袁衛(wèi)東，陸 娜，陳 青，宋吉玲，王偉科

（1.杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，杭州 310024；2.浙江省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，杭州 310020）

灰樹花（Grifola frondosa，maitake）是一種食、藥兼用的珍稀蕈菌［1］，野生灰樹花常生長于栗樹周邊，俗稱“栗蘑”.子實體香氣宜人，口感嫩脆鮮美；同時藥用價值極高，主要用于消化道、乳腺及前列腺等癌癥的治療，此外也用于血管硬化、血壓增高及心臟等疾病的治療，因此具有良好的開發(fā)前景［2］.

選育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強的灰樹花品種，提高其經(jīng)濟效益，一直是灰樹花遺傳育種工作研究的重點［3］.轉(zhuǎn)錄組學研究作為一種快速、高通量、全面解讀食用真菌的全新技術(shù)手段，已經(jīng)被越來越廣泛地應用于食用菌的遺傳育種工作中［4］.食用菌轉(zhuǎn)錄組的研究，可從整體水平上發(fā)掘食用菌藥用成分生物合成途徑中的關(guān)鍵基因，確定有效藥用活性成分的合成途徑及其調(diào)控機制，為食用菌功能基因的挖掘、品種鑒定、資源保護和種質(zhì)繁育提供新的思路和方法［5］.

我們通過對灰樹花子實體轉(zhuǎn)錄組的測序研究，篩選出灰樹花子實體成熟期特異表達基因，并對這些表達的基因進行生物信息學分析，旨在發(fā)現(xiàn)灰樹花子實體生長過程中的相關(guān)基因，為通過基因工程培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的灰樹花新品種提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試材

供試菌株為灰樹花小黑汀，引自山東泰安.菌絲長滿菌包后移入出菇大棚培養(yǎng)7～10d，待菌絲扭結(jié)形成原基后25d左右形成成熟的灰樹花子實體，收集成熟的子實體樣品.

1.2 方法

1.2.1 灰樹花子實體總RNA 提取及測序

用TRIzol法提取灰樹花子實體總RNA，并用RNAeasy plant mini kit對提取的總RNA進行純化，70℃變性2min后，NanoDrop ND－2000檢測其濃度、瓊脂糖凝膠電泳分析RNA 的完整性［6］.檢測合格的RNA 用于mRNA的富集及cDNA的合成.用Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina進行文庫構(gòu)建，純化后Agilent High Sensitivity DNA Kit檢測文庫插入片段大小，定量后Illumina HiSeqTM2000對建好的測序文庫進行測序［7］.

1.2.2 測序數(shù)據(jù)分析

使用Trinity（版本r20131110，默認參數(shù)）對RNA－seq的原始reads數(shù)據(jù)進行拼接，最短contig長度為200.對Trinity拼接結(jié)果使用Cap3進行進一步拼接獲得Unigene［8］.

1.2.3 Unigene的NR 數(shù)據(jù)庫比對分析

利用Blast進行Unigene的NR 數(shù)據(jù)庫物種分布比對分析［9］，統(tǒng)計Blast結(jié)果中每個能比對上的物種所對應的Unigene數(shù)目，按該數(shù)目從高到低進行排序，選取數(shù)目較高的前10個物種，其他比對上的物種對應的Unigene數(shù)目相加作為others，沒有比對上的物種的Unigene數(shù)目相加則是unmatched.

1.2.4 Unigene的GO 分類

根據(jù)NR 注釋信息，對Unigene進行GO 注釋［10］（Blast2GO），得到每個Unigene的GO 注釋.并對所有Unigene做GO 功能分類統(tǒng)計（WEGO），從細胞組成、分子功能及生物過程（biological process）三方面認識灰樹花的基因功能分布特征.

1.2.5 Unigene的COG 功能注釋

將Unigene和COG 數(shù)據(jù)庫（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／bwrpsb／bwrpsb.cgi）比對分析，預測Unigene功能并對其分類統(tǒng)計，這有利于我們進一步了解灰樹花各Unigene的生物學功能.

1.2.6 Unigene的代謝通路分析

使用http：∥www.genome.jp／tools／kaas／對Unigene進行KEGG 注釋，以便于進一步研究灰樹花基因在生物學上的復雜行為，系統(tǒng)分析其基因在細胞中的代謝通路及功能.

1.2.7 Unigene的SSR 信息分析

對拼接得到Unigene進行SSR 簡單重復序列的查找.篩選標準：單核苷酸重復的次數(shù)在10次或10次以上，二核苷酸重復的次數(shù)在6次或6次以上，三至六核苷酸重復的次數(shù)在5次或5次以上.同時，也篩選中間被少數(shù)堿基（間隔小于100或等于100）打斷的不完全重復的SSR.利用MISA（http：∥pgrc.ipkgatersleben.de／misa／）工具提供批量識別和定位簡單重復序列（SSR）.

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取及Unigene的組裝

灰樹花子實體RNA 經(jīng)過NanoDrop定量后，獲得濃度為381.1ng／μL 的總RNA，260／280為2.12.完整性及28S∶18S（圖1）均符合轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量要求，進入下一步實驗.利用Trinity對RNA－seq的原始reads數(shù)據(jù)進行拼接，獲得的contig進一步拼接獲得Unigene.最終，我們獲得63 137個Unigene，資料組總長度155 171 094nt，最長Unigene 20 996nt，最短Unigene 201nt，平均組裝長度為2 457.689nt，（G＋C）／（A＋T＋G＋C）為0.522，N50為3 405nt，N90為1 390nt.

圖1 灰樹花子實體RNA 電泳檢測Fig.1 The electrophoresis detection of maitake RNA

圖2 Unigene長度分布統(tǒng)計Fig.2 Length distribution of maitake Unigene

從Unigene的長度分布來看，Unigene主要集中在1 500～10 000nt之間（圖2）.在2 000～3 000nt之間的Unigene數(shù)量最多為13 135個，占總數(shù)的20.8%；1 500～2 000nt之間Unigene數(shù)為8 979，占總數(shù)的14.2%；3 000～4 000nt之間Unigene數(shù)為7 429，占11.76%.

2.2 Unigene的NR 數(shù)據(jù)庫比對分析

將Unigene序列和NR 數(shù)據(jù)庫進行Blast（參數(shù)為1.0×10－5）比對分析，能比對上的Unigene個數(shù)為46 640 個，占總的Unigene數(shù)目的百分比為73.87%.按物種分布統(tǒng)計，能比對上的物種所對應的Unigene數(shù)目最多的是變色栓菌，比對上的Unigene數(shù)為14 593 個，占31.29%，其次為木質(zhì)素降解菌，比對上的Unigene數(shù)為9 220個，占19.77%（表1）.

表1 灰樹花Unigene的NR 數(shù)據(jù)庫比對分析Tab.1 Blast results of maitake Unigene via NR

2.3 Unigene的GO 分類

對Unigene進行GO 注釋和GO 功能分類.最終（圖3），在細胞組成（Cellular component）、分子功能（Molecular function）、生物過程（Biological process）3 個本體中，分別獲得9，12，14個注釋條目（Class）數(shù).注釋到的Unigene數(shù)量最多的是生物過程本體，注釋到的Unigene數(shù)最少的是細胞成分本體.

圖3 灰樹花Unigene的GO 分類Fig.3 Gene ontology classifications of maitake Unigene

2.4 Unigene的COG 分類

將所測物種的最佳蛋白序列提交到NCBI上（COG－4873PSSMs，E－value 0.01，Maximum number of hits 500），得到與Unigene編號相對應的COG 編號，統(tǒng)計COG 每個類別Unigene數(shù)目.從基因數(shù)量分布來看（圖4），分類最多的是功能預測蛋白，其他較多的分類與基因的功能與糖轉(zhuǎn)運與代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝、翻譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)換、分子伴侶有關(guān).

圖4 灰樹花Unigene的COG 分類Fig.4 COG functional classifications of maitake Unigene

2.5 Unigene的代謝通路分析

KEGG 數(shù)據(jù)庫（http：∥www.genome.jp／kegg／）可系統(tǒng)分析其基因在細胞中的代謝通路及功能.通過KEGG 注釋，共有27 472 個Unigene被注釋，被Unigene注釋到的代謝通路有239個，注釋最多的代謝通路與生化代謝、微生物代謝、次生代謝產(chǎn)物生物合成、嘌呤代謝、RNA 運輸?shù)扔嘘P(guān)（表2，注釋到基因數(shù)前10位代謝通路）.

2.6 Unigene的SSR 信息分析

表2 KEGG 注釋比例最多的前10位代謝通路Tab.2 The top 10pathways annotated by KEGG

從灰樹花63 137個Unigene中查找到5 294個SSR位點，占Unigene總數(shù)的比例為8.38%（表3）.SSR 存在較為豐富的類型，包括單核苷酸重復類型至六核苷酸重復類型均有表現(xiàn)（表4）.其中，單核苷酸重復所占比例最高，達到63.4%，其次是三核苷酸重復，為24.44%，雙核苷酸重復，比例為8.76%；比例最低的是六核苷酸重復，僅為0.11%，四核苷酸重復和五核苷酸重復基本相同，分別為1.81%和1.42%.在檢出的SSR 中，出現(xiàn)頻率最高的重復基元為A／T（占56.10%），其次為CCG／CGG（6.18%），AG／CT（3.29%），ACAGG／CCTGT（1.28%），AATG／ATTC（0.62%），AACAGC／CTGTTG（0.11%）.上述SSR 特征分析，有助于開展灰樹花及其同屬物種的基因組差異分析、通用性標記開發(fā)和遺傳圖譜構(gòu)建研究.

表3 灰樹花的SSR 信息分析Tab.3 General statistics of maitake SSR search

表4 灰樹花SSR 基序重復類型統(tǒng)計Tab.4 Statistics of repeat type of maitake SSR motif

3 討論

對灰樹花全基因組而言，其轉(zhuǎn)錄組序列不含內(nèi)含子及其它非編碼序列，能更高效的挖掘有用信息，在序列分析方面具有性價比高的優(yōu)勢.轉(zhuǎn)錄組研究可識別灰樹花子實體總轉(zhuǎn)錄本的表達，從而了解灰樹花子實體完整的基因表達譜，為灰樹花具有生物功能的“蛋白質(zhì)組”研究的必然紐帶.基于灰樹花總轉(zhuǎn)錄水平的研究是目前研究最廣泛的調(diào)控研究方式［11］.

本研究構(gòu)建了第一個高質(zhì)量灰樹花cDNA 文庫，首次采用了Illumina高通量測序技術(shù)對文庫進行了測序，序列拼接后得到63 137個Unigene.將Unigene序列和NR 數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，能比對上的Unigene占總Unigene數(shù)的73.87%.COG 分類顯示，最多一類基因是功能預測蛋白，其他較多基因功能與糖轉(zhuǎn)運與代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝、翻譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)換、分子伴侶有關(guān).該結(jié)果顯示，利用高通量測序不僅可監(jiān)測灰樹花特定時間段的基因表達，更可大量挖掘其代謝過程中的重要基因.

根據(jù)KEGG 代謝通路數(shù)據(jù)庫，對所得灰樹花轉(zhuǎn)錄組的Unigene進行代謝通路注釋和預測，共有27 472個Unigene被注釋，被Unigene注釋到的代謝通路有239個，該類基因參與了灰樹花子實體體內(nèi)的生化合成和次生產(chǎn)物代謝，研究該類基因，將為開展灰樹花基因克隆、功能基因驗證等分子手段提供生物信息學基礎(chǔ).

本次試驗通過SSR 位點查找共發(fā)現(xiàn)5 294個SSR 位點，利用SSR 位點，篩選目的條帶清晰、多態(tài)性好的引物，從而為分析灰樹花群體遺傳多樣性、構(gòu)建灰樹花遺傳連鎖圖譜、進行灰樹花的分子育種奠定基礎(chǔ).

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