontrol Science，2008，13(4):125 －130.

［20］Suezawa Y，Kimura I，noue M，et al.Identification and typing of miso and soy sauce fermentation yeasts，Candida etchellsii and C.versatilis，based on sequence analyses of the D1D2 domain of the 26S ribosomal RNA gene，and the region of internal transcribed spacer 1，5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2［J］.Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2006，70(2):348 －354.