陳 靜，夏永輝，譚麗萍，程 羽

(云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明650500)

支氣管哮喘(哮喘)是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。氣道重塑是哮喘的一大重要病理學(xué)特征，其本質(zhì)就是氣道纖維化和膠原沉積。氣道重塑可加重氣道高反應(yīng)性，導(dǎo)致肺功能持續(xù)性與進行性損害，從而增加了臨床上哮喘的難治性［1］，有效改善氣道重塑成為哮喘防治的新方向。TGF－β1是迄今已知最強的致纖維化因子之一，也是導(dǎo)致哮喘氣道重塑的主要調(diào)控因子［2］。MMP－9是降解細胞外基質(zhì)(ECM)的主要成分，在生理和病理情況下有利于組織重構(gòu)［3－4］。中醫(yī)多數(shù)醫(yī)家認同哮喘是由于宿痰伏肺，外邪入侵或遇誘因引觸，津血同源，各種原因?qū)е卵３绅?，津聚為痰，痰瘀互結(jié)，津、血運行受礙，病情遷延。故在不同證型的氣道纖維化中瘀血都成為了重要病理產(chǎn)物，活血化瘀成為治療器官纖維化的重要方法［5］。本研究觀察了中醫(yī)活血化瘀法對哮喘大鼠氣道重塑后肺組織及TGF－β1、MMP－9的影響，旨在探討活血化瘀法干預(yù)氣道重塑的作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 實驗資料

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠30只，4～6周齡，體質(zhì)量(180±20)g，購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，動物許可證編號:SCXK(川)2013－24，合格證號:0018160。

1.2 試劑及儀器 雞卵清蛋白(OVA)、氫氧化鋁凝膠(Sigma公司，美國);大鼠 TGF－β1ELISA試劑盒、大鼠 MMP－9 ELISA試劑盒(蘇州卡爾文生物科技有限公司);酶標儀(美國分子儀器公司);壓縮霧化器(Pari Turboboy，德國);臺式高速離心機(BECKMAN公司，美國);自備有機玻璃霧化箱(45 cm ×35 cm ×20 cm)。

1.3 實驗藥物 活血化瘀法所選藥物由丹參20 g、紅花9 g、桑白皮15 g、白芥子12 g、浙貝母15 g組成，購于昆明福林堂藥業(yè)有限公司，以水煎法進行藥液濃縮，每毫升藥液含生藥1 g，根據(jù)成人(60 kg)臨床一日用藥量換算出大鼠(200 g)等效用藥量，以上劑量均根據(jù)動物體表面積等效劑量換算。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備及分組 將SD雄性大鼠30只隨機分成正常組、模型組、藥物干預(yù)組，每組10只。模型組和藥物干預(yù)組第1天和第14天腹腔注射OVA－氫氧化鋁混懸液(OVA 1 mg，氫氧化鋁100 mg，加生理鹽水至2 mL)2 mL致敏，于實驗第21天起將大鼠置于密閉容器內(nèi)，予2%OVA生理鹽水霧化激發(fā)，每次30 min，隔天1次，連續(xù)激發(fā)8周，藥物干預(yù)組于每次激發(fā)前30 min灌胃給予上述中藥水煎劑1．3 mL。正常組用生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)。實驗中觀察大鼠反應(yīng)，出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促深快、腹肌抽搐、煩躁嗆咳及點頭運動等癥狀表明建立哮喘模型成功［6］。

1.4.2 組織病理切片制備 各組大鼠末次激發(fā)后24 h，打開胸腔取下左肺組織，中性甲醛固定，石蠟包埋后切片，HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察細支氣管、血管及肺泡的病理改變情況。1.4.3 指標檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)檢測各組大鼠肺組織勻漿上清液TGF－β1、MMP－9水平。參照試劑盒說明書進行，通過標準品吸光度(A)值繪制標準曲線，然后計算各樣本的值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16．0軟件進行統(tǒng)計分析處理，結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示。各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，采用LSD法檢驗，進行多組間均數(shù)的多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動物死亡情況 模型組死亡3只，藥物干預(yù)組死亡2只。

2.2 肺組織病理學(xué)改變 正常組大鼠氣道周圍無炎性細胞浸潤，支氣管管腔規(guī)則，氣道黏膜上皮及肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔窄，氣道平滑肌薄，肺泡腔透亮，無上皮脫落損傷，黏膜無水腫，見圖1。模型組大鼠氣道周圍大量密集炎細胞浸潤，可見黏液栓，肺泡融合、不同程度斷裂，充血水腫，杯狀細胞增生，平滑肌增生，見圖2。藥物干預(yù)組大鼠支氣管管壁趨于正常，上皮結(jié)構(gòu)較完整，管壁未見增厚，浸潤的炎性細胞減少，無明顯炎性滲出，見圖3。

圖1 正常組肺組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE×200)

圖2 模型組肺組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE×200)

圖3 藥物干預(yù)組肺組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE×200)

2.3 肺組織勻漿TGF－β1及MMP－9水平比較 模型組肺組織TGF－β1及MMP－9水平均明顯高于正常組(P均＜0.05);藥物干預(yù)組肺組織TGF－β1及MMP－9水平均明顯低于模型組(P均＜0.05)，TGF－β1水平仍高于正常組(P＜0.05)，MMP－9水平與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺組織勻漿TGF－β1及MMP－9水平比較(±s，ng/mL)

表1 各組大鼠肺組織勻漿TGF－β1及MMP－9水平比較(±s，ng/mL)

注:①與正常組比較，P＜0．05;②與模型組比較，P＜0．05;③與正常組比較，P ＜0．05。

10 1．05 ±0．25 1．99 ±0．29模型組 7 1．99±0．18① 3．01±0．31①藥物干預(yù)組 8 1．31±0．20②③ 2．25±0．28 MMP－9正常組組別 n TGF－β1②

3 討 論

氣道重塑是哮喘發(fā)展到一定階段氣道出現(xiàn)的不可逆改變，也是哮喘難治的重要原因之一。目前，哮喘治療主要是控制癥狀、抗炎、免疫療法，從改善氣道重塑的角度進行哮喘治療的藥物很少，作用也不理想，因此，從氣道重塑的調(diào)控因子入手，用藥物控制細胞因子的含量從而干預(yù)氣道重塑是治療難治性哮喘的一個新思路。

TGF－β是哮喘氣道重塑的主要調(diào)控因子，其中以TGF－β1活性最強。作為促纖維化的關(guān)鍵因子，TGF－β1可促進平滑肌細胞和杯狀細胞肥大增生，增加膠原和纖連蛋白合成并促進氣道膠原沉積和基底膜增厚，促進結(jié)締組織蛋白合成，從而導(dǎo)致管腔狹窄和不可逆的肺功能改變［7］。MMP－9是特異性降解ECM的鋅依賴性蛋白酶家族，作為與哮喘氣道重塑關(guān)系最為密切的基質(zhì)金屬蛋白酶，其主要負責降解ECM，哮喘狀態(tài)下，MMP－9的過度表達不僅能導(dǎo)致ECM結(jié)構(gòu)重建，而且還能誘導(dǎo)嗜酸粒細胞遷移并影響氣道平滑肌細胞增殖與遷移，進而誘發(fā)哮喘氣道重塑［8］。因此，抑制TGF－β1和MMP－9表達可減輕哮喘氣道重塑［9－10］。

哮喘在中醫(yī)屬“哮病”范疇，傳統(tǒng)認為宿痰伏肺是哮喘的夙根，但現(xiàn)代中醫(yī)從痰的產(chǎn)生機制和臨床實踐分析，認為痰瘀密切相關(guān)，相互影響。各種原因?qū)е卵３绅觯蚓蹫樘?，產(chǎn)生瘀血、痰濁等病理產(chǎn)物，痰濁、瘀血有形之邪阻滯肺絡(luò)，搜逐不易，致肺管狹窄，使無形之氣不能宣降，痰瘀互結(jié)，氣道狹窄，更致津血運行受礙，使病情纏綿難愈［11］。曹世宏認為，肺燥陰傷和肺氣虛冷是哮喘的主要病機，但兩者均可導(dǎo)致瘀血，瘀血一旦形成又可影響氣機的宣暢，陰津陽氣難以布達，使肺纖維化形成加重［12］。因此，活血化瘀是治療器官纖維化的重要方法。

中醫(yī)藥治療哮喘有著幾千年的實踐經(jīng)驗，形成了一套完整的理法方藥體系，在防治哮喘上有獨特優(yōu)勢。近年來對中藥的研究表明，活血化瘀藥物能改善結(jié)締組織代謝，抑制纖維母細胞合成膠原，使病變的膠原纖維變細、疏松化，對增生性病變組織有不同程度的軟化和吸收作用［13］。本研究在深入探討哮喘氣道重塑中醫(yī)病因病機的基礎(chǔ)上，利用中藥多靶點、多調(diào)控途徑的特點和優(yōu)勢，選擇活血化瘀法作為治則治法對哮喘氣道重塑進行干預(yù)調(diào)控，結(jié)果顯示活血化瘀法干預(yù)后，大鼠肺組織炎細胞浸潤減少，支氣管管壁和平滑肌增生程度減輕，氣道重塑逐漸改善，肺組織TGF－β1、MMP－9水平較模型組明顯下降。表明TGF－β1、MMP－9是哮喘氣道重塑的重要調(diào)控因子，監(jiān)測TGF－β1、MMP－9的表達有助于了解氣道重塑的發(fā)生時間及發(fā)展程度;活血化瘀法能有效干預(yù)和阻斷哮喘氣道重塑的發(fā)生發(fā)展，其機制可能是通過抑制TGF－β1、MMP－9表達而實現(xiàn)的。藥物干預(yù)后大鼠肺組織TGF－β1仍高于正常組，主要考慮氣道重塑是哮喘持續(xù)發(fā)展的病理結(jié)果，用藥物干預(yù)和阻斷氣道重塑需要一定的時間。

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