范秀麗 卞翠翠 董 怡 楊 雷 姜 艷 岳 清 陳濤利 劉子玲

(吉林大學第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

腫瘤干細胞(CSC)在腫瘤細胞中所占比例極少，具有自我更新和多向分化潛能、高致瘤性、放化療抵抗性以及高侵襲性，可導致腫瘤復發(fā)轉移〔1，2〕。除常用的CD44、CD117和CD133等CSC表面標志外，乙醛脫氫酶1(ALDH1)日益受到關注。近年來研究發(fā)現(xiàn)ALDH1可作為肺癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌及頭頸部癌等多種 CSC 標志〔3，4〕，ALDH1作為卵巢癌干細胞的標志及其臨床意義的研究較少，本研究以卵巢癌細胞株(SKOV3)細胞為研究對象，研究 ALDH1在卵巢癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 Aldefluor試劑、表皮生長因子(EGF)、成纖維生長因子(bFGF)、B27、CD133、順鉑。人卵巢癌SKOV3細胞株由本實驗室傳代保存。

1.2 方法

1.2.1 人卵巢癌SKOV3細胞的培養(yǎng) 卵巢癌 SKOV3細胞株為貼壁生長細胞，培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的RPIM-1640培養(yǎng)液，37℃、含5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，平均2～3 d換液、傳代1次。取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)消化，當大量細胞變圓，細胞間隙變大時加入完全培養(yǎng)液終止消化，用吹打管輕輕吹打細胞，離心后重懸，使細胞為單細胞懸液狀態(tài)，用于實驗。

1.2.2 人卵巢癌懸浮細胞球的培養(yǎng) 取對數(shù)生長期 SKOV3細胞，0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)消化，無血清培養(yǎng)液(SFM)重懸，制成單細胞懸液，取2×105個細胞，接種于無血清加細胞因子(DMEM/F12+B27+EGF+bFGF)培養(yǎng)液。取6～7 d生長的細胞球，離心后0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)消化，進行第2、3、4代傳代，觀察計數(shù)。

1.2.3 四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)檢測卵巢癌SKOV3細胞及懸浮細胞球的體外增殖能力 取對數(shù)生長期卵巢癌SKOV3細胞及第2代培養(yǎng)6～7 d的懸浮細胞球，0.25%胰蛋白酶消化，重懸細胞，接種于96孔板。同時設置只加培養(yǎng)液的空白對照孔調零。共 7 塊培養(yǎng)板分別標記 1、2、3、4、5、6、7 d。按照標記每天取1塊板，每孔加入20 μ(15 mg/ml)的MTT。37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，加樣器小心吸棄孔內培養(yǎng)基。加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，室溫搖床振蕩10 min，使結晶物充分溶解。以空白對照孔調零，酶標儀上490 nm測定各孔吸光度值(OD值)，以相對應OD比值表示細胞增殖能力大小，各細胞亞群取8孔平均值。重復3次，繪制生長曲線，比較懸浮細胞球及SKOV3細胞體外增殖能力。

1.2.4 平板克隆形成實驗 取SKOV3細胞及第2代培養(yǎng)至第6～7天的懸浮細胞球，制備單細胞懸液，每孔200個細胞接種到6孔板中，每種細胞接種2孔。十字形輕輕搖動培養(yǎng)板，使細胞分散均勻，加入完全培養(yǎng)液。將培養(yǎng)板置于37℃、含5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 w，待出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2遍，室溫下干燥。甲醛固定15 min，棄去甲醛，干燥后用結晶紫染液染色5 min，流水緩慢洗去染液，干燥后顯微鏡下計數(shù)形成的克隆數(shù)(50個細胞為一個克隆)。實驗重復3次。按公式(平板克隆形成率=形成克隆數(shù)/接種細胞數(shù) ×100%)計算平板克隆形成率。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 用同樣方法制備單細胞懸液后接種細胞:在24孔板下室中加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基600 μl，放入已鋪膠的小室。加 200 μl細胞懸液于內室，于37℃、含5%CO2培養(yǎng)48 h。取出小室，用棉簽輕輕擦掉未穿過膜的細胞，小室底膜下室側附著的細胞用結晶紫染色。顯微鏡下隨機選取5個高倍視野計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)。重復3次。

1.2.6 Hoechst33342染液和Aldefluor染液雙染 取對數(shù)生長期SKOV3細胞，0.25%胰蛋白酶(含 0.01%EDTA)消化，1 000 r/min離心后重懸。蓋玻片置于6孔板中，2×105個細胞沿6孔板的側壁緩慢將細胞接種于板中，保證細胞均勻分散，加入培養(yǎng)液，過夜待細胞爬滿蓋玻片。棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖液沖洗2次，然后加入Hoechst44432染液，終濃度為10 μg/ml，避光，37℃孵育 15 min后棄去染液。Aldefluor試劑盒專用buffer沖洗 2次，加入 10 μl Aldefluor染色劑，37℃避光孵育45 min。暗室冰上棄去培養(yǎng)液，4℃PBS沖洗2次。封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7 流式細胞儀檢測 SKOV3細胞及懸浮細胞球 ALDH1high、CD133的表達 取對數(shù)生長期SKOV3細胞及傳至第2代生長至第6～7天懸浮細胞球，胰蛋白酶消化后1 000 r/min離心，4℃PBS沖洗2次，調整細胞數(shù)為1×106/ml。取 EP管，分別標記SKOV3細胞組和懸浮細胞球組及各自對應的實驗組和對照組，取1×106個細胞加入相應的 EP管中，各實驗組加入5 μl CD133抗體，對照組不加，室溫避光，孵育 30 min后，PBS沖洗1遍，置于冰上，待流式儀檢測。另外取離心后細胞，Aldefluor buffer重懸，調整細胞數(shù)為 1×106/ml，同樣標 SKOV3細胞組和懸浮細胞球組，并分別標記實驗組及對照組。在實驗組EP管中分別加入1 ml細胞懸液，在對照組 EP管中加入5 μl對二乙氨苯甲醛(DEAB)抑制劑，迅速蓋好 EP管的蓋子(DEAB溶解于95%的酒精里，應防止揮發(fā))。實驗組中加入5 μl活化的 Aldefluor，混勻后，立即轉移 0.5 ml混合液到對照組中(加 DEAB的試管)。因ALDH酶促反應迅速，在加入 Aldefluor試劑后應立即轉移0.5ml到加DEAB的對照EP管中。將實驗組和對照組EP管37℃孵育45 min后，1 000 r/min離心5 min。棄去上清液，Aldefluor緩沖液重懸細胞，后置于冰上。待流式細胞儀分析ALDH1high細胞比例。

1.2.8 體外化療實驗 取對數(shù)生長期卵巢癌SKOV3細胞，分別標記實驗組和對照組，在實驗組加入1 mg/ml的順鉑，培養(yǎng)72 h后撤藥。對照組加入相同體積的 PBS。撤藥后，PBS沖洗3次，0.25%胰蛋白酶消化液將細胞消化下來計數(shù)，實驗組和對照組分別取1×106個細胞，接種于培養(yǎng)瓶，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束后，0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)消化后，按1.2.7步驟進行 Aldefluor、CD133標記，流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以s表示，兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 卵巢癌SKOV3細胞懸浮球 卵巢癌 SKOV3細胞，在體外貼壁上皮樣生長，短梭形，可伸出不規(guī)則樹突樣偽足，胞漿內可見空泡樣顆粒。取對數(shù)生長期卵巢癌SKOV3細胞接種于無血清加細胞因子培養(yǎng)基中，大多數(shù)細胞死亡，小部分細胞懸浮生長，并很少數(shù)細胞貼壁生長，但隨著培養(yǎng)天數(shù)增加貼壁細胞消失。3～4 d可見少量細胞組成的懸浮細胞球，球體較少，其大小不等，形態(tài)不規(guī)則，細胞結合松散;第6～7天，懸浮細胞球增多，細胞結合緊密，球體增大，折光性好，形態(tài)變得規(guī)則。懸浮細胞球經(jīng)0.25%的胰蛋白酶(含 0.01%EDTA)消化3min后，重懸于SFM中培養(yǎng)，3～4 d左右仍可見不規(guī)則細胞球形成，6～7 d細胞球形態(tài)較規(guī)則，可以多次傳代培養(yǎng)。見圖1。

圖1 無血清培養(yǎng)的卵巢癌SKOV3懸浮細胞球

2.2 增殖克隆能力分析 MTT實驗和平板克隆實驗檢測卵巢癌SKOV3細胞及懸浮細胞球的自我增殖及克隆形成能力。連續(xù)檢測懸浮細胞球和SKOV3細胞7 d的OD值，第1～2天，OD值差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，第3天開始OD值差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。平板克隆實驗結果:細胞在6孔板中培養(yǎng)約2 w后，顯微鏡下觀察多數(shù)細胞克隆數(shù)＞50，按公式:平板克隆形成率=形成克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%，計算克隆形成率，懸浮細胞球和SKOV3細胞的克隆形成率分別為35.23±5.89%、20.32±6.42%。兩組細胞克隆形成率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 MTT檢測懸浮細胞球和SKOV3細胞7 d的OD值(s)

表1 MTT檢測懸浮細胞球和SKOV3細胞7 d的OD值(s)

時間 懸浮細胞球 SKOV3細胞 P值0.109±0.002 0.109±0.001 0.100第2天 0.194±0.016 0.190±0.023 0.394第3天 0.384±0.010 0.325±0.065 0.010第4天 0.504±0.075 0.454±0.042 0.001第5天 0.760±0.031 0.540±0.065 0.001第6天 0.844±0.094 0.653±0.091 0.009第7天第1天1.075±0.134 0.848±0.079 0.003

2.3 侵襲能力分析 通過Transwell侵襲實驗檢測懸浮細胞球細胞及SKOV3細胞的侵襲能力，任選5個高倍鏡視野計數(shù)結果顯示:懸浮細胞球細胞穿過膜數(shù)為237±37.42，SKOV3細胞穿膜數(shù)為87.8±32.13，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察卵巢癌SKOV3細胞中的ALDH1表達 倒置顯微鏡下，SKOV3細胞成多角梭形，少數(shù)細胞中可見多核，核質比例增大，ALDH1定位于 SKOV3細胞的胞質，鏡下可見多數(shù) SKOV3細胞胞質為綠色熒光，但熒光強度很弱;ALDH1活性越高，其胞質內產(chǎn)生的熒光底物就越多，細胞熒光強度就越強。經(jīng)Hoechst 33342和 Aldeflour雙染后，SKOV3細胞輪廓清晰，胞質區(qū)和細胞核區(qū)熒光強弱對比明顯。SKOV3細胞核經(jīng) Hoechst 33342染色后顯示為藍色熒光，而 ALDH1high細胞核不被染色。

2.5 流式細胞儀檢測 ALDH1high細胞、CD133+細胞比例 應用Aldeflour試劑流式細胞技術分析卵巢癌SKOV3細胞及懸浮細胞球結果顯示，ALDH1high細胞為綠色熒光，在卵巢癌SKOV3細胞中所占比例較低，僅占4.08±0.29%，CD133+細胞比例為1.21±0.34%。無血清懸浮培養(yǎng)傳至第2代培養(yǎng)6～7 d懸浮細胞球流式檢測結果顯示，ALDH1high細胞的比例為 22.42±2.42%，CD133+細胞比例為10.34±0.17%，在懸浮細胞球中ALDH1high細胞、CD133+細胞比例明顯增高，與普通培養(yǎng)的 SKOV3細胞相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.6 體外化療實驗 順鉑連續(xù)作用于卵巢癌SKOV3細胞72 h后撤藥，10%胎牛血清完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后流式檢測結果發(fā)現(xiàn)，ALDH1high、CD133+細胞比例明顯增加，分別為17.25% ±3.26%和4.04% ±0.86%，ALDH1high細胞比例增加了3.23倍，CD133+細胞比例增加了2.34倍，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

ALDH1屬ALDH家族之一。人類的ALDH1基因表達存在于細胞質中，其基因定位于9q21染色體，是催化細胞內乙醛氧化為乙酸的細胞溶質酶，并通過氧化視黃醇為視黃酸參與多種組織的分化與基因表達。研究顯示ALDH1在多種組織類型的CSC高表達，而高表達ALDH1的細胞具有干細胞的特性。目前，ALDH1已作為功能性標志物應用于多種實體CSC的分離和鑒定，證實了ALDH1在腫瘤生物學行為中發(fā)揮著重要作用。

Martens等〔5〕利用無血清加EGF和bFGF的培養(yǎng)基培養(yǎng)正常腦組織中神經(jīng)干細胞，發(fā)現(xiàn) bFGF反應性細胞在 bFGF作用下進行自我更新，并生成具有EGF反應性的干細胞，而EGF反應性干細胞在EGF作用下進行自我增殖，并通過不對稱分裂來生成具有bFGF反應性的神經(jīng)干細胞，因此只有干細胞才能在SFM中生長，而大部分細胞死亡。

依據(jù)卵巢癌干細胞不同的標志及干細胞特性在卵巢癌組織、腹水和卵巢癌細胞系中均分離出了干細胞樣細胞，現(xiàn)在文獻報道的可作為卵巢癌干細胞標志物有CD133、CD44、CD117、CD24等。ALDH1在多種CSC中高表達，ALDH1首先被用于白血病干細胞的分離與鑒定〔6〕。Landen等〔7〕研究證實 ALDH1在卵巢腫瘤組織及細胞系中均有表達，卵巢癌細胞系中分離出的ALDH1+細胞比陰性細胞更具有化療抵抗性及致瘤性。另外一項研究證實在紫杉醇和順鉑耐藥的細胞中 ALDH1高表達，在卵巢癌耐藥A2780細胞株中分離出的ALDH1+陽性細胞的致瘤能力是ALDH1－細胞的50倍，ALDH1+細胞可產(chǎn)生ALDH1+和 ALDH1－細胞，而 ALDH1－細胞卻不能產(chǎn)生 ALDH1+細胞〔7〕，這些特性與CSC的特性一致。Silva研究發(fā)現(xiàn) ALDH聯(lián)合CD133能更加有效的分離卵巢癌干細胞，ALDH+CD133+細胞比ALDH+CD133－細胞具有更強的異體移植成瘤能力，且ALDH+CD133+細胞可分化為 ALDH+/-CD133+/－四種類型的細胞，而無論來自腫瘤組織或者是細胞系的CD133－細胞均不能分化為CD133+細胞〔8〕。本研究結果顯示ALDH1high細胞比例是CD133+細胞比例的2倍以上。懸浮細胞球高表達CSC標志CD133，因此說明了懸浮細胞球富集了大量干細胞，本研究為懸浮細胞球中干細胞數(shù)量提供了實驗依據(jù)。無論是CD133+細胞還是ALDH1high細胞均在懸浮細胞球中富集，說明ALDH1high細胞和CD133+細胞一樣，可作為卵巢癌干細胞的標志。

ALDH1不僅可作為CSC的標志，而且還提示預后不良，與腫瘤細胞耐藥有一定的關系。Kryczek等〔9〕通過基因敲除發(fā)現(xiàn)，在肺癌細胞中 ALDH1A1和 ALDH3A1與環(huán)磷酞胺耐藥有關。而卵巢癌細胞系中敲出ALDH1基因可以恢復腫瘤細胞對化療的敏感性〔10〕。通過分析多種卵巢癌細胞系發(fā)現(xiàn)，在紫杉醇和鉑類耐藥細胞株中 ALDH1高表達，并且在臨床標本中ALDH1陽性細胞數(shù)量與患者無進展生存期呈負相關〔7〕。本研究結果可知ALDH1high細胞和CD133+細胞比陰性細胞更具生存能力，因此化療后 ALDH1high細胞和 CD133+細胞得到富集。ALDH1high細胞比例增加幅度高于 CD133+細胞，這可能提示ALDH1high細胞耐藥性高于CD133+細胞，也可能提示在卵巢癌干細胞分化等級中 ALDH1high細胞和CD133+細胞處于不同等級，但仍需更多的研究證實。

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