韓 睿，陳來生，李 莉，劉德立（1.華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點實驗室，湖北 武漢 40079；2.青海省高原作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用國家重點實驗室培育基地，青海 西寧 810016；.青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，青海 西寧 810016）

PCR-DGGE研究青海農(nóng)村戶用沼氣池微生物群落結(jié)構(gòu)

韓 睿1，2，3，陳來生2，3，李 莉3，劉德立1*（1.華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079；2.青海省高原作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用國家重點實驗室培育基地，青海 西寧 810016；3.青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，青海 西寧 810016）

采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析技術(shù)，對青海農(nóng)村戶用沼氣池內(nèi)細(xì)菌及古菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析.結(jié)果表明，沼氣池含有豐富的細(xì)菌及古菌類群，且泥樣間的細(xì)菌和古菌的群落結(jié)構(gòu)存在差異.4個戶用沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)中，細(xì)菌分屬于5個門，優(yōu)勢類群為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）.在屬分類水平上，屬于24個類群，最優(yōu)勢類群為理研菌科佩特里單胞菌屬（Petrimonas）、假單胞菌屬（Pseudomona）、泰氏菌屬（Tissierella）和梭菌屬（Clostridium）.同時，沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)中古菌主要包括熱絲菌屬（Thermofilum）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、產(chǎn)甲烷菌屬（Methanogenium），其中，Methanobrevibacter 和Methanogenium是沼氣池內(nèi)最優(yōu)勢的產(chǎn)甲烷菌.說明沼氣池的產(chǎn)甲烷途徑主要是氫營養(yǎng)代謝類型，水解、酸化過程主要由來自動物消化系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌完成.

PCR-DGGE；青海；戶用沼氣池；微生物群落結(jié)構(gòu)

沼氣是一種極具應(yīng)用前景的可再生清潔生物能源［1-2］.發(fā)展沼氣是解決我國農(nóng)村能源危機(jī)、改善農(nóng)村生態(tài)環(huán)境、實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑［3］.高效穩(wěn)定的微生物生態(tài)系統(tǒng)是沼氣產(chǎn)氣率的保證，是沼氣池穩(wěn)定運行的關(guān)鍵.Zakrzewski等［4］對生物沼氣池的樣品進(jìn)行研究，揭示了產(chǎn)甲烷菌群的代謝途徑，認(rèn)為在以后的生產(chǎn)中可以通過對微生物群落的監(jiān)控優(yōu)化生產(chǎn)；劉衛(wèi)國等［5］對沼氣生物脫硫系統(tǒng)中微生物群落構(gòu)成進(jìn)行分析，確定了系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌種.研究并優(yōu)化沼氣發(fā)酵過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)，有利于充分發(fā)揮各種群的生態(tài)功能，使沼氣發(fā)酵在糞污治理中得到科學(xué)合理應(yīng)用［6］.

青海省地處青藏高原東北部，平均海拔在4000m以上，具有氣溫低、晝夜溫差大、太陽輻射強等特點.全省年平均氣溫在-4℃～8℃之間，冬季氣溫低（平均氣溫為-8℃～-18℃）且持續(xù)時間長.自2003年以來，青海省在農(nóng)村沼氣建設(shè)國債項目的支持下，在農(nóng)村沼氣建設(shè)和利用方面取得了一定成效.然而，由于青海省所處的地理位置及氣候條件，導(dǎo)致其沼氣技術(shù)開發(fā)落后，存在著諸多問題.進(jìn)入冬季（當(dāng)年11月～翌年4月），寒冷的氣溫導(dǎo)致戶用沼氣池內(nèi)發(fā)酵微生物生理活性降低，產(chǎn)生的微量沼氣不夠應(yīng)用，不能維持發(fā)酵系統(tǒng)自身的運轉(zhuǎn)，甚至出現(xiàn)供氣中斷現(xiàn)象（用半年停半年）.沼氣池的閑置浪費，使農(nóng)民建沼氣池、用沼氣的積極性降低，也在一定程度上影響了青海沼氣的推廣普及［9］.據(jù)統(tǒng)計，到目前為止青海省絕大多數(shù)戶用沼氣池在冬季沒有得到很好利用.由于農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)是一個復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，微生物群落結(jié)構(gòu)決定其生態(tài)功能.因此，深入解析青海沼氣發(fā)酵生態(tài)系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)特征，是指導(dǎo)青海沼氣生產(chǎn)的關(guān)鍵.

絕大多數(shù)沼氣發(fā)酵微生物難以培養(yǎng)，無法采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法來研究微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝關(guān)系［6-9］.變性梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE）以DNA分子為研究對象，能有效分析復(fù)雜微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性，無需培養(yǎng)微生物，操作簡單快速，已被廣泛用于各種環(huán)境中微生物生態(tài)的研究［10-12］.迄今為止，對寒區(qū)農(nóng)村戶用沼氣發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的研究相對較少，而青海地區(qū)的此類研究還未見報道.本研究利用PCR-DGGE技術(shù)，以青海省樂都縣蒲臺鄉(xiāng)李家臺村的沼氣池為研究對象，探明青海農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵微生物的群落結(jié)構(gòu)特征，為進(jìn)一步揭示微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，改進(jìn)青海省沼氣發(fā)酵工藝、增加沼氣池產(chǎn)氣量、實現(xiàn)農(nóng)村戶用沼氣發(fā)酵的穩(wěn)定運行提供有價值的參考.

1 材料與方法

1.1 戶用沼氣池

青海省樂都縣蒲臺鄉(xiāng)李家臺村（102°27′22″E，36°21′14″N，海拔2223.27m～2228.26m）有農(nóng)戶79 戶.經(jīng)初步調(diào)查分析，共建有沼氣池65座，33.8％能夠正常運行，運行效率不高，但相對青海省而言，該村沼氣池的運行情況是比較好的.所建沼氣池構(gòu)造統(tǒng)一，為圓形，容積為8m3，采用“一池三改”的模式，將沼氣池與改廁所、改暖棚豬舍與改廚房相結(jié)合，通過庭院的合理設(shè)計，糞便直接入池.發(fā)酵液pH值為7.0～7.5、主要投入原料為人畜的糞便.

1.2 樣品采集

選取利用率相對較高，且能夠在冬季供氣不中斷的4戶沼氣池底部取樣.采樣時間為2014年6月.樣品采集后4℃封存，帶回實驗室后立即對樣品進(jìn)行處理.分別編號為LD1、LD2、LD3、LD4，其運行狀況等基本情況見表1.

1.3 基因組DNA提取

將污泥樣品置于2mL離心管中，用土壤基因組快速抽提試劑盒（上海生工）提取基因組DNA，經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測后保存于4℃?zhèn)溆?

1.4 PCR擴(kuò)增

將污泥樣品置于2mL離心管中，用土壤基因組快速抽提試劑盒（上海生工）提取基因組DNA，經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測后保存于4℃?zhèn)溆?

1.4.1 細(xì)菌PCR擴(kuò)增 所用引物為細(xì)菌16S rDNA V3高變區(qū)357F-GC（5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCC CTACGGGAGGCAGCAG-3'）和518R（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'），反應(yīng)體系為50μL總體積，ddH2O 41.25μL，10×Buffer（含2.0mmol/L MgCl2）5μL，dNTP（10mmol/L）1μL，357F-GC（10μmol/L）1μL，518R（10μmol/L）1μL，Taq酶（5U/μL）0.25μL，模板DNA 0.5μL.反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4min；30個循環(huán)（94℃ 30s；56℃ 1min；72℃ 30s）；72℃延伸7min.

1.4.2 古菌PCR擴(kuò)增 巢式PCR擴(kuò)增，利用兩輪引物.第一輪引物為ARCH46F（5'-YTAAGCCATGCRAGT-3'）和ARCH1017R（5'-GGCCATGCACCWCCTCTC-3'），第二輪為PARCH344F（5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCG GGGGCACGGGGGGACGGGGHGCAGCAGGCGCGA-3'）和UNIV 522R（5'-GWATTACCGCGGCKGCTG-3'）.反應(yīng)體系為50μL總體積，ddH2O 41.25μL，10×Buffer（含2.0mmol/L MgCl2）5μL，dNTP（10mmol/L）1μL，上下游引物（10μmol/L）各1 μL，Taq酶（5U/μL）0.25μL，模板DNA 0.5μL.反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4min；30個循環(huán)（94℃ 30s；56℃1min；72℃ 30s）；72℃延伸7min.細(xì)菌和古菌PCR產(chǎn)物均用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測.

表1 戶用沼氣池基本情況調(diào)查表Table 1 Basic information of household biogas digesters

1.5 變性梯度凝膠電泳（DGGE）及數(shù)據(jù)分析

采用D-Code突變檢測系統(tǒng)對樣品進(jìn)行DGGE分析.所用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8％（丙稀酰胺：雙丙稀酰胺=37.5︰1），變性劑濃度從30％～60％（100％的變性劑為7mol/L尿素，40％甲酰胺）.在60V電壓下，60℃恒溫，1×TAE中電泳16h.電泳完畢后，用超純水沖洗膠，然后將膠放進(jìn)含EB的染液中，置于搖床上染色30min后，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照.

DGGE圖譜用Quantity One 軟件進(jìn)行數(shù)字化處理，并進(jìn)行聚類分析（UPGMA法）.利用香農(nóng)多樣性指數(shù)（H′）、辛普森指數(shù)（D）和均勻度（E）等指標(biāo)對各樣品微生物的多樣性進(jìn)行評價.

1.6 DGGE條帶的測序與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

選取較有代表性的條帶，用潔凈的手術(shù)刀片將目標(biāo)DGGE條帶完整的切下并裝入1.5mL離心管中，用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工）的方法進(jìn)行回收.取適量做模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除引物不帶GC“夾板”外，擴(kuò)增條件及步驟同1.4.將擴(kuò)增DNA片段回收、純化，分別與pMD18-T（TaKaRa）載體連接，熱激轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞.篩選陽性克隆子送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序.

序列測序后去除載體序列，與GenBank（http：//www.ncbi.nl.nih.gov/BLAST/）及RDP（http：//rdp.cme.msu.edu）數(shù)據(jù)庫中的已有序列進(jìn)行比對分析，確定其在原核生物界的分類地位，采用Clustal X 2.11和MEGA 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 青海沼氣泥樣DGGE圖譜及多樣性分析

以提取的4個泥樣的基因組DNA為模板，對其進(jìn)行16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，然后用凝膠成像分析系統(tǒng)和Quantity one分析軟件對DGGE膠圖進(jìn)行條帶識別和圖譜分析.由圖1和圖2可見，細(xì)菌和古菌的DGGE圖譜條帶均清晰，顯示了各戶用沼氣池泥樣中微生物的DNA指紋.圖譜中條帶的數(shù)目、強度及遷移位置反映了泥樣中微生物類群的多樣性及豐度.不同位置的條帶代表不同微生物類群，而同一水平位置的條帶則代表同種微生物菌群，其條帶的明暗程度則反映該微生物類群在不同樣品中的相對豐度，得到的條帶越多說明樣品的多樣性越高.由圖1和表2可知，青海農(nóng)村戶用沼氣池每個泥樣DGGE圖譜中的條帶總數(shù)均在26條以上，D顯示均在0.95以上，且LD4樣品最高，這一規(guī)律同樣可從H′中反映出來，說明泥樣中細(xì)菌種類十分豐富.另外，4個泥樣的E有一定差異，反映出泥樣間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異.由圖2和表2可知，每個泥樣DGGE圖譜中條帶總數(shù)均在15條以上，H′與D的變化規(guī)律相同，且D顯示均在0.91以上，說明也含有較為豐富的古菌類群.泥樣樣品中，LD1和LD4的S相近，但其他特征不同，說明泥樣間古菌的多樣性不同.同樣，4個泥樣的E差異較大，也說明泥樣間的古菌群落結(jié)構(gòu)的差異很大.

表2 不同樣品中微生物特征指數(shù)計算結(jié)果Table 2 Microbial characteristics index of different samples from biogas slurry

2.2 不同泥樣微生物群落的相似性分析

利用Quantity One提供的UPGMA法，在DGGE圖譜的基礎(chǔ)上，繪出微生物群落的聚類分析圖（圖3）.從圖3A可知，4個樣品中細(xì)菌群落組成總體分為2大類，LD1、LD2、LD4的細(xì)菌聚為一類，LD3單獨聚為另一類.對于前者，從DGGE圖譜（圖1）可以看出，LD1和LD2在帶型、條帶數(shù)目、條帶亮度及共有條帶數(shù)目上最近，與其余2個樣有差別；從聚類分析圖同樣可以看出LD1和LD2相似性最高，因此又可以歸為一亞類，而LD4則單獨成為另一亞類，說明LD1和LD2泥樣間的微生物最相似.從圖3B可知，4個樣品中古菌群落組成總體也可分為2大類，LD2、LD3、LD4的古菌聚為一類，LD1單獨聚為一類.對于第一大類，LD2和LD3相似性最高，又可以歸為一亞類，而LD4則單獨成為另一亞類，這一結(jié)論同樣可由DGGE圖譜得出（圖2）.

2.3 沼氣微生物菌群基因測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

分別選取圖1和圖2中具代表性的條帶，分別對編號為LDB-1～LDB-30的30個細(xì)菌條帶和編號為LDA-1～LDA-25的25個古菌條帶進(jìn)行克隆測序，將得到的所有序列與GenBank及RDP數(shù)據(jù)庫中的已有序列進(jìn)行比對分析，獲得各個序列的同源性信息（表3和表4），構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4和圖5）.由圖4和表3可知，青海農(nóng)村戶用沼氣池細(xì)菌的多樣性十分豐富，其序列與近緣種的相似度從91.2％～100％，片段長度從169bp～196bp，分屬于5個門，包括：放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）及疣微菌門（Verrucomicrobia），優(yōu)勢類群為Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria.在屬分類水平屬于24個微生物類群，包括：短小桿菌屬（Curtobacterium）、紫單胞菌科帕魯?shù)暇鷮伲≒aludibacter）、海滑菌科（Marinilabiaceae）未分類屬、紫單胞菌科Proteiniphilum屬（Proteiniphilum）、理研菌屬（Rikenella）、理研菌科佩特里單胞菌屬（Petrimonas）、理研菌科（Rikenellaceae）未分類屬、噬胞菌屬（Cytophaga）、噬幾丁質(zhì)桿菌科菌（Chitinophagaceae）、阿托波葉柄菌屬（Atopostipes）、牛瘤胃菌屬（Proteiniclasticum）、泰氏菌屬（Tissierella）、糞球菌屬（Coprococcus）、梭菌屬（Clostridium）、梭菌科古根海姆艾拉菌屬（Guggenheimella）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）未分類屬、梭菌目未定科（Clostridiales_Incertae Sedis XI）未分類屬、丹毒絲菌屬（Erysipelothrix）、布魯氏菌屬（Brucella）、根瘤菌屬（Rhizobium）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、疣微菌屬（Verrucomicrobium）.其中以Petrimonas、Pseudomonas、Tissierella和Clostridium為優(yōu)勢類群.

圖3 沼氣池泥樣微生物群落的DGGE聚類分析Fig.3 The clustering dendrogram of the microbial community in biogas slurry by DGGE analysis

表3 細(xì)菌群落16S rDNA片斷測序分析Table 3 Sequence analysis of 16S rDNA phrases in bacterial community

續(xù)表3

由圖5和表4可知，古菌的片段長度為137～150bp，其序列與近緣種的相似度從80.1％～97.0％，分屬于3個目，即熱變形菌目（Thermoproteales）、甲烷桿菌目（Methanobacteriales）和甲烷微菌目（Methanomicrobiales），核酸序列比對結(jié)果顯示，青海農(nóng)村戶用沼氣池古菌包括熱絲菌屬（Thermofilum）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）和產(chǎn)甲烷菌屬（Methanogenium），其中，Methanobrevibacter和Methanogenium是沼氣池內(nèi)最優(yōu)勢的古菌類群.

圖4 沼氣樣品細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of various bacteria in the samples from biogas slurry

表4 古菌群落16S rDNA片斷測序分析Table 4 Sequence analysis of 16S rDNA phrases in archaeal community

續(xù)表4

3 討論

理論上，DGGE圖譜中每一條帶代表一種微生物類群，帶型、條帶數(shù)目及亮度與微生物的種類及相對含量成正比［17-18］.通過對比DGGE 圖譜中不同泳道各條帶的有無和明暗程度，即可判斷各樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)及種群豐富度狀況.由圖1和圖2可知，細(xì)菌和古菌的DGGE圖譜條帶非常清晰，各樣品的PCR產(chǎn)物獲得了預(yù)期的分離效果，不同沼氣池泥樣細(xì)菌和古菌群落在帶型、條帶數(shù)目及亮度上均存在一定差異.青海農(nóng)村戶用沼氣池每個泥樣的DGGE圖譜中，細(xì)菌的條帶數(shù)在26條以上，古菌在14條以上，說明泥樣中含有豐富的細(xì)菌及古菌菌群.不同泥樣所對應(yīng)的泳道有許多相同的條帶，如LDB-3、LDB-4、LDB-5、LDB-16、LDB-18、LDB-19、LDB-20、LDB-27、LDB-28 和LDA-13、LDA-15、LDA-16、LDA-19，表明其所代表的微生物類群為青海4個農(nóng)村戶用沼氣池所共有，但這些共有條帶的亮度不盡相同，如LDB-3僅在LD4泳道非常亮，說明LDB-3條帶對應(yīng)的細(xì)菌群落在LD4的泥樣中最為豐富.同樣，LDA-19在LD2泳道非常亮，在LD3泳道比較亮，也說明了其對應(yīng)的古菌群落的豐富度.從表2可以看出，每個樣沼氣池泥樣中細(xì)菌和古菌特征指數(shù)不同，其中S、H′和D的特征變化規(guī)律相同，反映出其微生物的多樣性和豐富性.細(xì)菌泥樣間的D、S相差不大，而H′有一定差異.LD4樣品的H′是泥樣中最高的，為3.332，LD3則是最低的，為3.135.古菌泥樣間的H′、D和S均有一定差異.LD2 和LD3的H′、D相近，LD1和LD4相近，且前兩者指數(shù)要遠(yuǎn)高于后兩者.其中，LD2最高，分別為2.944和0.947；而LD4分別僅有2.485和 0.917.LD1和LD4的S相近，但這2個泥樣的S與其他2個相差很大.E是指微生物群落中各菌群的豐富度或重要類群的均勻程度，E不同即說明樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)不同.細(xì)菌和古菌各泥樣的E均不同，但細(xì)菌LD1和LD4的E相差不大，古菌LD2和LD4相差不大.

圖5 沼氣樣品古菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of different archaea in the samples from biogas slurry

分別對30個細(xì)菌條帶和25個古菌條帶克隆測序分析，結(jié)果表明青海農(nóng)村戶用沼氣池細(xì)菌多樣性很高，優(yōu)勢類群主要為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門.擬桿菌門和厚壁菌門主要分離自動物消化道、厭氧消化污泥、糞便、廢水處理反應(yīng)器等厭氧環(huán)境，前者有降解大分子碳水化合物產(chǎn)酸的功能，后者主要進(jìn)行纖維素降解生成小分子物質(zhì)［15-17］.變形菌門主要分離自糞便、厭氧活性污泥及土壤等環(huán)境中，具有水解作用［18］.在沼氣發(fā)酵系統(tǒng)中曾多次發(fā)現(xiàn)這3門細(xì)菌是占主導(dǎo)地位的細(xì)菌類群，只是優(yōu)勢程度不同.Klocke等［19］發(fā)現(xiàn)青貯甜菜沼氣系統(tǒng)中優(yōu)勢細(xì)菌主要歸屬于厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門.張蕾等［20］對秸稈沼氣發(fā)酵反應(yīng)器中微生物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌分屬 9個門，大部分為水解與發(fā)酵性細(xì)菌，其中厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門為主要的優(yōu)勢種群.袁月祥等［21］研究發(fā)現(xiàn)，在以玉米秸稈厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣的過程中，發(fā)酵系統(tǒng)含有20余個門的細(xì)菌，豐度最多的細(xì)菌為擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門.趙光等［22］對北方規(guī)模最大的海林農(nóng)場沼氣池內(nèi)細(xì)菌及產(chǎn)甲烷古菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的優(yōu)勢菌群有厚壁菌門、擬桿菌門及變形菌門.在屬分類水平上，青海農(nóng)村戶用沼氣池主要優(yōu)勢類群為理研菌科佩特里單胞菌屬、假單胞菌屬、泰氏菌屬和梭菌屬，均屬動物消化系統(tǒng)內(nèi)常見的微生物類群，說明這些沼氣池底物水解及產(chǎn)酸過程的主要功能微生物來源于動物消化系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌類群.同時，所含的古菌中，最優(yōu)勢的類群為甲烷短桿菌屬和產(chǎn)甲烷菌屬，該結(jié)果與前人的報道相符.郎會花等［23］利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建16S rDNA基因文庫研究雞糞沼氣池發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌的菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌屬占總數(shù)的92％.Weiss等［24］利用DGGE技術(shù)分析市政沼氣工程中古菌多樣性后得知古菌包括甲烷短桿菌屬、甲烷囊菌屬、甲烷球形菌屬、甲烷微菌屬和未培養(yǎng)甲烷微菌目.甲烷短桿菌屬常見于動物消化道、腐敗木質(zhì)、厭氧活性污泥及厭氧消化反應(yīng)器等，產(chǎn)甲烷菌屬則常見于海底沉積物、溫泉、厭氧消化反應(yīng)器、土壤、腐敗木質(zhì)、厭氧活性污泥等，兩者均為氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，可利用氫氣或甲酸鹽，不能利用乙酸和甲基胺［25-27］.由此可知，青海農(nóng)村戶用沼氣池的主要代謝方式為：來自動物消化系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌通過水解、酸化過程為產(chǎn)甲烷菌提供H2等營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)甲烷菌則利用這些底物還原CO2生成甲烷，這一代謝途徑維持著該發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定運行.

寒冷的氣候條件是導(dǎo)致青海沼氣池利用率低、產(chǎn)氣少、供氣中斷等問題的重要原因之一.為解決沼氣池越冬問題，青海省通常采用畜禽舍下建造沼氣池、覆蓋塑料薄膜、池體進(jìn)出口加蓋、太陽能加熱、利用輔助燃燒式建造技術(shù)等辦法來給沼氣池增溫［28-29］.但冬季氣溫過低，以上措施不能克服溫度對沼氣池的影響，必需從發(fā)酵過程中的微生物入手.由于沼氣發(fā)酵是一個涉及多種微生物的復(fù)雜的厭氧消化過程，對各類微生物在其中所起作用的研究非常重要，現(xiàn)已有通過研究微生物來解決低溫對沼氣產(chǎn)氣不足問題的成功報道.姚利等［30］篩選出了具有耐低溫和分解秸稈性能的菌種，并經(jīng)復(fù)合成為沼氣發(fā)酵菌劑.分別在采取不同保溫升溫措施的沼氣池內(nèi)添加該菌劑，對其冬季應(yīng)用效果進(jìn)行驗證試驗.結(jié)果表明，各組試驗池產(chǎn)氣量提高38.2％～45.5％，平均日產(chǎn)氣量可達(dá)0.47～0.80m3.說明對沼氣池采取保溫升溫措施并添加高效微生物菌劑，可顯著提高沼氣池的水溫和產(chǎn)氣量，確保沼氣池在冬季正常使用.黃江麗等［31］選育出了低溫沼氣發(fā)酵功能菌群，沼氣發(fā)酵實驗結(jié)果表明，該菌群采用后最高日產(chǎn)氣量均明顯高于單獨采用野生菌群和厭氧顆粒污泥菌群，具有改善低溫沼氣發(fā)酵性能.以此為基礎(chǔ)研制的低溫沼氣發(fā)酵促進(jìn)劑，在13℃下可使產(chǎn)氣率平均提高46.6％，10℃下產(chǎn)氣率平均提高41.1％.目前我們通過PCR-DGGE技術(shù)明確了青海農(nóng)村戶用沼氣池6月份的微生物群落結(jié)構(gòu)，正在開展溫度變化對沼氣池微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究，旨在了解沼氣發(fā)酵過程中微生物群落隨溫度變化的動態(tài)變化特征，進(jìn)而優(yōu)化群落結(jié)構(gòu)、調(diào)整群落功能，為增加青海農(nóng)村戶用沼氣池產(chǎn)氣量，提高沼氣池利用效率奠定基礎(chǔ).

4 結(jié)論

4.1 利用PCR-DGGE技術(shù)對青海省樂都縣蒲臺鄉(xiāng)李家臺村不同沼氣池內(nèi)細(xì)菌及古菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，青海農(nóng)村戶用沼氣池含有豐富的細(xì)菌及古菌類群，且泥樣間的細(xì)菌和古菌的群落結(jié)構(gòu)存在差異.4個戶用沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)中，細(xì)菌分屬于5個門，優(yōu)勢類群為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門.在屬分類水平上，屬于24個類群，最優(yōu)勢類群為理研菌科佩特里單胞菌屬、假單胞菌屬、泰氏菌屬和梭菌屬，均為動物消化系統(tǒng)內(nèi)常見的細(xì)菌類群.

4.2 4個戶用沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)中，古菌主要包括熱絲菌屬、甲烷短桿菌屬、甲烷囊菌屬和產(chǎn)甲烷菌屬，其中，甲烷短桿菌屬和產(chǎn)甲烷菌屬是最優(yōu)勢的產(chǎn)甲烷菌類群，均為氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌.說明沼氣池的產(chǎn)甲烷途徑主要是氫營養(yǎng)代謝類型，水解、酸化過程主要由來自動物消化系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌完成.

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Microbial community of rural household biogas digesters in Qinghai by PCR-DGGE.

HAN Rui1，2，3，CHEN Lai-sheng2，3，LI Li3，LIU De-li1*（1.Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology，School of Life Science，Central China Normal University，Wuhan 430079，China；2.State Key Laboratory Breeding Base，Key Laboratory of Qinghai Province for Plateau Crop Germplasm Innovation and Utilization，Xining 810016，China；3.Qinghai Key Laboratory of Vegetable Genetics and Physiology，Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Science，Xining 810016，China）.China Environmental Science，2015，35（6）：1794～1804

The microbial community composition in rural household biogas digesters of Qinghai was investigated with polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis（PCR-DGGE）technology.The results showed that the diversity of bacteria and archaea were rich，and the shift of microbial community was obvious in digesters.The bacterial communities in four biogas digesters were classified into five phyla，Bacteroidetes，F(xiàn)irmicutes and Proteobacteria were identified to be dominant.At genome level，belonging to twenty-four communities，Petrimonas，Pseudomona，Tissierella and Clostridium were the abundant taxa.Meanwhile，the species of archaeal community were calssified as Methanobrevibacter，Methanogenium，Methanoculleus and Thermofilum，and the first two classes were dominant in the digesters.Notably，the methane produced by hydrogen nutrition methanogens，and the dominant fermentative bacteria during the hydrolysis and acidogenesis were detected from animal digestive system.

PCR-DGGE；Qinghai；household biogas digesters；microbial community structure

X172

A

1000-6923（2015）06-1794-11

韓 睿（1983-），女，河南許昌人，助理研究員，華中師范大學(xué)博士研究生，從事微生物分子生物學(xué)方面的研究.發(fā)表論文10余篇.

2014-11-20

青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室（2014-Z-Y15）

* 責(zé)任作者，教授，deliliu2013@163.com