蔣鵬，洪璇，2，趙春貴，楊素萍

（1.華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門(mén)361021；2.廈門(mén)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 藥學(xué)系，福建 廈門(mén)361008）

集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，水體殘餌、藥物、代謝和排泄物以及其他有機(jī)物的滯留和沉積，造成了NH3－N，NO－2－N，H2S和藥物殘留等有害污染物的形成，嚴(yán)重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展［1－2］.如何盡快去除水體中NH3－N和NO－2－N等有毒有害物質(zhì)一直備受關(guān)注［3］.不產(chǎn)氧光合細(xì)菌（anoxygenic phototrophic bacteria，APB）在水產(chǎn)養(yǎng)殖和水體氮素污染控制等方面已有廣泛的研究和應(yīng)用［4］.菌種（株）不同，對(duì)無(wú)機(jī)三態(tài)氮的代謝能力以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力也不同，如RhodobactersphaeroidesP4［5］和Rhodopseudomonassp.wps［6］能在氨氮存在時(shí)去除水體中的硝氮和亞硝氮，RhodopseudomonaspalustrisPS1［7］則不能去除亞硝氮.某些菌株如RhodobactercapsulatusE1F1［8］能以硝酸鹽為唯一氮源生長(zhǎng)，但能以亞硝酸鹽為唯一氮源生長(zhǎng)并高效去除亞硝氮的APB菌株鮮有報(bào)道，僅本課題組報(bào)道了一株海洋著色菌MarichromatiumgracileYL28［9－10］.關(guān)于光、氧、pH值和溫度等環(huán)境因素以及不同碳源對(duì)APB菌株，如Rhodobactersphaeroide2－8［11］和Rhodopseudomonassp.wps［12］去除無(wú)機(jī)三態(tài)氮的影響已有較多報(bào)道，表明環(huán)境因素和營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)對(duì)微生態(tài)制劑的功效有明顯影響，但還未見(jiàn)APB靜息細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)三態(tài)氮的去除和轉(zhuǎn)化能力的系統(tǒng)報(bào)道.靜息細(xì)胞代謝主要是指限制性非生長(zhǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)酶的代謝，靜息細(xì)胞法已在生物和醫(yī)學(xué)方面有廣泛應(yīng)用［13］.在水體環(huán)境中，APB制劑的菌體可能處于水體底部黑暗厭氧環(huán)境中，即使溫度和pH值適宜，菌體也生長(zhǎng)緩慢，似靜息細(xì)胞，在此環(huán)境中APB是否具有無(wú)機(jī)三態(tài)氮轉(zhuǎn)化能力，目前還不清楚.YL28菌株能以亞硝氮為唯一氮源生長(zhǎng)，具有良好去除無(wú)機(jī)三態(tài)氮和環(huán)境適應(yīng)能力［9－10］.因此，本文研究了YL28菌株靜息細(xì)胞厭氧去除和轉(zhuǎn)化無(wú)機(jī)三態(tài)氮的能力.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

海洋著色菌MarichromatiumgracileYL28菌株，16SrRNA基因GenBank登錄號(hào)為JF719917，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存.氯化銨、亞硝酸鈉和硝酸鉀為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純?cè)噭宦然?、氫氧化鉀、酒石酸鉀鈉、鹽酸萘乙二胺、磷酸氫二鉀等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

UV－3200PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美普達(dá)MAPADA公司）；TGL－20M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀公司）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌體的培養(yǎng)與靜息細(xì)胞的制備 采用改良的Pfennig紫色硫細(xì)菌無(wú)機(jī)選擇性培養(yǎng)基［14］，添加24.3mmol·L－1無(wú)水乙酸鈉，0.75mmol·L－1Na2S2O3取代1.5mmol·L－1Na2S·9H2O，調(diào)節(jié)pH值為7.0.接種量為5%（體積濃度），接種后用無(wú)菌培養(yǎng)基充滿(mǎn)培養(yǎng)瓶，于28℃，3 000lx光照厭氧培養(yǎng)5d.無(wú)菌操作，高速離心，收集菌體，用pH值為7.0，質(zhì)量濃度為3%的NaCl溶液洗滌菌體3次，并制備成光密度D（660）約為1.3的菌種懸液，在28℃靜置孵育48h即為靜息細(xì)胞懸液，使用時(shí)準(zhǔn)確測(cè)量.

1.2.2 實(shí)驗(yàn)體系的設(shè)置 精確稱(chēng)量，配制無(wú)機(jī)氮（氯化銨、亞硝酸鈉和硝酸鉀）儲(chǔ)備液，調(diào)整pH值為7.0，用二次水定容，過(guò)濾除菌，其氮素質(zhì)量濃度均為30.00g·L－1.

在靜息細(xì)胞懸液中添加無(wú)機(jī)氮儲(chǔ)備液，配制成含有不同無(wú)機(jī)氮（氯化銨、亞硝酸鈉、硝酸鉀和無(wú)機(jī)三態(tài)氮共存）的菌懸液體系，用質(zhì)量濃度為3%的NaCl溶液補(bǔ)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶，旋緊瓶蓋，將培養(yǎng)瓶置于28℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng).菌懸液體積為310mL，溶液起始pH值為7.0，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，定時(shí)取樣1 mL，用于無(wú)機(jī)三態(tài)氮質(zhì)量濃度和生物量的測(cè)定.

1.2.3 生物量和無(wú)機(jī)三態(tài)氮的測(cè)定 采用比濁法測(cè)定生物量，以D（660）表示菌體的生物量，用光程為1cm的石英比色杯，于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定波長(zhǎng)為660nm處光密度D（660）.

采用鈉氏試劑光度法測(cè)定NH3－N的質(zhì)量；采用N－（1－萘基）－乙二胺光度法測(cè)定NO－2－N的質(zhì)量；采用紫外分光光度法［15］NO－3－N測(cè)定.無(wú)機(jī)氮去除率（R）計(jì)算式為

上式中：c0和ct分別表示無(wú)機(jī)三態(tài)氮的初始濃度和測(cè)定時(shí)刻的濃度.

無(wú)機(jī)三態(tài)氮的質(zhì)量均以氮素的質(zhì)量濃度計(jì)算，重復(fù)測(cè)定3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)氨氮的去除和轉(zhuǎn)化

YL28菌株靜息細(xì)胞對(duì)氨氮去除及其轉(zhuǎn)化過(guò)程，如圖1所示.圖1中，NH3－N的起始濃度為3.12 mmol·L－1（空心圖示□和○），6.18mmol·L－1（實(shí)心圖示■和▲）.由圖1可知：隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，體系中菌體生物量降低，氨氮去除率升高；1～2d內(nèi)檢測(cè)到了少量亞硝氮和硝氮的生成，隨后又被完全去除.低氨氮濃度（3.12mmol·L－1）體系處理5.1d，菌體生物量降低了約17.90%，氨氮去除量和去除率分別為0.28mmol·L－1和9.86%；高濃度氨氮（6.18mmol·L－1）時(shí)，體系中菌體生物量未明顯降低，氨氮去除量未見(jiàn)明顯變化，但氨氮去除率明顯降低.

圖1 YL28菌株靜息細(xì)胞對(duì)氨氮的去除和硝氮、亞硝氮的生成過(guò)程Fig.1 Removal of ammonium and the production of nitrate and nitrite by YL28resting cells

結(jié)果表明：YL28菌株靜息細(xì)胞對(duì)氨氮去除能力很弱，能將氨氮轉(zhuǎn)化為少量的亞硝氮和硝氮，在體系中的菌體有一定程度的自溶，使生物量降低.已有研究表明，YL28菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中均具有良好的去除氨氮的能力［10］，而本實(shí)驗(yàn)中靜息細(xì)胞去除氨氮的能力很低.由此可知，YL28菌株主要通過(guò)銨同化作用去除氨氮，由于靜息細(xì)胞體系中缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，菌體不能通過(guò)銨同化作用生長(zhǎng)，表現(xiàn)出對(duì)氨氮的去除能力較微弱.

2.2 對(duì)亞硝氮的去除和轉(zhuǎn)化

YL28菌株靜息細(xì)胞對(duì)亞硝氮的去除及轉(zhuǎn)化過(guò)程，如圖2所示.圖2中，NO－2－N的起始濃度為5.12 mmol·L－1（□和○），10.08mmol·L－1（■和▲）.由圖2可知：隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，亞硝氮去除率逐漸升高，然后被完全去除（圖2（a））；在1～3d內(nèi)能檢測(cè)到硝氮的生成，隨后又消失，在整個(gè)過(guò)程中未檢測(cè)到氨氮的生成（圖2（b））.與低濃度亞硝氮體系相比，高濃度亞硝氮體系中亞硝氮的去除速率降低，生成的硝氮摩爾濃度較高.結(jié)果表明：菌株的靜息細(xì)胞對(duì)亞硝氮有良好的去除作用，能將亞硝氮轉(zhuǎn)化為硝氮；與氨氮體系相比，由于亞硝氮具有毒性，能加快菌體自溶，致使體系中生物量明顯降低.

Shapleigh［16］報(bào)道了許多APB菌株具有反硝化作用，并闡明了反硝化作用的相關(guān)酶系；Schott等［17］報(bào)道了Thiocapsasp.KS1和Rhodopseudomonassp.LQ17能夠在厭氧條件下通過(guò)亞硝酸鹽氧化還原酶將亞硝氮轉(zhuǎn)化為硝氮.由此可知，YL28菌株具有亞硝酸鹽氧化還原酶和反硝化作用的相關(guān)酶系.因而，其靜息細(xì)胞能利用這些酶系將亞硝氮轉(zhuǎn)化為硝氮，也能夠通過(guò)反硝化作用去除體系中亞硝氮和硝氮.

圖2 YL28菌株靜息細(xì)胞對(duì)亞硝氮的去除和氨氮、硝氮的生成過(guò)程Fig.2 Removal of nitrite and the production of ammonium and nitrate by YL28resting cells

2.3 對(duì)硝氮的去除和轉(zhuǎn)化

圖3 YL28菌株靜息細(xì)胞對(duì)硝氮的去除和氨氮、亞硝氮的生成過(guò)程Fig.3 Removal of nitrate and the production of ammonium and nitrite by YL28resting cells

YL28菌株靜息細(xì)胞對(duì)硝氮的去除及其轉(zhuǎn)化過(guò)程，如圖3所示.圖3中，NO－3－N的起始濃度為4.25 mmol·L－1（□和○），8.18mmol·L－1（■和●）.由圖3可知：隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，硝氮去除率升高，生物量逐漸降低（圖3（a））；在1～2d內(nèi)水體中產(chǎn)生的亞硝氮達(dá)到最大（圖3（b）），隨后又被完全去除，整個(gè)過(guò)程中未檢測(cè)到氨氮的存在.與低濃度相比，高濃度硝氮體系中硝氮的最大去除率降低，暫時(shí)性生成的亞硝氮升高，菌體生物量有所降低.結(jié)果表明：YL28菌株靜息細(xì)胞具有良好去除硝氮的能力，能通過(guò)反硝化作用將硝氮轉(zhuǎn)化為亞硝氮.

2.4 對(duì)無(wú)機(jī)三態(tài)氮共存的去除和轉(zhuǎn)化特性

無(wú)機(jī)三態(tài)氮共存體系中，YL28菌株的靜息細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)氮的去除和轉(zhuǎn)化特性，如圖4所示.圖4中，NH3－N，NO－2－N，NO－3－N的初始濃度分別為3.12，5.12，4.25mmol·L－1.從圖4可知：菌株的靜息細(xì)胞在處理過(guò)程中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，在處理1d時(shí)，水體中亞硝氮的摩爾濃度先升高；隨后迅速降低，水體中氨氮和硝氮的去除率緩慢升高至趨于穩(wěn)定，最終水體中亞硝氮完全去除，硝氮的去除率為94.25%，氨氮的去除率為10.89%.

結(jié)果表明：YL28菌株的靜息細(xì)胞對(duì)亞硝氮和硝氮具有良好的去除作用，而對(duì)氨氮的去除能力較為微弱.水體中亞硝氮摩爾濃度暫時(shí)性升高，主要是由于反硝化的作用將硝氮轉(zhuǎn)化為亞硝氮.

圖4 YL28菌株靜息細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)氮的去除過(guò)程Fig.4 Removal of inorganic nitrogen by YL28resting cells

3 結(jié)論

研究YL28菌株靜息細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)三態(tài)氮的去除和轉(zhuǎn)化特性，與菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)無(wú)機(jī)三態(tài)氮的去除結(jié)果［10］相比，菌株對(duì)亞硝氮和硝氮的去除速率明顯下降，菌株對(duì)氨氮的去除量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏低.通過(guò)分析認(rèn)為，在YL28菌株的靜息細(xì)胞中，硝化作用并非是轉(zhuǎn)化無(wú)機(jī)三態(tài)氮的主導(dǎo)途徑，該菌株僅在厭氧光照條件下，以氨氮作為唯一氮源的生長(zhǎng)過(guò)程中，才能表現(xiàn)出較強(qiáng)的硝化作用.YL28菌株靜息細(xì)胞對(duì)亞硝氮和硝氮的良好去除和轉(zhuǎn)化作用，體現(xiàn)了該菌株本身具有良好的反硝化和亞硝酸鹽厭氧氧化作用.但是，由于微生物靜息細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)三態(tài)氮的去除轉(zhuǎn)化研究較為少見(jiàn)，尚不能比較菌株的靜息細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)三態(tài)氮的轉(zhuǎn)化途徑是否相一致.雖然菌株的靜息細(xì)胞對(duì)氨氮去除和轉(zhuǎn)化作用較微弱，但是研究過(guò)程中，還是發(fā)現(xiàn)氨氮能被轉(zhuǎn)化為少量的硝氮和亞硝氮，這為YL28菌株中存在的氮轉(zhuǎn)化途徑也提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù).

YL28菌株的靜息細(xì)胞對(duì)亞硝氮和硝氮具有良好的去除能力，對(duì)氨氮的去除能力很微弱，能通過(guò)反硝化作用將硝氮轉(zhuǎn)化為亞硝氮而去除，也能將亞硝酸鹽厭氧氧化為硝氮，幾乎不能通過(guò)銨同化作用去除氨氮.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在適宜的溫度和pH值條件下，該菌株在黑暗厭氧等生存環(huán)境中，雖然生長(zhǎng)緩慢，但仍具有良好去除環(huán)境中亞硝氮和硝氮的能力.本研究為針對(duì)性地開(kāi)發(fā)適應(yīng)特定環(huán)境的APB制劑及其應(yīng)用提供參考.

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