趙凌杰 張蓓蓓 趙智明 張靜 郭郡浩

心肌纖維化是諸多心血管疾病共同的病理改變，可引起慢性心力衰竭和惡性心律失常，其重要特征是肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MFB）表型分化及持續(xù)活化[1]。Rho/ROCK信號(hào)通路廣泛參與多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞收縮、肌動(dòng)蛋白骨架重組、黏附、遷移、增殖、分裂和基因表達(dá)等。大量研究表明，Rho/Rho激酶信號(hào)通路介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組在MFB表型分化、收縮和遷移等行為中具有重要作用[2-3]，故阻斷 Rho/Rho激酶信號(hào)通路是治療心肌纖維化的重要目標(biāo)[4]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，Rho激酶非選擇性抑制劑法舒地爾具有良好的抗心肌纖維化效果[5]。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步觀察法舒地爾對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心臟MFB分化的影響及機(jī)制，探究法舒地爾抑制心肌纖維化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品及主要試劑

SPF級(jí)6周齡雄性SD大鼠50只，體重（180±20）g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號(hào)：SYXK（蘇）2003-0032]。鹽酸法舒地爾注射液（2 ml：30 mg）由天津紅日藥業(yè)股份有限公司惠贈(zèng)，羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）測(cè)定試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司，血管緊張素Ⅱ（angiotensionⅡ，AngⅡ）Elisa試劑盒購自上海雅吉生物公司，磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶蛋白亞基1（phosphorylated myosin phosphatase target subunit 1，p-MYPT1）一抗購自北京博奧森生物公司，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）一抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 心肌纖維化模型制備

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，造模手術(shù)前禁食12 h，自由飲水。給大鼠編號(hào)，按照隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)取8只為Sham組，42只為手術(shù)組。用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉。常規(guī)備皮消毒，于劍突下沿腹正中線逐層開腹，在腎動(dòng)脈上方分離腹主動(dòng)脈。手術(shù)組按照Anversa等[6]的方法用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)制備壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化模型，在腎動(dòng)脈上方0.5 cm用直徑0.7 mm銀夾夾閉，使腹主動(dòng)脈縮窄60% ～70%，而 Sham組不予夾閉腹主動(dòng)脈。確認(rèn)無出血，關(guān)閉腹腔。術(shù)后禁食6 h，并給予青霉素10萬U/kg肌注3 d預(yù)防感染。

1.3 分組及藥物干預(yù)

術(shù)后4周末共有36只大鼠存活，手術(shù)組死亡14只，Sham組無死亡。將手術(shù)組大鼠按照隨機(jī)數(shù)表法分為：Model組（10只）、FH 組（9只）和 FL組（9 只），分別經(jīng)腹腔注射生理鹽水 2 ml·kg-1·d-1、法舒地爾 30 mg·kg-1·d-1和法舒地爾10 mg·kg-1·d-1。Sham 組（8 只）經(jīng)腹腔注射生理鹽水2 ml·kg-1·d-1。術(shù)后8周末共有31只大鼠存活，手術(shù)組死亡5只（Model組3只、FH組和FL組各1只），死亡原因主要為嚴(yán)重心力衰竭。

1.4 標(biāo)本采集及心肌病理形態(tài)分析

所有大鼠麻醉后打開胸腔，心臟穿刺收集血液5～10 ml以4 000 rpm離心10 min后取上清（血漿樣品）。迅速剪取心臟，除去心房及右心室游離壁，僅保留左心室及室間隔。透壁剪取左室心尖部分組織投入液氮中，其余組織放于4℃的4%多聚甲醛中固定24 h。常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋，沿左室長(zhǎng)軸線每隔1 mm橫斷面切取數(shù)張4 μm厚的切片，行HE和Masson染色。光鏡下觀察組織形態(tài)，采用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定纖維化面積。以視野中所有藍(lán)色膠原（Masson染色：膠原纖維呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞呈紅色）面積之和（不包括血管周圍膠原面積）除以心肌纖維和結(jié)締組織面積總和，計(jì)算左心室間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CⅤF）。以血管周圍膠原面積除以血管面積，計(jì)算血管周圍膠原容積分?jǐn)?shù)（perivascular collagen volume fraction，PCⅤF）。

1.5 心肌HYP含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取60 mg液氮中心肌組織放入試管中，按照HYP試劑盒說明書以堿水解法提取蛋白，比色法檢測(cè)樣本吸光度，計(jì)算HYP含量。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)心肌和血漿AngⅡ濃度

取凍存的心肌組織50～100 mg，研磨成勻漿，4 000rpm離心10 min，取上清。分別測(cè)定血漿和心肌樣品中總蛋白的濃度。再按照Elisa試劑盒說明書，測(cè)定樣品中AngⅡ的濃度。結(jié)果以測(cè)定蛋白濃度與總蛋白濃度的比值來表示。

1.7 免疫組化染色分析心肌 p-MYPT1、α-SMA、TGF-β1和OPN的表達(dá)

切片烘烤后，常規(guī)二甲苯脫蠟及乙醇梯度脫水，檸檬酸鹽抗原修復(fù)緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)。滅活過氧化物酶，加入一抗孵育過夜，加入HRP標(biāo)記二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水并封片。光鏡下觀察組織細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況，細(xì)胞質(zhì)中黃色為表達(dá)陽性，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野拍照。用Image-Pro Plus 6.0測(cè)量這些區(qū)域的平均光密度（MOD），即陽性累積光密度除以照片面積。因?yàn)棣?SMA還表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞，計(jì)算時(shí)選擇血管平滑肌細(xì)胞外區(qū)域進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 法舒地爾對(duì)大鼠心肌病理形態(tài)的影響

圖1（HE染色）和圖2（Masson染色）顯示了各組大鼠心肌病理學(xué)改變，與Sham組比較，Model組心肌纖維明顯增粗且排列紊亂，間質(zhì)和血管周圍大量藍(lán)色膠原沉積。與Model組比較，F(xiàn)H組心肌組織情況明顯改善，接近Sham組，F(xiàn)L組心肌纖維增粗、紊亂，間質(zhì)和血管周圍膠原沉積，但較Model組減輕。

2.2 法舒地爾對(duì)大鼠心肌纖維化程度的影響

心肌HYP含量及Masson染色藍(lán)色膠原的面積分?jǐn)?shù)可反映心肌纖維化程度，其中CⅤF和PCⅤF可分別用于評(píng)估間質(zhì)纖維化和血管周圍纖維化程度。如表1所示，與Sham組比較，Model組心肌HYP含量、CⅤF及PCⅤF顯著升高（P ＜0.01），心肌纖維化程度明顯加重。與Model組比較，F(xiàn)H組和FL組心肌HYP含量、CⅤF及PCⅤF均不同程度的降低（P＜0.05或P＜0.01），心肌纖維化程度均有所減輕。

圖1 各組大鼠心肌病理學(xué)改變HE染色（×400）

圖2 各組大鼠心肌病理學(xué)改變Masson染色（×200）

表1 各組大鼠心肌HYP含量、CⅤF和PCⅤF比較（）

表1 各組大鼠心肌HYP含量、CⅤF和PCⅤF比較（）

注：與Sham組比較，aP＜0.01，與Model組比較，bP ＜0.05，cP ＜0.01

組別 只數(shù) HYP（μg/g） CⅤF（%） PCⅤF（%）Sham組 8 456.95±125.09 1.74±0.38 22.98±3.23 Model組 7 858.58±144.95a5.99±0.49a 89.83±3.54a FH組 8 539.46± 73.49c2.13±0.71c 49.43±2.41c FL組 8 695.30± 86.26b5.39±0.43b 84.08±6.29b F值 52.64 136.18 438.75 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 法舒地爾對(duì)大鼠血漿和心肌AngⅡ含量影響

酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)結(jié)果如表2所示，與Sham組比較，Model組大鼠血漿和心肌AngⅡ含量顯著升高（P＜0.01）；與Model組比較，F(xiàn)H組和FL組大鼠血漿和心肌AngⅡ的含量均顯著降低（P＜0.05或P ＜0.01）。

表2 各組大鼠血漿和心肌AngⅡ含量（）

表2 各組大鼠血漿和心肌AngⅡ含量（）

注：與Sham組比較，aP＜0.01，與Model組比較，bP＜0.05，cP ＜0.01

組別 只數(shù) 血漿AngⅡ（ng/L） 心肌AngⅡ（ng/L）Sham組 8 41.93±8.26 14.31±2.91 Model組 7 85.16±8.86a 30.85±7.12a FH組 8 43.71±7.70c 13.82±1.53c FL組 8 57.23±8.53c 19.93±2.03b F值 42.09 30.30 P值 0.000 0.000

2.4 法舒地爾對(duì)大鼠心肌組織p-MYTP1、α-SMA、TGF-β1和OPN表達(dá)的影響

免疫組化染色結(jié)果如表3、圖3～圖6所示，與Sham組比較，Model組大鼠心肌 p-MYPT1、α-SMA、TGF-β1和OPN棕黃色區(qū)域明顯增多，MOD值顯著升高（均為P＜0.01）。與 Model組比較，F(xiàn)H組和FL 組大鼠心肌 p-MYPT1、α-SMA、OPN 和TGF-β1棕黃色區(qū)域明顯減少，MOD值均顯著下降（均為P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠心肌p-MYTP1、α-SMA、OPN和TGF-β1免疫染色MOD值的比較（xˉ±s）

圖3 各組大鼠心肌p-MYTP1免疫組化染色（×400）

圖4 各組大鼠心肌α-SMA免疫組化染色（×400）

圖5 各組大鼠心肌TGF-β1免疫組化染色（×400）

圖6 各組大鼠心肌OPN免疫組化染色（×400）

3 討論

Rho激酶是最早發(fā)現(xiàn)的Rho蛋白效應(yīng)分子，通過磷酸化一系列蛋白，如MYPT1（故p-MYPT1水平可以反映Rho激酶活性）、肌球蛋白輕鏈磷酸酶、LIM激酶、絲切蛋白、內(nèi)收蛋白、埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白（ERM家族）及蛋白激酶A、蛋白激酶C、蛋白激酶G等其他絲氨酸-蘇氨酸激酶，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架，參與細(xì)胞形狀改變、遷移、增殖和凋亡等行為[7]。Rho激酶信號(hào)途徑的異常激活與各種心血管疾病密切相關(guān)，如高血壓、冠狀動(dòng)脈痙攣、動(dòng)脈粥樣硬化和心力衰竭等。抑制Rho激酶是許多傳統(tǒng)心血管藥物共同的目標(biāo)之一[8]。近年來研究較多的他汀類藥物除具有調(diào)脂作用外，對(duì)心肌纖維化亦有很好的抑制作用，其機(jī)制主要與阻斷Rho/Rho激酶信號(hào)通路有關(guān)[9]。

MFB表型分化是組織損傷修復(fù)和纖維化的標(biāo)志性環(huán)節(jié)，MFB是最主要的膠原合成細(xì)胞，其兼有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的特征，特征性地表達(dá)α-SMA。正常心臟中，MFB僅存在于瓣葉，故α-SMA表達(dá)陽性的間質(zhì)細(xì)胞一般見于疾病狀態(tài)下[10]。MFB內(nèi)包含α-SMA的肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維（微絲束）既是重要的細(xì)胞骨架成分，也是MFB強(qiáng)大收縮性能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。應(yīng)力纖維成分纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-肌動(dòng)蛋白）是由單體肌動(dòng)蛋白（G-肌動(dòng)蛋白）聚合形成的。Rho激酶為肌動(dòng)蛋白聚合和重組提供動(dòng)力[11]，因此是CFB向MFB轉(zhuǎn)化過程必不可少的物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用腹主動(dòng)脈縮窄法建立壓力超負(fù)荷模型，8周后，Model組大鼠血漿和心肌AngⅡ濃度明顯升高，HYP含量、CⅤF和PCⅤF也顯著升高，表明成功復(fù)制心肌纖維化模型。同時(shí)，心肌間質(zhì)α-SMA和p-MYPT1的表達(dá)水平顯著升高，提示大鼠心肌發(fā)生了MFB表型分化和Rho激酶信號(hào)途徑的異常激活。用法舒地爾抑制Rho激酶活性后 （p-MYPT1表達(dá)降低），大鼠心肌纖維化程度改善，間質(zhì)α-SMA的表達(dá)下降，表明Rho激酶與MFB表型分化密切相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

雖然目前對(duì)MFB的來源還存在很大爭(zhēng)議（循環(huán)中的細(xì)胞、動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞及循環(huán)中的骨髓干細(xì)胞都可能是MFB的前體細(xì)胞），但普遍認(rèn)為，MFB分化主要受局部炎癥反應(yīng)、機(jī)械應(yīng)力及各種體液因子的誘導(dǎo)。其中，TGF-β1是公認(rèn)的促分化因子，常作為MFB相關(guān)研究的工具[12]?；罨?TGF-β1可通過 Smads、Ras/ERK/MAPK 相關(guān)激酶或者與其他轉(zhuǎn)錄因子的交聯(lián)促進(jìn)MFB表型分化。OPN是細(xì)胞外基質(zhì)非結(jié)構(gòu)蛋白——基質(zhì)細(xì)胞蛋白的一員，能通過多種途徑發(fā)揮促心肌纖維化作用。Lenga等[13]研究發(fā)現(xiàn)，OPN在MFB主要結(jié)構(gòu)黏著斑復(fù)合體形成過程中是必需的。Chen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，分泌OPN片段（SⅤⅤYGLR序列）的成肌細(xì)胞移植可通過激活 TGF-β/Smads信號(hào)通路，誘導(dǎo)MFB分化，明顯減輕大鼠心肌梗死后纖維化程度。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，法舒地爾在抑制心肌α-SMA表達(dá)的同時(shí)，TGF-β1和OPN的表達(dá)亦顯著降低，故推測(cè)TGF-β1和OPN對(duì)Rho激酶介導(dǎo)的MFB分化可能有促進(jìn)作用。

綜上，Rho激酶抑制劑法舒地爾改善壓力超負(fù)荷大鼠心肌纖維化的作用，可能與抑制心肌MFB表型分化有關(guān)。