童 武，鄭 浩，梁 超，劉 飛，曹艷云，李 林，田 青，鄭旭晨，單同領，李國新，童光志

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

一株攜帶EGFP基因的重組偽狂犬病毒變異株的構(gòu)建

童 武，鄭 浩，梁 超，劉 飛，曹艷云，李 林，田 青，鄭旭晨，單同領，李國新，童光志

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

本研究運用同源重組的方法，在偽狂犬病毒 （Pseudorabies virus， PRV）變異株 PRV JS-2012 基礎上，構(gòu)建了一株攜帶增強型綠色熒光蛋白基因的標記重組偽狂犬病毒，命名為rPRV JS-2012-EGFP。經(jīng)PCR方法鑒定及熒光顯微鏡觀察分析，結(jié)果表明重組病毒構(gòu)建成功，并能在感染細胞中穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白。生長曲線和空斑試驗結(jié)果顯示，rPRV JS-2012-EGFP與親本株 PRV JS-2012在體外具有相似的生長特性。將 rPRV JS-2012-EGFP 毒接種14日齡PRV陰性仔豬，能使實驗豬100%發(fā)病，病死率高達40%，表明rPRV JS-2012-EGFP是一株具有強致病力的標記偽狂犬病毒變異株，在偽狂犬病毒變異株致病機制研究中具有一定的使用價值。

偽狂犬病毒；同源重組；重組病毒；綠色熒光蛋白

偽狂犬病是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為主要特征的一種烈性傳染病［1］。PRV屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科水痘病毒屬，其基因組為線狀雙鏈DNA，長約150 kb，由長獨特區(qū)（UL）、短獨特區(qū)（US）及US兩側(cè)的內(nèi)部重復序列與末端重復序列組成，編碼70多種蛋白［2-5］。偽狂犬病最早發(fā)現(xiàn)于美國，中國20世紀60年代初豬群中也出現(xiàn)了PRV流行。豬是PRV的天然宿主、貯存者和傳播者［1，6］，PRV可感染各個年齡段的豬，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬高死亡率［7］，種豬不育，嚴重影響著我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。自2011年以來，我國豬群中出現(xiàn)了PRV變異株，且該變異株毒力較經(jīng)典PRV毒力明顯增強［8-12］。

PRV變異株對仔豬的致病機制，特別是其在豬體內(nèi)的傳播途徑和組織分布，至今并不清楚。本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了一株攜帶增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent profei，EGFP）標記的重組偽狂犬病毒，便于直接通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白來判定病毒的存在。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞 偽狂犬病毒變異株（PRV JS-2012）、BHK-21 細胞、Vero 細胞均由上海獸醫(yī)研究所豬病實驗室保存。

1.2 試劑、實驗豬 LA Taq DNA 聚合酶、dNTP mix，2×GC Buffer I、 DNA Marker DL-2000 等購自寶生物工程（大連）有限公司；pEGFP-N1、pEGFP-C3和pBluescript SK（+） 購自上?；羯锛夹g(shù)有限公司；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)購自天根化科技（北京）有限公司；胎牛血清、MEM 和DMEN為Invitrogen 公司產(chǎn)品；AseI、SacI、XhoI、ScaI 和 T4 DNA 連接酶為NEB公司產(chǎn)品；Fugene HD 轉(zhuǎn)染試劑為Promega 公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒購自OMEGA 公司；陰性實驗豬購自南京某豬場。

1.3 引物 參照 PRV JS-2012 的基因序列，設計了分別用于擴增重組左臂和重組右臂的兩對引物：JS+EGFP-LF/JS+EGFP-LR和JS+EGFP-RF/ JS+EGFP-RR。同時，設計一對引物 JS gG 鑒定 up / JS gG 鑒定down ，用于鑒定綠色熒光蛋白是否插入。引物均由上海捷瑞生物科技有限公司合成，序列如表1。

表 1 用于重組臂的擴增和重組病毒鑒定的引物Table 1 The primers for amplifying the reorganization arms and identifying the recombinant virus

1.4 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 通過PCR擴增出位于PRVJS-2012基因組中121 118至122 624位堿基和122 634至124 143位堿基的兩條片段，用作同源重組的左、右重組臂，分別位于插入位置兩側(cè)（圖1）。同時，通過內(nèi)切酶酶切，從pEGFP-C3質(zhì)粒中切出CMV啟動子-EGFP基因片段，從pEGFP-N1質(zhì)粒中切出SV40 polyA信號序列片段，并將左重組臂-CMV啟動子-EGFP基因-SV40 polyA信號序列-右重組臂依序組裝于pBluescript SK（+） 載體中，獲得重組轉(zhuǎn)移載體pBG-EGFP。

1.5 病毒核酸的提取 將PRV JS-2012株接種融合單層的BHK-21細胞，待70%～80%的細胞產(chǎn)生病變，將細胞刮下，并將細胞液移入50 mL離心管，1500×g離心 5 min，棄上清，用 TNE 溶液將沉淀細胞重懸。以酚-氯仿法從感染細胞中提取總DNA ，并溶于TE中，于 －30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 重組病毒的構(gòu)建 生長于35 mm培養(yǎng)皿中的BHK-21細胞，其密度達到70%～85%時，參照說明書，用Fugene HD 轉(zhuǎn)染試劑將 1.5 提取的 DNA 和1.4中構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體 pBG-EGFP 共轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中。轉(zhuǎn)染后的細胞置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，36 h后出現(xiàn)細胞病變，收獲上清。將收集的病毒稀釋后，接種融合單層的 Vero 細胞。感染后1 h，吸去感染液，在細胞上鋪加含 1% 瓊脂糖和 2% FBS 的 MEM 培養(yǎng)基，室溫凝固。將接種細胞移入 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，60 h后置于熒光顯微鏡下觀察，標記并挑取有綠色熒光的蝕斑，置于DMEM中。將凍融的蝕斑液接種Vero細胞，進行下一輪蝕斑純化，直至所有蝕斑均有綠色熒光。

1.7 重組病毒的PCR鑒定 利用 DNA 提取試劑盒提取已純化的重組病毒 DNA，以該DNA作為模板，用 JS gG 鑒定 up / JS gG 鑒定 down 引物進行 PCR 鑒定。PCR 體系為20μL:2×GC BufferⅡ 10μL、dNTP Mix （ 2.5mmol/mL each） 2 μL、JS gG 鑒定 up0.5μL（10pmol/μ L）、JS gG 鑒定 down 0.5μL（10pmol/μL）、LA-Taq 0.5μ L、ddH2O 4.5 μL、 DNA2 μL。PCR 反應條件: 94℃預變性 5min；94℃變性 30s，66℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，循環(huán) 35 次；最后72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物進行 1% 瓊脂糖電泳后，在凝膠成像儀中觀察。1.8 重組病毒的生物學特性分析 將重組病毒液稀釋成10-1～10-10，分別接種至 96孔培養(yǎng)板中長成融合單層的 Vero 上，每個稀釋度接種 8 孔，培養(yǎng)板最后兩列孔接種稀釋液作對照，置37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，96 h后觀察細胞病變，按照Reed-Muench法計算病毒的TCID50［12］。重組病毒和其親本毒均以0.01MOI的毒量接種Vero 細胞，分別在接毒后不同的時間點 （12、24、36、48、60、72、84、96 h） 收取細胞上清液，分別進行病毒的TCID50測定，根據(jù)測定結(jié)果繪制生長曲線。

將重組病毒和親本毒均以103TCID50/ mL 分別感染 六 孔板中的1孔細胞，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2h，分別加入等體積的瓊脂糖和2×MEM，充分混合至溫度適合時每孔加入混合液2mL；置于4℃待覆蓋層完全凝固，將之倒扣，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d；經(jīng)甲醛固定，結(jié)晶紫染色后在合適的病毒感染量時即可見典型的空斑形成。

1.9 重組病毒的毒力測定 14日齡陰性仔豬 15 頭，隨機分為3組，每組5頭。第1組分別接種PRV JS-2012強毒 106.0個 TCID502 mL；第2組分別接種重組病毒106.0個 TCID502 mL；第3組分別接種DMEM 2mL。攻毒后每天監(jiān)測試驗豬的體溫，并觀察臨床癥狀。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)移載體活性驗證 將1.4中構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載pBG-EGFP轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞24h后，置于熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移載體中的綠色熒光蛋白在BHK-21細胞中高效表達，結(jié)果見圖2。

圖1 增強型綠色熒光蛋白基因插入位置示意圖Fig. 1 Insert sketch map of enhanced green fluorescent protein （ EGFP ）

圖2 轉(zhuǎn)移載體 pBG-EGFP 活性驗證Fig. 2 The validation activity of transfer vector pBG - EGFP

2.2 重組病毒的構(gòu)建 將1.5中提取的DNA和1.4中構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體 pBG-EGFP 共轉(zhuǎn)染至生長良好的BHK-21細胞中，置37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，36h后出現(xiàn)細胞病變，收獲上清。將病毒上清稀釋后，接種融合單層的Vero 細胞做蝕斑純化。經(jīng)過4輪蝕斑純化后得到了較純的重組病毒，該重組病毒所形成的蝕斑在熒光顯微鏡下均可見綠色熒光（圖3）。將該重組病毒命名為rPRV JS-2012-EGFP。

圖3 rPRV JS-2012-EGFP 病毒的蝕斑純化Fig.3 Plaque purification of rPRV JS-2012-EGFP

2.3 rPRVJS-2012-EGFP病毒的PCR鑒定 利用DNA提取試劑盒提取rPRV JS-2012-EGFP毒及親本毒 PRV JS-2012 的 DNA，參照 1.7 中的方法進行PCR 擴增。結(jié)果顯示 PRV JS-2012 毒擴增出 819bp的特異性條帶，rPRV JS-2012-EGFP擴增出 2300bp左右的條帶（圖4）。rPRV JS-2012-EGFP 插入的綠色熒光蛋白的大小為1500 bp左右，與上述PCR結(jié)果相符，證實rPRV JS-2012-EGFP構(gòu)建成功。

2.4 rPRV JS-2012-EGFP 病毒的生物學特性分析 將rPRV JS-2012-EGFP 毒液稀釋為10-1～10-10，參照1.8中的方法測定病毒的TCID50，結(jié)果表明rPRV JS-2012-EGFP的TCID50為107.5/mL。將rPRV JS-2012-EGFP 毒和其親本毒 PRV JS-2012 都以 0.01MOI 的毒量接種Vero 細胞，在接毒后每隔 12 h 分別收取細胞上清液，并測定TCID50，根據(jù)測定結(jié)果繪制生長曲線。結(jié)果顯示 rPRV JS-2012-EGFPE 毒和親本毒PRV JS-2012 的生長曲線基本一致（見圖5）?？瞻咝纬山Y(jié)果顯示， rPRV JS-2012-EGFP 毒和其親本毒PRV JS-2012 在 Vero 細胞上所形成的蝕斑大小與形態(tài)完全一致（見圖6）。

圖4 rPRV JS-2012-EGFP 的 PCR 鑒定結(jié)果Fig.4 PCR detection result of rPRV JS-2012-EGFP

圖5 重組病毒 rPRV JS-2012-EGFP 及其親本毒在Vero 細胞上的多步生長曲線Fig.5 Growth curve of rPRV JS-2012-EGFP and its parental viruses on Vero cells

圖6 rPRV JS-2012-EGFP 及親本毒的蝕斑形態(tài)Fig.6 Plaque morphology of rPRV JS-2012-EGFP and its parental viruses

2.5 rPRV JS-2012-EGFP病毒的毒力測定 PRV JS-2012接種組實驗豬在攻毒后d 2體溫升至 41℃ 以上，攻毒后d 4出現(xiàn)死亡，d 5全部死亡。rPRV JS 2012-EGFP接種組在攻毒后d2體溫均升至41℃以上，持續(xù) 41℃高燒 4d后體溫開始下降，攻毒后d8和d9各死亡1頭豬（圖7和圖8）。

圖7 rPRV JS-2012-EGFP和 PRVJS-2012攻毒后豬的體溫變化Fig.7 Body temperature changes of piglets post infection with rPRV JS-2012-EGFP and PRV JS-2012

圖8 攻毒后各組豬不同時間的存活情況Fig.8 Mortality of piglets post infection with rPRV JS-2012-EGFP and PRV JS-2012

3 討論

同源重組技術(shù)是一項很經(jīng)典的基因工程技術(shù)，在偽狂犬病毒上應用的非常成熟。國內(nèi)很多科研工作者通過該方法均可有效的在病毒基因組中插入，替換缺失目的基因［13-15］。

本研究在偽狂犬病毒變異株P(guān)RV JS-2012的基礎上，利用同源重組技術(shù)，構(gòu)建了一株含綠色熒光標記的重組偽狂犬病毒變異株rPRV JS-2012-EGFP。為了保持PRV原有的特性，本研究將綠色EGEP插在gG基因后面。gG蛋白是PRV的非結(jié)構(gòu)蛋白，成熟的PRV病毒粒子中不含gG蛋白，gG蛋白主要分布于感染細胞的培養(yǎng)基中。gG蛋白對于病毒的毒力、吸附、穿入以及細胞間的擴散均是非必需的［16］。本研究中插入的綠色熒光蛋白攜有獨立的CMV啟動子及SV40 polyA終止序列，盡可能的不影響其他基因的功能。經(jīng)生物學特性驗證rPRV JS-2012-EGFP 毒與親本毒PRV JS-2012基本一致，且動物實驗結(jié)果表明rPRV JS-2012-EGFP毒仍然是一株強毒，對仔豬仍具有很強的致病力。

病毒感染仔豬后用rPRV JS-2012-EGFP ，定期剖殺，取組織臟器涂片后，通過熒光顯微鏡觀察即可了解組織臟器的病毒感染情況。本研究結(jié)果為PRV變異株感染仔豬的機制及病毒在豬體內(nèi)的感染途徑，提供了直觀、簡便、快捷的手段。

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CONSTRUCTION OF A RECOMBINANT PSEUDORABIES VIRUS VARIANT EXPRESSING EGFP

TONG Wu， ZHENG Hao， LiANG Chao， LIU Fei， CAO Yan-yun， LI Lin， TIAN Qing，
ZHENG Xu-chen， SHAN Tong-ling， LI Guo-xin， TONG Guang-zhi（Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241，China）

An enhanced green fluorescent protein （EGFP） expression cassette was homologously recombined into the genome of a virulent Pseudorabies virus （PRV） variant strain PRV JS-2012， generating a recombinant PRV strain rPRV JS-2012-EGFP. The insert of EGFP gene were confirmed by PCR， and green fluorescence proteins were stably expressed in the cultured cells infected with rPRV JS-2012-EGFP by green fluorescence microscopy analysis. The assays of growth curve and plaque morphology revealed that rPRV JS-2012-EGFP showed similar virological properties to its parent strain PRV JS-2012. 14-day old piglets free of PRV antibodies were inoculated with rPRV JS-2012-EGFP. The morbidity of the infected piglets reached 100%， and the mortality reached 40%. These results showed that rPRV JS-2012-EGFP was a virulent marker PRV and could be utilized to study pathogenic characterization of PRV variant.

Pseudorablies virus； homologous recombination； recombinant virus； green fluorescent protein

S852.659.1

A

1674-6422（2015）04-0001-07

2015-05-15

上海市自然科學基金項目（14ZR1448900）；上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目（滬農(nóng)科攻字（2015）第1-7號）；中央科研院所公益性基礎科研業(yè)務費項目（2014JB02）；國家生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-36）

童武，男，碩士，實習研究員，主要從事豬病研究

童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn