黃文鶯 劉亦偉 王長(zhǎng)連 黃品芳 張陳枝 (福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建 福州 350005)

既往研究證實(shí)高血脂、高血壓及吸煙是冠心病發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素，而參與花生四烯酸代謝的CYP2家族亦在心血管系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)表達(dá)〔1〕，其遺傳多態(tài)性是否與冠心病的易感性相關(guān)，仍鮮見報(bào)道。CYP2C19為參與機(jī)體Ⅰ相代謝的氧化酶，其遺傳多態(tài)性自1993年證實(shí)，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)其存在34個(gè)突變基因，48種等位基因。研究表明，該編碼基因某些位點(diǎn)的突變與一些消化系統(tǒng)癌癥的易感性有關(guān)〔2〕，該基因編碼的產(chǎn)物亦是氯吡格雷〔3〕、奧美拉唑〔4〕等藥物和多種內(nèi)源性激素的主要代謝酶，其多態(tài)性是影響這些相關(guān)藥物體內(nèi)動(dòng)力學(xué)及藥效學(xué)的重要因素，且其分布存在地域及種族差異。本文采用基因芯片雜交法對(duì)福建籍漢族冠心病人群進(jìn)行多態(tài)性分析。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本院2013年3月至2015年1月冠心病住院患者1 200例，福建籍常住居民，無異族通婚史，無血緣關(guān)系，男927例，女273例，年齡21～95〔平均(64.3±12.2)〕歲，經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)，均符合缺血性心臟病診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕。剔除先天性心臟病患者、風(fēng)濕性心臟病患者、多臟器衰竭患者、精神障礙未能配合者。

1.2 主要儀器 Thermal cycler T100 PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司);e-Hyb全自動(dòng)雜交儀、BE2.0生物芯片識(shí)讀儀、BaiO?基因芯片圖像分析軟件V2.0(上海百傲科技有限公司);TU1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.3 試藥與試劑 血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化公司);CYP2C19基因檢測(cè)試劑盒(上海百傲科技有限公司);PCR引物合成(上海百傲科技有限公司);PCR產(chǎn)物測(cè)序(上海生工生物工程有限公司)。

1.4 采樣及DNA擴(kuò)增 入選患者采集全血于EDTA抗凝管中，24 h內(nèi)用吸附柱法提取DNA，以紫外法檢測(cè)DNA純度及濃度。精密吸取符合條件的DNA模板10 μl，加入擴(kuò)增液與反應(yīng)液，在25 μl體系中行以下PCR擴(kuò)增程序:50℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，72℃退火延伸 30 s，35次循環(huán);72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)后產(chǎn)物至冰箱2℃ ～8℃保存。

1.5 雜交反應(yīng)和基因分型 以上PCR產(chǎn)物加入雜交緩沖液，與抗體和顯色劑經(jīng)百傲雜交儀反應(yīng)后雜交于基因芯片上，根據(jù)第636號(hào)及681號(hào)堿基對(duì)突變情況，分為野生純合子型*1/*1(636GG/681GG)、突變雜合子型*1/*2(636GG/681GA)、*1/*3(636GA/681GG)和突變純合型*2/*2(636GG/681AA)、*2/*3(636GA/681GA)、* 3/*3(636AA/681GG)等6種基因型。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 組間比較行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 基因型判讀及驗(yàn)證 圖1為不同基因型患者的雜交芯片圖譜。將以上PCR產(chǎn)物用直接測(cè)序法驗(yàn)證，見圖2。

圖1 CYP2C19各基因型雜交芯片圖譜

2.2 入選患者的基因型分布 1 200例入選患者基因型分布見表1，681號(hào)堿基對(duì)突變率為32.28%，636號(hào)堿基對(duì)突變率為5.04%。單倍型分布見表2。基因分布頻率符合Hardy-weinberg平衡定律(681*2 的 χ2值為 0.03;636*3 的 χ2值為2.64，P＞0.05)，表明本組病例具有群體代表性。

圖2 CYP2C19各基因型直接測(cè)序圖譜

2.3 不同人群基因型分布 將本文人群的基因頻率分布與文獻(xiàn)報(bào)道的不同地區(qū)的健康人群比較，結(jié)果見表2，CYP2C19*2、*3單倍型與文獻(xiàn)中不同人群的分布比較見表3，冠心病患者與同地區(qū)健康人群基因頻率分布無顯著差異(P=0.947)。該頻率分布與國(guó)內(nèi)哈薩克族人群均有顯著差異(P＜0.05)，且與土耳其、俄羅斯、意大利、比利時(shí)、玻利維亞、丹麥、埃及、貝寧及美籍非洲人的基因頻率分布均存在極顯著差異(P＜0.01)。

表1 福建籍漢族冠心病患者CYP2C19基因型分布〔n(%)〕

表2 CYP2C19基因型分布比較(%)

表3 CYP2C19單倍型分布比較(%)

3 討論

近年冠心病的發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)，這不僅和高血壓、肥胖、吸煙、飲酒等因素有關(guān)，個(gè)體遺傳背景的差異也是導(dǎo)致該病發(fā)生的重要機(jī)制〔18〕。CYP2C19作為參與花生四烯酸代謝途徑的關(guān)鍵酶之一，通過參與環(huán)氧二十碳三烯酸的合成，參與冠心病進(jìn)展的調(diào)控〔19〕。CYP2C19編碼基因的許多多態(tài)性位點(diǎn)被鑒定是導(dǎo)致酶產(chǎn)物生物活性差異的主要因素，研究亦提示該基因位點(diǎn)的多態(tài)性與某些人群的冠心病發(fā)生率相關(guān)〔20〕。

本文人群與河南漢族〔21〕(P=0.894)、浙江漢族〔22〕(P=0.865)人群該基因分布亦無顯著差異。福建籍漢族健康人群〔6〕，年齡14～90歲，與本文研究人群相仿。將本文人群與該人群(無高血脂及高血壓患者)導(dǎo)致冠心病的危險(xiǎn)因素(高血脂、高血壓)用二分類Logistic回歸分析，結(jié)果兩組人群在高血脂和高血壓這兩種冠心病危險(xiǎn)因素的暴露情況無顯著差異(P=0.921)。本文CYP2C19*2及*3分布與健康人群分布無顯著差異，或許由于冠心病誘發(fā)因素多，同時(shí)受血清淀粉樣蛋白A表達(dá)基因、Tanis蛋白表達(dá)基因、三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)子A1基因等多態(tài)性共同影響，加之生活環(huán)境及飲食習(xí)慣等差異，使本文考察群體CYP2C19多態(tài)性與冠心病易感性無顯著關(guān)聯(lián)。

文獻(xiàn)〔6～17〕研究人群，除土耳其有部分普通感冒患者外，其余均為健康人群，各群體年齡分布與本文研究人群相似，而非洲、美洲、歐洲部分國(guó)家、地區(qū)人群CYP2C19基因頻率分布與本文存在顯著差異，表明該基因多態(tài)性分布具有民族、地域差異，提示在涉及該基因的物質(zhì)代謝研究及應(yīng)用過程中，需考慮不同的遺傳學(xué)背景。

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