郭秀蘭，唐仁勇，周子涵，王思源，潘鴻，黃海霞

(成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川成都，610106)

柑橘精油主要存在于柑橘皮的油胞中，約為果皮鮮重的0.5%～2%［1］，主要由萜烯類物質(zhì)及其含氧衍生物如高級醇類、醛類、酸類、酯類及一些飽和烷烴類、酚類等物質(zhì)組成［2］。柑橘精油具有抑菌、消炎、祛痰、止咳、促進消化、鎮(zhèn)痛、溶解膽結(jié)石等作用，此外還具有使人體中樞神經(jīng)鎮(zhèn)靜和減輕人體應(yīng)激，消除疲勞的作用［3］。柑橘精油無色透明，氣味清新怡人，具有令人愉悅的天然柑橘香氣，可作為食品的天然香味劑，在飲料、調(diào)味品、糖果、餅干、點心、冰淇淋等食品廣泛應(yīng)用［3－4］。另外柑橘精油是一種安全的抗菌劑，對食品中多種微生物都有較好的抑制效果，應(yīng)用于鮮切果蔬、肉制品、乳制品等的防腐保鮮［1，5］。

柑橘精油可作為發(fā)酵乳的天然香味劑，增強發(fā)酵乳的果味和保健作用，但柑橘精油本身具有抑菌作用，是否對發(fā)酵乳的發(fā)酵產(chǎn)生負面影響呢?本研究探討了柑橘精油對發(fā)酵乳發(fā)酵菌株保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)的抑菌作用和發(fā)酵乳品質(zhì)的影響，為拓寬柑橘精油的利用和開發(fā)發(fā)酵乳新品種提供理論依據(jù)和工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

1.1.1 材料

椪柑:市售新鮮椪柑;奶粉:市售伊利全脂奶粉;白糖:市售;發(fā)酵劑:丹麥科漢森直投發(fā)酵乳發(fā)酵劑;嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌由中國普通微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

牛津杯內(nèi)徑(6.0±0.1)mm，外徑(7.8±0.1)mm，高(10.0±0.1)mm;H-250型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;2HJH-C1209B型超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司;D2KW-4型電子恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)有限公司;BCD-228SCHA型新飛電冰箱，新飛電器集團有限公司;YX280A型手提式不銹鋼蒸汽消毒器，上海三種醫(yī)療器械有限公司;TGL-16G離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠;pHS-3C型精密pH計，上海醫(yī)療器械五廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 精油的提取

剝?nèi)⌒迈r椪柑皮，切碎，選用Clevenger裝置，采用水蒸汽蒸餾法［6］進行精油的提取，工藝參照文獻［7］。

1.2.2 精油的抑菌試驗

嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌分別用MRS和M17培養(yǎng)基進行活化，37℃培養(yǎng)制成細菌懸液，細菌使用平板計數(shù)法，調(diào)至濃度為含菌體106～107個/mL的菌懸液。將各種待測菌懸液各取0.2 mL在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上均勻涂布，制成含菌平板，每個培養(yǎng)皿均勻放置3只牛津杯。吸取一定稀釋濃度(1、10－1、10－2、10－3)的柑橘精油0.15 mL至相應(yīng)的牛津杯中，每濃度3個重復(fù)，37℃培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

1.2.3 柑橘精油發(fā)酵乳的制作工藝

1.2.3.1 工藝流程

奶粉 → 還原奶 → 配料(加糖)→加熱滅菌(90℃、5 min)→冷卻(40℃)→加精油→ 接種→裝罐→發(fā)酵(42℃)→冷卻后成熟(4℃)→成品

1.2.3.2 工藝要點

還原奶的制備:按奶粉與水的質(zhì)量體積比為15∶100配制，再加入7%的白糖，充分溶解，混勻。

殺菌、冷卻:混合好的料液在90℃下保溫5 min殺菌，冷卻至40℃，備用。

加精油和接種:在超凈工作臺中，將混合液加入適量的柑橘精油(0、450、700、950、1 200 μL/L)，并接種一定量的發(fā)酵劑，充分混合均勻。

灌裝封口、發(fā)酵及后成熟:將接種后混合均勻的物料灌裝于滅菌的容器中并封口，于42℃恒溫培養(yǎng)至凝固取出，并記錄發(fā)酵時間，放入0～4℃冰箱進行后發(fā)酵24 h得成品。

1.2.4 感官質(zhì)量評價

根據(jù)柑橘精油發(fā)酵乳氣味、口感、組織狀態(tài)和色澤進行感官評分，挑選10位經(jīng)過訓(xùn)練的專業(yè)人員進行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standard of sense score

1.2.5 柑橘精油發(fā)酵乳細菌計數(shù)

取發(fā)酵乳樣品2 g，用滅菌生理鹽水稀釋至10－5，每個處理再取200 μL菌液進行膠注培養(yǎng)，方法參照Kusuma等(2009)［8］。乳酸桿菌采用MRS培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)48 h，嗜熱鏈球菌采用M17培養(yǎng)基42℃厭氧培養(yǎng)48 h，再進行細菌計數(shù)。

1.2.6 pH值和酸度的測定

取少量發(fā)酵乳用pH計直接測定pH值，發(fā)酵乳酸度的測定參照GB 5413.34—2010乳和乳制品酸度的測定［9］。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，方差分析采用SPSS 14.0單因素方差分析和Duncan＇s多重比較分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 柑橘精油對發(fā)酵乳發(fā)酵細菌的抑菌結(jié)果

柑橘精油具有一定的抑菌作用［5］，可用于食品的防腐保鮮，但高劑量的精油也可能會引起腸道微生態(tài)的紊亂或者腸道細胞損傷［10］。本實驗考察不同濃度的精油對發(fā)酵乳發(fā)酵細菌的影響，尋找在發(fā)酵乳中添加柑橘精油的適宜濃度。從表2可看出，精油原液對嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的抑菌效果非常明顯，抑菌圈都遠大于15 mm，屬于高度敏感［11］，其中嗜熱鏈球菌對柑橘精油更敏感，特別是稀釋濃度為10－1時嗜熱鏈球菌的抑菌圈顯著高于保加利亞乳桿菌。隨著精油濃度的降低，抑菌效果也逐漸降低，10－2時保加利亞乳桿菌在牛津杯中略有生長，而10－3濃度時2種細菌在牛津杯內(nèi)均有相當(dāng)數(shù)量的生長。因此在發(fā)酵乳中添加柑橘精油的稀釋濃度控制在10－3左右可能不影響發(fā)酵菌種的生長。

表2 不同精油濃度對發(fā)酵乳發(fā)酵細菌的抑菌圈直徑 單位:mmTable 2 Inhibition zone diameter of fermented milk fermentation bacteria with addition of different essential oil concentration

2.2 柑橘精油發(fā)酵乳的發(fā)酵時間、酸度和pH值

在抑菌試驗的基礎(chǔ)上，選擇1 L發(fā)酵乳發(fā)酵液中添加 0、450、700、950、1 200 μL 柑橘精油，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加不同劑量的柑橘精油沒有對發(fā)酵時間造成顯著影響，5個處理的發(fā)酵時間(為4 h)基本一致，并且添加不同劑量的柑橘精油發(fā)酵乳的pH值和酸度基本一致(表3)，pH值為4.5～4.6，酸度值在92°T左右，符合GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》(酸度值＞70°T)［12］。這些結(jié)果說明在發(fā)酵液中添加450～1 200 μL/L的柑橘精油沒有抑制發(fā)酵乳的發(fā)酵和乳酸的產(chǎn)生。

表3 添加不同劑量柑橘精油對發(fā)酵乳酸度和pH值的影響Table 3 Effect of different dose of citrus essential oil on acidity and pH of fermented milk

2.3 柑橘精油發(fā)酵乳的細菌數(shù)量

實驗檢測了0和14 d發(fā)酵乳中乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數(shù)量，結(jié)果見表4。柑橘精油的添加略微降低了細菌數(shù)量，但沒有達到顯著性差異，且各個添加劑量對細菌數(shù)量的影響也不明顯，這與本實驗發(fā)酵乳發(fā)酵時間基本一致的結(jié)果相吻合。同時在4℃貯存14d后，2種細菌數(shù)量仍然較高，遠高于GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》中的 106CFU/mL［12］，因此 1 L 發(fā)酵液中添加 450～1 200 μL的柑橘精油未對發(fā)酵乳發(fā)酵細菌或益生菌數(shù)量造成負面影響。

表4 添加不同劑量柑橘精油對發(fā)酵乳細菌數(shù)量的影響Table 4 Effect of different dose of citrus essential oil on bacteria number in fermented milk

2.4 柑橘精油發(fā)酵乳的感官評分

柑橘精油發(fā)酵乳的感官評分見表5。柑橘精油的添加對發(fā)酵乳的組織狀態(tài)和色澤影響不大，但對氣味和口感有明顯改善作用，其中700 μL組的氣味、口感評分最高，顯著或極顯著高于未添加組，其次為450 μL和950 μL組，氣味和口感顯著高于未添加組，而1 200 μL組各項感官評分接近于未添加組，并顯著低于700 μL組。綜合各項評分，每升發(fā)酵液中添加450～950 μL的柑橘精油可顯著提升發(fā)酵乳氣味和口感，其中700 μL/L的效果最好。

表5 添加不同劑量柑橘精油對發(fā)酵乳感官評分的影響Table 5 Effect of different dose of citrus essential oil on sense score of fermented milk

3 結(jié)論

柑橘精油具體香甜的果味，也具有較強的抑菌作用，本實驗力求降低精油的抑菌作用，將其作為天然香味劑應(yīng)用于發(fā)酵乳。首先通過抑菌實驗尋找適宜的柑橘精油添加濃度，在此基礎(chǔ)上每升發(fā)酵液中添加450～1 200 μL精油，發(fā)現(xiàn)對發(fā)酵乳的發(fā)酵時間、pH值、酸度、乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數(shù)量沒有明顯影響，而感官評分表明添加柑橘精油450～950 μL/L可顯著提升發(fā)酵乳的氣味和口感，其中700 μL/L的效果最好。綜合這些實驗結(jié)果表明發(fā)酵乳中添加450～950 μL/L的柑橘精油可改善發(fā)酵乳氣味和口感，提升發(fā)酵乳的感官品質(zhì)，并拓寬柑橘精油的利用途徑。

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