魏勝輝，李 巖

1.Sichuan Normal University，Chengdu Sichuan 610101 2.Ludong University，Yantai Shandong 264025

杰出的運(yùn)動能力是具有遺傳優(yōu)勢的個體在系統(tǒng)水平對長期訓(xùn)練發(fā)生良性適應(yīng)性重塑的結(jié)果［1］。表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控機(jī)制在機(jī)體響應(yīng)環(huán)境壓力的適應(yīng)性重塑過程中起到關(guān)鍵性作用，其基因調(diào)控模式具有遺傳性個體差別，導(dǎo)致適應(yīng)能力在不同個體間顯著不同［2］。適應(yīng)能力越強(qiáng)，則運(yùn)動能力的可訓(xùn)練性越好，發(fā)展?jié)摿υ酱螅?］。目前對于表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控模式與運(yùn)動能力訓(xùn)練敏感性的具體關(guān)聯(lián)所知甚少，因而無法將其作為指標(biāo)應(yīng)用于運(yùn)動員選材和個性化訓(xùn)練。

microRNA基因表達(dá)調(diào)控作用是表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控的主要途徑，是環(huán)境因素誘導(dǎo)的基因選擇性表達(dá)的主要調(diào)控方式［4］。研究表明，microRNAs分子(以下簡稱miRNAs)參與了運(yùn)動性適應(yīng)基本生理過程的調(diào)控，如肌組織肥大和心肌/骨骼肌收縮力增強(qiáng)［5］、血管增生［6］、線粒體合成與酶活性提高［7］等。miRNAs的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)和表觀遺傳修飾等因素調(diào)控，其調(diào)控模式本身存在個體差異，形成個體之間對環(huán)境因素適應(yīng)能力的差別。miRNA調(diào)控模式差別表現(xiàn)為個體之間的miRNA差異表達(dá)譜［8］。近期研究證實:尿液游離miRNA(Urine cell-free miRNA，以下簡稱UCF-miRNA)與組織細(xì)胞內(nèi)和循環(huán)miRNA表達(dá)譜存在密切關(guān)聯(lián)［9-10］。因此推測:運(yùn)動性適應(yīng)過程中UCF-miRNA特異表達(dá)譜可作為反映運(yùn)動能力的可訓(xùn)練性的“分子指紋”，在選材階段準(zhǔn)確預(yù)估運(yùn)動能力的發(fā)展?jié)摿?，或用以評估訓(xùn)練效果，作為制訂個性化訓(xùn)練方案的依據(jù)。

有氧耐力水平是決定運(yùn)動能力的主要因素之一［11］，長期周期性訓(xùn)練使機(jī)體反復(fù)不斷的對負(fù)荷做出響應(yīng)和適應(yīng)，其積累效應(yīng)為機(jī)體適應(yīng)性重塑和有氧運(yùn)動能力的提高［12］。個體間表觀遺傳學(xué)調(diào)控模式差異使每個周期的適應(yīng)效果產(chǎn)生差別，最終形成表型水平的顯著個體差異。本研究以UCF-miRNA作為miRNA調(diào)控模式的生物標(biāo)志，分析其與不同訓(xùn)練敏感水平表型之間的關(guān)聯(lián)，從而獲得高敏感表型的miRNA基因表達(dá)調(diào)控模式特征。跑節(jié)省化(Running Economy，以下簡稱RE)能夠客觀反映具體個體的有氧運(yùn)動能力［13］，本研究以RE變化率作為反映有氧運(yùn)動能力訓(xùn)練敏感性指標(biāo)，建運(yùn)動性適應(yīng)UCF-miRNA表達(dá)譜其與有氧運(yùn)動能力訓(xùn)練敏感性的關(guān)聯(lián)模型，作為早期預(yù)測和評估有氧運(yùn)動能力發(fā)展?jié)摿瓦m應(yīng)特點的指標(biāo)應(yīng)用于運(yùn)動員選材和個性化訓(xùn)練方案制訂。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

表1 參加實驗人員基本情況s)

表1 參加實驗人員基本情況s)

參訓(xùn)人員 樣本(n) 年齡(yr) 身高(cm) 體重(kg)入選實驗人員 127 18.7±0.6 172.6±9.9 63.10±10.05完成實驗人員91 18.6±0.5 173.2±7.45 64.68±8.93

1.2 有氧耐力訓(xùn)練方案

參加實驗學(xué)員進(jìn)行為期17周的系統(tǒng)性有氧運(yùn)動能力訓(xùn)練。訓(xùn)練方案:每周日、二、四下午16:30-17:30進(jìn)行5 000米長跑訓(xùn)練，負(fù)荷強(qiáng)度［14］:2-3周60%個體最大心率±3次/min;4-14周70%個體最大心率±3次/min;15-17周75%個體最大心率±3次/min(注:個人最大心率=220-年齡)。以polar表(瑞典產(chǎn))監(jiān)控靶心率維持速度。

1.3 有氧運(yùn)動能力相關(guān)指標(biāo)檢測

所有指標(biāo)在17周有氧耐力訓(xùn)練前后各檢測1次，分別記為基礎(chǔ)值(baseline)和訓(xùn)練值(postex)。

(1)5 000米最好成績測試(Personal Best 5000，簡稱PB5000):參訓(xùn)學(xué)員佩戴polar表在400米標(biāo)準(zhǔn)跑道上全力完成5 000米跑，記錄完成時間。

(2)最大攝氧量(VO2max)、通氣無氧閾(VT)測試:采用逐級遞增負(fù)荷運(yùn)動方式，使用RUN Med700跑臺(Technogym，意大利)和CPX運(yùn)動氣體代謝分析儀(JAEGER，德國)。受試者測試前熱身3min，正式試驗采用預(yù)設(shè)的Bruce方案，即每3min增加速度或坡度直至力竭，通氣數(shù)據(jù)由氣體代謝分析儀自動采集。

判定VO2max標(biāo)準(zhǔn):①繼續(xù)運(yùn)動后攝氧量的差小于5%或150mL/min或2mL/kg.min;②心率超過180次/min，呼吸商超過1.10;③受試者體力達(dá)到力竭，不能保持規(guī)定速度;④繼續(xù)運(yùn)動時攝氧量出現(xiàn)下降［13］。

判定VT標(biāo)準(zhǔn):將肺通氣量(VE)、二氧化碳呼出量、心率、吸氧量等指標(biāo)急劇增加的拐點定義為VT。

(3)RE測試:參照席翼方法［13］，設(shè)備同前。受試者空腹，適應(yīng)跑臺5min，設(shè)定坡度始終為0，正式實驗采用遞增負(fù)荷運(yùn)動方式，到3min時將跑速加到11.5km/h，以該速度持續(xù)跑6min，取最后2min攝氧量的平均值即為RE值。每次實驗前校對氣體代謝分析儀，保持受試者各項測試條件一致。獲取RE(絕對值，單位:L/min)和 R-RE(VO2/Wt，單位:mL/kg/min)。

一些種類的微藻可以直接產(chǎn)生乙醇。在黑暗異養(yǎng)條件下，部分微藻可以生存并合成碳水化合物。如果建立黑暗缺氧條件，積累的淀粉的氧化反應(yīng)就會變得不完全，根據(jù)微藻種類不同，生成氫氣、二氧化碳、乙醇、乳酸、甲酸、乙酸等產(chǎn)品[38]。也可以利用基因工程等手段定向選育具有乙醇生產(chǎn)能力的微藻。

1.4 尿液UCF-miRNA表達(dá)譜檢測和實時熒光定量PCR法驗證

(1)分別于17周有氧耐力訓(xùn)練前清晨空腹安靜狀態(tài)下、PB5000測試結(jié)束后1小時內(nèi)、恢復(fù)24小時和48小時后安靜狀態(tài)接取中段尿100ml，離心，取上清，凍干濃縮備用［18］。

(2)總RNA提取和MicroRNA芯片測定UCF-miRNA表達(dá)譜。采用miRCURY RNA isolation kit(EX-300112 Exiqon)提取small RNA(＜1000nt);miRCURYTM Array Labelling kit試劑盒進(jìn)行miRNA標(biāo)記操作，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。miRNA芯片的雜交、清洗按照miRCURYTMArray microarray kit(Exiqon)試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用 Molecular Devices公司的Genepix 4000B雙通道激光圖像掃描儀以635 nm單波長進(jìn)行掃描。Genepix Pro 6.0軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)預(yù)處理后根據(jù)各張芯片的global mean進(jìn)行片間校正。使用SAM(significance analysis of microarrays，SAM.version2.1)篩選差異表達(dá)miRNA。篩選條件為:FDR(false discoveryrate)＜5%，F(xiàn)old change＞2。

(3)實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證差異表達(dá)UCF-miRNA相對表達(dá)量。尿液miRNA使用mirVanaTMPairs miRNA isolation kit(Ambion)試劑盒抽提。以10ng總RNA為模板合成cDNA，使用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Thermo)，根據(jù)mirBASE提供的miRNA種子區(qū)序列，設(shè)計莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物(北京六合華大基因公司合成)，反應(yīng)條件:65℃加熱5min，置冰中2min。然后放入 PCR儀16℃熱激30min，42℃ 60min，85℃，5min 停止反轉(zhuǎn)錄。Bio-Rad iCycler PCR System進(jìn)行qRT-PCR檢測(PCR相關(guān)試劑均購自天根生化科技有限公司)。反應(yīng)體系按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)說明書進(jìn)行配置。使用Bio-Rad iCycler PCR System進(jìn)行 Real Time PCR反應(yīng)，程序:95℃ 5min;95℃ 10s，60℃ 30s，40cycle;以上循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行65℃-95℃的融解曲線分析。每個樣品平行三次，溶解曲線為單一峰。按照2-ΔΔCt計算樣品的相對表達(dá)豐度。

1.5 UCF-miRNA差異表達(dá)譜的獲得及其與有氧耐力指標(biāo)的相關(guān)性分析

(1)計算訓(xùn)練前后R-RE變化率η(R-RE)，采用K-means法進(jìn)行聚類分析，根據(jù)聚類分析結(jié)果將學(xué)員分為對有氧訓(xùn)練的①高敏感表型組(High Response genotype Group，以下簡稱HR組)和②普通敏感表型組(Common Response genotype Group，以下簡稱CR組)。比較兩組UCF-miRNA表達(dá)水平，提取HR組UCF-miRNA差異表達(dá)譜。以相對于基線表達(dá)值比率升高或降低超過2倍為顯著性差異表達(dá)，比較 HR組和CR組UCF-miRNAs表達(dá)譜，提取HR組的UCF-miRNAs特征性表達(dá)譜。

(2)UCF-miRNA特征性表達(dá)譜/R-RE關(guān)聯(lián)模型的miRNA入選標(biāo)準(zhǔn):(1)microRNA芯片檢測結(jié)果與qRT-PCR驗證結(jié)果一致;(2)UCF-miRNA的基線表達(dá)值在HR組和CR組之間無顯著性差異(±10%以內(nèi));(3)文獻(xiàn)顯示該miRNA與運(yùn)動性適應(yīng)相關(guān)的生理過程存在關(guān)聯(lián)。

(3)計算HR組差異表達(dá)的UCF-miRNA在基線值-0h階段(以下簡稱為階段Ⅰ)和0h-24h階段(以下簡稱為階段Ⅱ)的表達(dá)量變化率η(UCF-miRNA):

η(UCF-miRNA)=［(階段終點表達(dá)量——階段起點表達(dá)量)/階段起點表達(dá)量］×100%

(4)計算η(UCF-miRNA)與各有氧耐力指標(biāo)變化率之間的Pearson相關(guān)系數(shù)，分析其相關(guān)性。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0軟件對結(jié)果進(jìn)行處理。各項指標(biāo)數(shù)據(jù)均采用“±s”表示。有氧耐力訓(xùn)練前后各項指標(biāo)的變化率η(Χ)=［(訓(xùn)練值-基礎(chǔ)值)/基礎(chǔ)值］×100%。均數(shù)間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗分析，P＜0.05表示兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。聚類分析采用k-means法。兩組數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性分析采用Bivariate過程，計算Pearson相關(guān)系數(shù)并用r表示。

2 研究結(jié)果

2.1 參訓(xùn)學(xué)員各項指標(biāo)在17周有氧訓(xùn)練前后的變化

參訓(xùn)者在17周有氧訓(xùn)練前后PB5000、VT和RE水平均有顯著提高(P＜0.05)，具體數(shù)據(jù)見表2、表3。

表2 有氧訓(xùn)練前后參訓(xùn)者PB5000和有氧耐力指標(biāo)比較±s)

表2 有氧訓(xùn)練前后參訓(xùn)者PB5000和有氧耐力指標(biāo)比較±s)

注:*P＜0.05表示有顯著性差異，下同。

檢測項目n±s基線值PB5000(秒) 114 1672.5±72.3 VO2 max(L/min) 119 3.58±0.46 VT(L/min) 119 3.00±0.36 RE(L/min) 114 2.48±0.29訓(xùn)練值PB5000(秒) 103 1552.9±63.4*VO2max(L/min) 93 3.65±0.47 VT(L/min) 93 3.02±0.41*RE(L/min) 103 2.30±0.21*

表3 有氧訓(xùn)練對參訓(xùn)者R-VO2 max、R-VT和R-RE的影響(±s)

表3 有氧訓(xùn)練對參訓(xùn)者R-VO2 max、R-VT和R-RE的影響(±s)

檢測項目 訓(xùn)練前 訓(xùn)練后 變化率PB5000 1672.5±72.3 1552.9±63.4* -0.70±0.05 R-VO2 max(mL/kg/min) 55.22±5.88 57.58±7.16* 0.029±0.033 R-VT(mL/kg/min) 45.98±4.40 46.90±6.44 0.009±0.052 R-RE(mL/kg/min) 38.41±3.52 35.98±4.05*-0.051±0.078

2.2 訓(xùn)練前后PB5000變化率與有氧耐力指標(biāo)變化率的相關(guān)性分析

參訓(xùn)者訓(xùn)練前后PB5000變化率與RE和RRE變化率相關(guān)性最強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)分別為0.721(RE)和0.763(R-RE);與 VT(r=-0.630)、RVT(r=-0.685)和R-VO2max(r=0.670)的變化率具有較強(qiáng)的相關(guān)性;與VO2max(r=-0.264)變化率呈弱相關(guān)。

2.3 對R-RE變化率進(jìn)行聚類分析結(jié)果

k-mean法對參訓(xùn)學(xué)員17周訓(xùn)練后R-RE相對于基線值變化百分率進(jìn)行聚類分析，將實驗對象分為HR組和CR組，聚類結(jié)果見圖1。

圖1 k-mean法對參訓(xùn)學(xué)員17周訓(xùn)練后R-RE相對于基線值變化百分率聚類分析散點圖。聚類中心分別為15.9%(HR group)和6.7%(CR group)。

比較兩組間R-RE變化率，HR組顯著高于CR組(P＜0.05)，具體結(jié)果見表7。

表4 聚類分析后各組參訓(xùn)學(xué)員R-RE相對于基線值變化百分率比較(±s)

表4 聚類分析后各組參訓(xùn)學(xué)員R-RE相對于基線值變化百分率比較(±s)

組別 n Class center R-RE HR group 20 -0.159 -0.159±0.03*CR group 71 -0.067 -0.067±0.02

2.4 HR組UCF-miRNA特征性表達(dá)譜

與CR組表達(dá)水平相比較，HR組差異表達(dá)12條UCF-miRNA。查詢文獻(xiàn)確認(rèn)已知功能與運(yùn)動性適應(yīng)有關(guān)，經(jīng)qRT-PCR確認(rèn)表達(dá)模式與基因芯片結(jié)果一致。其中8條以上調(diào)為主要特征，4條以平穩(wěn)或下調(diào)為主要特征［15-25］。UCF-miRNAs表達(dá)模式特征分別見圖2(上調(diào))和圖3(下調(diào)或保持平穩(wěn))。

2.5 差異表達(dá)的UCF-miRNA與訓(xùn)練前后PB5000變化率及R-RE變化率的相關(guān)性分析

分別檢測各個差異表達(dá)的UCF-miRNA在階段Ⅰ和階段Ⅱ相對表達(dá)量變化率與訓(xùn)練前后PB5000變化率和R-RE變化率之間的Pearson相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明:(1)階段ⅠmiR181、miR9和miR34a的變化率與訓(xùn)練前后PB5000變化率相關(guān)系數(shù)分別是 rmiR181=0.799、rmiR9=0.645、rmiR34a=0.677(P＜0.05);與訓(xùn)練前后R-RE變化率與PB5000變化率相關(guān)系數(shù)分別是 rmiR181=0.795、rmiR9=0.700、rmiR34a=0.751(P ＜0.05);(2)階段 ⅡmiR378、miR 126、miR 222、miR 146a、miR 21、miR 696和miR 192的變化率與訓(xùn)練前后R-RE變化率相關(guān)系數(shù)分別是rmiR378=0.682、rmiR126=0.723、rmiR222=0.563、rmiR1146a=0.577、rmiR21=0.522、rmiR696=0.623、rmiR192=0.842(P ＜0.05)。

3 分析與討論

本研究探討了運(yùn)動性適應(yīng)過程中UCF-miRNA表達(dá)譜與有氧運(yùn)動能力的可訓(xùn)練性之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn):具有顯著高于普通水平的R-RE變化率表型的個體在單次訓(xùn)練過程中有12個UCF-miRNA顯示出明顯特征性的表達(dá)模式，文獻(xiàn)表明，該組中miRNA參與調(diào)控運(yùn)動性適應(yīng)的基本生理過程。本研究結(jié)果顯示:該組UCF-miRNA表達(dá)量變化率與17周有氧訓(xùn)練前后PB5000和R-RE等有氧耐力指標(biāo)的變化率具有顯著的相關(guān)性。表明HR組UCF-miRNA特征性表達(dá)譜與有氧運(yùn)動能力的可訓(xùn)練性水平具有顯著的關(guān)聯(lián)性，可用來建立關(guān)聯(lián)模型對其加以鑒別和評估。本研究結(jié)果提示:運(yùn)動能力的可訓(xùn)練性水平與miRNA調(diào)控基因選擇性表達(dá)的模式有關(guān)，可以通過特征性UCF-miRNA表達(dá)譜對其加以分辨和評估?？梢岳锰卣餍缘腢CF-miRNA表達(dá)譜在有氧能力發(fā)展敏感期準(zhǔn)確預(yù)測其發(fā)展?jié)摿?，將具有相關(guān)運(yùn)動天賦的運(yùn)動員早期選拔出來加以系統(tǒng)培養(yǎng)。

運(yùn)動訓(xùn)練性敏感性與機(jī)體對訓(xùn)練應(yīng)激的適應(yīng)能力密切相關(guān)，表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控機(jī)制在機(jī)體響應(yīng)環(huán)境壓力的適應(yīng)性重塑過程中起到關(guān)鍵性作用，其調(diào)控模式?jīng)Q定了基因表達(dá)的選擇性和表達(dá)效率，進(jìn)而影響機(jī)體對環(huán)境因素的適應(yīng)能力［26］。miRNAs編輯作用是表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控的重要途徑，可能是導(dǎo)致運(yùn)動能力及其可訓(xùn)練性個體差異主要原因［27］。臨床研究已經(jīng)證實:尿液內(nèi) UCF-miRNA與機(jī)體生理病理狀態(tài)密切關(guān)聯(lián)，可以作為疾病診斷、病因分析和預(yù)后判斷的生物標(biāo)記。R-RE反映了機(jī)體的氧利用效率，是評估有氧耐力的重要指標(biāo)［13］，本研究以R-RE變化率為有氧能力的可訓(xùn)練性的標(biāo)志將實驗對象分為HR組和CR組，提取HR組UCF-miRNA特征性表達(dá)譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示:HR組差異表達(dá)的12條UCF-miRNA均與運(yùn)動性適應(yīng)過程中的基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)，其調(diào)控作用覆蓋了蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞能量代謝、線粒體生物合成、低氧適應(yīng)等適應(yīng)反應(yīng)通路，顯著改變心肌骨骼肌組織對機(jī)械應(yīng)力的響應(yīng)及重塑、線粒體有氧代謝能力及抗自由基損傷、糖脂代謝酶活性、運(yùn)動性疲勞耐受和恢復(fù)等生物過程的基因表達(dá)時序性和表達(dá)水平，其作用特點與較高的有氧耐力訓(xùn)練敏感性存在關(guān)聯(lián)。HR組UCF-miRNAs特征表達(dá)譜顯示的運(yùn)動性適應(yīng)有關(guān)的代謝調(diào)控特征符合我們對優(yōu)秀運(yùn)動員的訓(xùn)練適應(yīng)特點的經(jīng)驗性了解，說明UCF-miRNA表達(dá)特征與運(yùn)動性適應(yīng)之間存在本質(zhì)上的一致性。

圖2 HR組與CR組相比表達(dá)模式以上調(diào)為主要差異特征的UCF-miRNAs連續(xù)表達(dá)特征

圖3 HR組與CR組相比表達(dá)模式以平穩(wěn)或下調(diào)為主要差異特征的UCF-miRNAs連續(xù)表達(dá)特征

本研究分析單次運(yùn)動訓(xùn)練過程中三個特征階段的UCF-miRNA表達(dá)量變化率與有氧運(yùn)動能力各項指標(biāo)之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示:在階段Ⅰ，miR133、miR9、miR34a表達(dá)量變化率與17周有氧訓(xùn)練前后PB5000和R-RE的提高率具有顯著的相關(guān)性;在階段Ⅱ，miR378、miR126、miR222、miR146a、miR21、miR696、miR192表達(dá)量變化率與17周有氧訓(xùn)練前后R-RE的提高率具有顯著的相關(guān)性。Boggish等［18］的研究表明 miR146a表達(dá)水平與VO2max水平具有正相關(guān)關(guān)系，本研究的結(jié)果與之相近。

關(guān)于UCF-miRNA的表達(dá)行為機(jī)理及其與組織miRNA和循環(huán)miRNA的確切關(guān)系目前尚不清楚，目前無法對結(jié)果進(jìn)行深入的功能性解讀，本研究結(jié)果目前只能作為有氧能力可訓(xùn)練性的生物標(biāo)記。對于本研究發(fā)現(xiàn)的UCF-miRNA表達(dá)譜反映的運(yùn)動性適應(yīng)調(diào)控機(jī)理的深入分析有待于進(jìn)一步研究加以闡明。

本研究以尿液UCF-miRNA表達(dá)譜作為生物標(biāo)記鑒別與分析有氧運(yùn)動能力的可訓(xùn)練性的表觀遺傳學(xué)調(diào)控模式。并且建立了UCF-miRNA與有氧能力的訓(xùn)練敏感性的關(guān)聯(lián)模型和一種簡便易行的無創(chuàng)檢測方案，可以用于早期評估有氧運(yùn)動能力的發(fā)展?jié)摿陀?xùn)練適應(yīng)狀態(tài)。

4 研究結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)典型有氧訓(xùn)練周期的單次訓(xùn)練過程中UCF-miRNAs表達(dá)譜與有氧運(yùn)動能力的訓(xùn)練敏感性之間存在密切的聯(lián)系并初步建立了關(guān)聯(lián)模型，同時也提出了一種采用表觀遺傳學(xué)指標(biāo)進(jìn)行運(yùn)動員選材和指導(dǎo)訓(xùn)練的無創(chuàng)檢驗方法，以UCF-miRNAs表達(dá)特征作為生物標(biāo)記評估運(yùn)動能力的發(fā)展?jié)摿陀?xùn)練適應(yīng)狀態(tài)。

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