趙海勇，丁紅梅，劉建華，邢冬紅，劉弘毅，魏蔚，鄭芳△

鈣網(wǎng)織蛋白促進(jìn)新生血管形成在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用

趙海勇1，丁紅梅2，劉建華3，邢冬紅4，劉弘毅4，魏蔚5，鄭芳4△

目的探討鈣網(wǎng)織蛋白（CRT）促進(jìn)新生血管形成在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）發(fā)病機(jī)制中的作用。方法采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)活動(dòng)期RA患者、骨性關(guān)節(jié)炎（OA）患者和健康對(duì)照組（HC）血清以及RA和OA患者關(guān)節(jié)滑膜液中CRT的含量。采用免疫組織化學(xué)（IHC）法檢測(cè)CRT在RA和OA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中的表達(dá)。應(yīng)用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）體外模型，分別采用MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及構(gòu)建體外血管生成的三維模型檢測(cè)CRT在HUVECs增殖、遷移及管腔形成中的作用。結(jié)果RA組血清中CRT含量［（6.4±3.1）μg/L］明顯高于OA組［（3.7±0.9）μg/L］及HC組［（3.4±1.0）μg/L］；RA組滑膜液中CRT含量［（6.9±3.4）μg/L］明顯高于OA組［（3.9±0.7）μg/L］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。CRT在RA滑膜組織中高表達(dá)，主要位于滑膜襯里層和襯里下層的血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管周?chē)?、炎性?xì)胞內(nèi)外等，而OA滑膜組織中CRT僅見(jiàn)極少量的表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及體外血管生成三維模型檢測(cè)結(jié)果顯示，CRT具有明顯促進(jìn)HUVECs增殖、遷移及管腔形成的作用。結(jié)論CRT在RA患者血清、滑膜液及滑膜組織中表達(dá)均升高，CRT可能通過(guò)促進(jìn)新生血管形成參與RA滑膜炎和血管翳形成的發(fā)病機(jī)制。

關(guān)節(jié)炎，類(lèi)風(fēng)濕；新生血管形成；鈣網(wǎng)織蛋白

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見(jiàn)的全身性自身免疫性疾病，患病率約占世界人口總數(shù)的0.5%～1%［1］。RA的主要病理表現(xiàn)為持續(xù)的滑膜炎和血管翳形成，繼而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨、骨及周?chē)M織的破壞，關(guān)節(jié)間隙變窄，最終導(dǎo)致不同程度的殘疾，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，給社會(huì)及家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。RA的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確。近年來(lái)有研究表明，鈣網(wǎng)織蛋白（calreticulin，CRT）可能參與了RA的發(fā)病機(jī)制。CRT是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+結(jié)合蛋白，普遍存在于高等生物的細(xì)胞中。CRT還在細(xì)胞膜表面及細(xì)胞外環(huán)境中表達(dá)，并發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用［2］。目前關(guān)于CRT在RA發(fā)病機(jī)制中作用的研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)分析CRT在RA患者體內(nèi)的表達(dá)及在新生血管形成機(jī)制中的作用，進(jìn)一步探討CRT在RA診斷和治療中的潛在價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012年12月—2014年6月來(lái)自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院感染免疫科和唐山市第二醫(yī)院關(guān)節(jié)外科中心的患者，其中血清標(biāo)本包括活動(dòng)期的RA患者106例，骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）患者75例，選取同期收集的來(lái)自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院的80例性別、年齡匹配的健康體檢者作為健康對(duì)照組（HC），各組基本資料見(jiàn)表1。關(guān)節(jié)滑膜液和滑膜組織標(biāo)本取自行關(guān)節(jié)置換術(shù)的25例RA患者和22例OA患者。所有RA患者的臨床診斷均符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有OA患者的臨床診斷均符合1995年ACR的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過(guò)了天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)，并取得了受試者的知情同意。

Tab.1Clinical characteristics of the patients in each group表1 入組患者與健康對(duì)照組的臨床基本資料

1.2 方法

1.2.1 采集標(biāo)本采集受試對(duì)象的空腹肘正中靜脈血2 mL，3 000 r/min離心10 min，分離血清后保存于-80℃待用。關(guān)節(jié)滑膜液和滑膜組織標(biāo)本為患者行關(guān)節(jié)置換手術(shù)時(shí)獲取，采集滑液3～5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清保存于-80℃待用。關(guān)節(jié)滑膜組織取約2 cm×2 cm，10%甲醛溶液固定，室溫保存。

1.2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的分離培養(yǎng)采集15～20 cm長(zhǎng)的新生兒臍帶標(biāo)本，采用膠原酶臍帶灌注消化法分離HUVECs并進(jìn)行體外培養(yǎng)。選用5代以?xún)?nèi)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)血清和滑膜液中CRT的含量血清和滑膜液中CRT的含量采用雙抗體夾心96孔ELISA試劑盒（上海鑫樂(lè)生物科技有限公司）檢測(cè)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.4 免疫組織化學(xué)（IHC）方法檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜組織中CRT的表達(dá)制作RA和OA患者滑膜組織病理切片，行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀(guān)察CRT在局部關(guān)節(jié)滑膜組織中的表達(dá)。

1.2.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRT對(duì)HUVECs增殖的作用將HUVECs（100 μL）按2×103個(gè)/孔接種到96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～60%融合時(shí)，更換含不同質(zhì)量濃度CRT（0、1、5、10、50 μg/L）的低血清（1%FBS）DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。每孔避光加入MTT溶液（20 μL，5 g/L），混勻后繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO），振蕩使結(jié)晶物溶解，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm各孔的吸光度（A）值。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRT對(duì)HUVECs遷移的作用預(yù)先用marker筆在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的背面均勻地劃線(xiàn)。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以2×105/mL接種，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，置于5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞均勻長(zhǎng)滿(mǎn)孔底后，用無(wú)菌槍頭垂直于培養(yǎng)板背面的水平線(xiàn)劃痕，每孔均勻劃3條，棄去培養(yǎng)基，然后用PBS洗3次，加入含CRT（10μg/L）的低血清（1%FBS）DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24～36 h。含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF，40μg/L）的低血清（1%FBS）DMEM培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞遷移情況。應(yīng)用Image J軟件計(jì)算劃痕區(qū)域愈合面積，愈合率=（初始劃痕面積-現(xiàn)劃痕面積）/初始劃痕面積×100%。

1.2.7 體外血管生成三維模型的構(gòu)建取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為2×105/mL，置于冰上備用。將200 μL鼠尾Ⅰ型膠原液（5 g/L）加到12 μL 0.1 mol/L NaOH中，立即混勻。再加入23 μL 10×DMEM溶液，混勻。然后加入760 μL細(xì)胞懸液及CRT標(biāo)準(zhǔn)液20 μL，充分混勻后加至細(xì)胞培養(yǎng)板中，VEGF（40μg/L）為陽(yáng)性對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板在室溫下放置20 min，待膠凝固后，加入完全高糖的DMEM培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)。24 h后在倒置顯微鏡下觀(guān)察管腔形成情況并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，多組間計(jì)量資料比較采用one-way ANOVA，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRT在血清和滑液中的含量RA患者血清中CRT含量顯著高于OA組及HC組，而OA與HC組間CRT水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。RA患者關(guān)節(jié)滑膜液中CRT含量明顯高于OA患者（P＜0.01）。RA患者血清與關(guān)節(jié)滑膜液中CRT含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.712，P＞0.05），見(jiàn)表2。

2.2 CRT在滑膜組織中的表達(dá)HE染色結(jié)果顯示，RA滑膜組織中呈現(xiàn)典型的滑膜炎性病理學(xué)特征，滑膜細(xì)胞增生、肥大，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，新生血管形成等。而OA患者滑膜組織中僅見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CRT在RA滑膜組織中大量表達(dá)，主要位于滑膜襯里層和襯里下層的血管內(nèi)皮細(xì)胞及其周?chē)?，炎性?xì)胞內(nèi)外等。OA滑膜組織中，CRT僅見(jiàn)極少量的表達(dá)。見(jiàn)圖1。

Tab.2Comparison of serum and synovial fluid CRT levels between groups表2 CRT在各組血清及滑膜液中的含量比較（μg/L，）

Tab.2Comparison of serum and synovial fluid CRT levels between groups表2 CRT在各組血清及滑膜液中的含量比較（μg/L，）

＊＊P＜0.01；a與HC組比較，b與OA組比較，P＜0.01

組別HC OA RA F或t血清n 80 75 106 CRT 3.4±1.0 3.7±0.9 6.4±3.1ab58.043＊＊滑膜液n 22 25 CRT -3.9±0.7 6.9±3.4 4.059＊＊

Fig.1The pathological results of RA and OA synovial tissues圖1 RA與OA患者滑膜組織病理學(xué)檢查結(jié)果

2.3 CRT對(duì)HUVECs增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，CRT質(zhì)量濃度為≤5 μg/L時(shí)，對(duì)HUVECs增殖的作用較弱，CRT質(zhì)量濃度升至10 μg/L及以上時(shí)，具有明顯促進(jìn)HUVECs增殖的作用（P＜0.05），CRT的作用呈濃度依賴(lài)性，見(jiàn)圖2。在后續(xù)HUVECs遷移及管腔形成的實(shí)驗(yàn)中，選用CRT的質(zhì)量濃度為10 μg/L。

Fig.2Effect of CRT on the proliferation of HUVECs圖2 CRT對(duì)HUVECs增殖的影響

2.4 CRT對(duì)HUVECs遷移的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入10 μg/L CRT組的細(xì)胞與對(duì)照組相比，細(xì)胞發(fā)生了明顯的遷移，細(xì)胞劃痕大部分被修復(fù)，與陽(yáng)性對(duì)照VEGF組具有相似的促進(jìn)HUVECs遷移的作用，見(jiàn)圖3。

Fig.3Effect of CRT on the migration of HUVECs圖3 CRT在HUVECs遷移中的作用

2.5 CRT對(duì)體外管腔形成作用的影響CRT（10 μg/L）組可見(jiàn)膠內(nèi)血管樣結(jié)構(gòu)的分支之間相互溝通連接形成復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與陽(yáng)性對(duì)照VEGF作用相似，而對(duì)照組沒(méi)有形成此種血管結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖4。

Fig.4Effect of CRT on the tube formation of HUVECs圖4 CRT對(duì)HUVECs管腔形成的影響

3 討論

3.1 新生血管與RA發(fā)病RA是最常見(jiàn)的炎性關(guān)節(jié)病，其病理改變主要表現(xiàn)為滑膜炎和血管翳的形成，而新生血管形成是產(chǎn)生和維持RA血管翳的重要因素。新生血管形成是由內(nèi)皮細(xì)胞、黏附分子及細(xì)胞因子參與的協(xié)調(diào)有序的過(guò)程，其形成主要是由滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的炎性介質(zhì)激活內(nèi)皮細(xì)胞并使其發(fā)生增殖、遷移及管腔形成等過(guò)程［3］。新生血管可以維持RA的炎癥狀態(tài)并向病變部位提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣以維持疾病的遷延不愈，阻斷新生血管進(jìn)而抑制滑膜炎和血管翳的形成可能成為RA治療的新靶點(diǎn)［4-5］。

3.2 CRT參與RA炎癥反應(yīng)CRT是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+結(jié)合蛋白，起著維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)和分子伴侶的重要作用。此外，CRT還出現(xiàn)在細(xì)胞膜表面及胞外環(huán)境中，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的黏附、遷移以及細(xì)胞凋亡和抗腫瘤免疫應(yīng)答等過(guò)程［6-9］。近年來(lái)研究顯示，CRT以及炎性標(biāo)志物血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A，SAA）等在RA患者體液中表達(dá)升高，可用來(lái)評(píng)估RA疾病的活動(dòng)程度［10-13］。Ling等［14］研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜表面的CRT可作為RA共享表位（shared epitope，SE）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體介導(dǎo)NO促氧化信號(hào)通路，且瓜氨酸化的CRT能增強(qiáng)SE信號(hào)［15］。此外，CRT還可通過(guò)與凋亡蛋白FasL結(jié)合，在T淋巴細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用［10］。

3.3 CRT在RA患者體內(nèi)的表達(dá)本課題組首先檢測(cè)了CRT在RA患者體內(nèi)的整體表達(dá)。結(jié)果顯示，RA患者血清、滑膜液及滑膜組織中CRT的表達(dá)均顯著增高。滑膜液和滑膜組織均取自局部病變部位，它們的變化更能準(zhǔn)確地反映疾病的狀態(tài)。本研究結(jié)果提示CRT可能參與了RA發(fā)病的病理過(guò)程，即關(guān)節(jié)滑膜炎和血管翳的形成。筆者預(yù)期會(huì)在局部病變的滑膜液中檢測(cè)到更高濃度的CRT，但檢測(cè)結(jié)果顯示滑膜液與血清中CRT水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。原因之一可能是納入本研究的樣本例數(shù)偏少，本研究中滑膜液標(biāo)本取自關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者，標(biāo)本采集比較困難。另一方面，盡管滑膜液標(biāo)本取自新入院RA患者，術(shù)前的治療也可能影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.4 CRT在RA新生血管形成中的作用新生血管形成是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過(guò)程，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及芽生形成管腔是新生血管形成的關(guān)鍵步驟。本研究進(jìn)一步探討CRT對(duì)HUVECs增殖、遷移及管腔形成的影響。結(jié)果顯示，CRT具有促進(jìn)HUVECs增殖的作用，CRT作用呈濃度依賴(lài)性。且CRT還具有直接刺激HUVECs遷移和管腔形成的作用，與VEGF作用相似。此外，本研究體外實(shí)驗(yàn)中所用CRT濃度為10 μg/L，與在RA患者體內(nèi)檢測(cè)到的CRT濃度相接近，提示CRT在RA患者體內(nèi)可能發(fā)揮同樣的作用。

綜上所述，CRT在RA患者體內(nèi)表達(dá)升高，可能通過(guò)促進(jìn)新生血管形成參與了RA滑膜炎和血管翳形成的病理過(guò)程，其在RA發(fā)病機(jī)制中的作用還需進(jìn)一步深入研究。

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（2015-04-16收稿2015-04-28修回）

（本文編輯李鵬）

Increased expression of calreticulin promotes angiogenesis involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis

ZHAO Haiyong1，DING Hongmei2，LIU Jianhua3，XING Donghong4，LIU Hongyi4，WEI wei5，ZHENG Fang4△
1 Department of Orthopedics，Tangshan Worker′s Hospital，Tangshan 063000，China；2 Department of Clinical Laboratory，The Second Hospital of Tangshan；3 Department of Hand Surgery，The Second Hospital of Tangshan；4 School of Laboratory Medicine，Tianjin Medical University；5 Department of Rheumatology，General Hospital of Tianjin Medical University△

ObjectiveCalreticulin（CRT）is a multifunctional protein of endoplasmic reticulum implicated in the pathogenesis of rheumatoid arthritis（RA）.The present study was undertaken to determine whether CRT was involved in an?giogenesis events in RA.MethodsSerum CRT levels were measured by enzyme-linked immnuosorbent assay（ELISA）in 106 patients with established RA，75 osteoarthritis（OA）and 80 healthy controls（HC）.CRT levels in synovial fluid were al?so measured in 25 RA and 22 OA patients.The expression of CRT in synovial tissue was examined by immunohistology.In order to investigate the role of CRT on angiogenesis，human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）were isolated and cultured for in vitro experiments.The proliferation，migration and tube formation of HUVECs following CRT stimulation were examined in vitro by MTT assay，scratch wound healing assay and tube formation assay.ResultsOur results showed a sig?nificantly higher concentration of CRT in serum［（6.4±3.1）μg/L］of RA patients compared to that of OA［（3.7±0.9）μg/L，P＜0.01］and HC［（3.4±1.0）μg/L，P＜0.01］；and significantly higher CRT in synovial fluid［（6.9±3.4）μg/L］of RA vs OA［（3.9± 0.7）μg/L，P＜0.01］.Increased CRT expression predominantly localized to vascular endothelial cells，inflammatory cells and perivascular areas in both the lining and sublining layers of RA synovial tissue.Furthermore，CRT significantly promoted the proliferation，migration and tube formation of HUVECs，as showed by MTT assay，scratch wound healing assay and tube for?mation assay.ConclusionThese findings suggested that CRT may be involved in synovitis and pannus formation events via promoting angiogenesis in RA.

arthritis，rheumatoid；angiogenesis；calreticulin

R593.22

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.017

教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目（20101202110008）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目（14JCYBJC25600）

1河北省唐山市工人醫(yī)院骨外一科（郵編063000）；2河北省唐山市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，3手三科；4天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院；5天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

△通訊作者E-mail：fangzheng@tmu.edu.cn