程煥芝，高秀秋

Wnt3a在慢性牙周炎中的表達及臨床意義

程煥芝，高秀秋△

目的探討Wnt3a在慢性牙周炎患者牙齦組織中的表達及其與附著喪失的關(guān)系。方法選擇15例慢性牙周炎患者（牙周炎組）和15例牙周健康者（對照組），臨床檢查記錄2組的探診深度和附著喪失水平，采用RT-PCR和Western-Blot檢測牙齦組織中Wnt3a的表達水平，并分析Wnt3a蛋白表達與附著喪失的相關(guān)性。結(jié)果牙周炎組的探診深度高于對照組（mm：7.93±1.56 vs 1.83±0.37），其臨床附著喪失為（7.76±1.34）mm，而對照組的口腔檢查中未見臨床附著。與對照組比較，牙周炎組的牙齦組織中Wnt3a mRNA（0.49±0.03 vs 0.36±0.04）和蛋白的表達水平（0.57±0.14 vs 0.43±0.17）均較低（t分別為12.015和2.381，P＜0.05）。并且，附著喪失的程度與牙周炎患者牙齦組織中Wnt3a蛋白的表達呈負相關(guān)（r=-0.564，P=0.028）。結(jié)論Wnt3a在慢性牙周炎中表達下調(diào)，與慢性牙周炎的附著喪失有密切關(guān)系，可能在慢性牙周炎的骨吸收中起到了一定的作用。

牙周炎；慢性??；牙齦；Wnt蛋白質(zhì)類；Wnt3a；臨床附著喪失

牙周炎是以牙周支持組織（牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)）破壞為主要特征的感染性疾病，以牙周袋的形成、進行性的附著喪失和牙槽骨吸收為臨床表現(xiàn)。除牙周感染的微生物直接引起牙周組織破壞外，宿主對于感染的應(yīng)答是引起牙周組織損害的主要原因。牙槽骨吸收是牙周炎最具特征性的表現(xiàn)，是免疫炎癥反應(yīng)與骨相關(guān)細胞相互作用的結(jié)果。核因子-κB/核因子受體激活劑/核因子受體活化因子配體（NF-κB/RANK/RANKL）與破骨細胞的分化和成熟有關(guān)，是調(diào)節(jié)許多骨代謝紊亂?。ü俏?、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨癌、牙周炎）中骨喪失的關(guān)鍵因子［1］。Wnt信號的激活可以導(dǎo)致骨量增加，Wnt信號的抑制導(dǎo)致骨量減少。有關(guān)Wnt信號通路的抑制劑硬骨素（SOST）和Dickkopf相關(guān)蛋白1（DKK1）的研究［2］發(fā)現(xiàn)：抑制SOST可以增加骨密度，骨重建；DKK1的失活可以刺激骨重建，促進骨折愈合。但是關(guān)于Wnt信號通路與慢性牙周炎的相關(guān)性研究很少。本研究通過對慢性牙周炎牙齦組織中經(jīng)典Wnt通路相關(guān)蛋白Wnt3a表達的分析，為慢性牙周炎骨喪失病理機制的研究提供新的視角。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2012年9月—2013年12月在遼寧醫(yī)學(xué)院附屬二院牙周病門診就診的15例慢性牙周炎患者（牙周炎組）和15例牙周健康對照者（對照組）。所有入選對象滿足入選和排除標準。入選者已知研究目的，參加本研究潛在的危險和利益，并簽署知情同意書。納入標準：年齡35～60歲，至少有15顆牙（包括第三磨牙）。牙周炎患者依據(jù)1999年慢性牙周炎診斷標準確診，30%以上區(qū)域都有探診深度異常，臨床附著喪失大于4 mm，至少有一顆牙因為牙周炎較重而需拔除（臨床附著喪失大于7 mm并伴有探診出血）；對照組沒有臨床附著喪失，探針出血區(qū)域小于30%，僅因需要進行牙齦成形術(shù)恢復(fù)牙齦形態(tài)或?qū)ΨQ性進行手術(shù)。所有入選人員糖化血紅蛋白低于6.5%，空腹血糖3.89～6.10 mmol/L，C反應(yīng)蛋白陰性。排除標準：妊娠、哺乳期、吸煙或有5年以上吸煙史者，6個月內(nèi)進行過牙周治療或使用過抗生素者，2個月內(nèi)使用過正畸托槽或口腔局部抗菌劑者。有與牙周炎相關(guān)或與Wnt信號通路拮抗劑有關(guān)的其他系統(tǒng)疾病如免疫疾病、糖尿病、骨相關(guān)疾病及其他并發(fā)癥（骨質(zhì)疏松、強直性脊柱炎、近期骨折、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）者，長期抗炎治療（糖皮質(zhì)激素），應(yīng)用免疫抑制劑，激素替代療法，骨吸收抑制劑等，進行正畸治療或牙髓根尖周治療者。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑Trizol（Invitrogen，美國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Taka?ra）；Wnt3a、18srRNA引物合成、PCR mix（大連寶生物）；兔抗人Wnt3a、β-actin蛋白抗體（Abcam Biochemicals）；PVDF膜（邦定公司）；ECL顯色劑（上海西唐生物科技有限公司）。

1.2.2 臨床檢查應(yīng)用牙周探針探診入選牙的6個位點（取6個位點的平均值，為改牙的臨床指標），記錄探診深度和附著喪失水平（釉牙骨質(zhì)界到齦溝底的距離）。對臨床檢查的數(shù)據(jù)和分區(qū)（探診出血）的檢查結(jié)果進行一致性檢驗，kappa值大于0.85。檢測具有可重復(fù)性。

1.2.3 獲取牙齦標本牙周炎患者牙齦標本在臨床檢測后1周進行獲取。取自有拔牙指征的重度牙周炎患牙（探診深度大于7 mm并伴有探診出血），以期獲得具有代表性的牙齦組織。如患者有1個以上的牙齒有拔牙指征，則選擇牙周附著喪失最重的牙齦組織。牙周健康者為探診深度（PD）＜3 mm，因為美學(xué)要求切除牙齦。獲得的牙齦組織包括結(jié)合上皮、齦溝上皮和牙齦結(jié)締組織。切取的牙齦分為2部分，一部分在-80℃冰箱中儲存，用于RNA的提取，另一部分存放在含蛋白酶抑制劑的緩沖液中，用于Western-Blot實驗。

1.2.4 RT-PCR檢測Wnt3a mRNA的表達每3個實驗對象的組織等比例混合，利用Trizol法提取牙齦組織中的mRNA，提取的mRNA溶解在DEPC水中，-80℃保存。利用紫外分光光度計測定mRNA的濃度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄（Turbo DNA-frees，Ambion Inc.，Austin，TX，USA），得到cDNA。PCR擴增反應(yīng)體系20 μL，其中雙蒸水（dd水）7 μL，PCR mix 10 μL，引物2 μL（應(yīng)用Primer 6.0進行引物設(shè)計，見表1），cDNA模板1 μL。PCR反應(yīng)條件94℃5 min，72℃10 min。循環(huán)條件：94℃30 s，變性溫度55℃30 s，72℃30 s，40次循環(huán)。取PCR產(chǎn)物8 μL，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)儀內(nèi)掃描，使用QuantityOne軟件分析結(jié)果，以18s rRNA的灰度值進行標準校正，計算Wnt3a產(chǎn)物的相對量。

Tab.1The primer sequences and amplified fragments length of Wnt3a and internal control表1 PCR引物序列及擴增片段大小

1.2.5 Western-Blot檢測Wnt3a蛋白的表達每3個實驗對象的組織等比例混合作為一個實驗單位，制備蛋白樣品放于-80℃保存；利用Bradford試劑盒測定總蛋白含量；把樣品調(diào)成相同濃度，加入上樣緩沖液，沸水煮5 min；SDS-PAGE電泳：每例標本20 μL上樣（100 V、40 mA）電泳；轉(zhuǎn)膜：半干式電轉(zhuǎn)印，硝酸纖維膜在轉(zhuǎn)印液中平衡10 min，恒電壓50 V轉(zhuǎn)移2 h，TBST洗3次/5 min；封閉：用封閉液室溫振搖封閉1 h；4℃孵育一抗過夜；37℃孵育二抗1～2 h；化學(xué)發(fā)光，顯影，定影，凝膠圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計數(shù)據(jù)以SPSS 17.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以均值±標準差表示，2組間比較采用t檢驗。采用Pearson相關(guān)分析牙周袋深度與Wnt3a的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床檢查結(jié)果牙周炎組的探診深度（mm：7.93±1.56）高于對照組（mm：1.83±0.37），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.482，P＜0.05）；其臨床附著喪失為（7.76±1.34）mm，正常對照組患者的口腔檢查中未見臨床附著喪失。

2.2 慢性牙周炎牙齦組織中Wnt3a mRNA的表達水平與對照組（0.49±0.03）相比，牙周炎組Wnt3a的mRNA表達（0.36±0.04）顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.015，P＜0.01），見圖1。

Fig.1Transcription level of Wnt3a mRNA in chronic periodontitis and control group圖1 慢性牙周炎患者與對照組Wnt3a mRNA的表達

2.3 慢性牙周炎牙齦組織中Wnt3a蛋白的表達水平對照組Wnt3a/β-actin的比值是0.57±0.14，牙周炎組是0.43±0.17，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.381，P＜0.05），見圖2。

Fig.2Expression of Wnt3a in chronic periodontitis and control group圖2 慢性牙周炎患者與對照組Wnt3a的表達

2.4 臨床附著喪失與Wnt3a蛋白表達水平的相關(guān)性結(jié)果顯示，臨床附著喪失的程度與牙周炎患者牙齦組織中Wnt3a蛋白的表達呈負相關(guān)（r=-0.564，P=0.028）。

3 討論

牙周炎是一類以牙齦炎癥和牙槽骨吸收為主要特征的慢性炎癥性疾病，可造成牙周支持組織的進行性破壞，最終導(dǎo)致牙齒喪失。在我國慢性牙周炎導(dǎo)致的牙齒喪失已經(jīng)成為中老年人牙齒喪失最主要的原因，第三次全國口腔健康調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國45歲以上人群中80%以上存在不同程度的牙周問題。牙槽骨的吸收是牙周炎的一個主要特征。Wnt信號通路是參與骨形成和骨破壞的一個重要的信號通路，在骨質(zhì)疏松、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨癌、強直性脊柱炎、多發(fā)性骨髓瘤等疾病中發(fā)揮了重要作用［3］。但是關(guān)于Wnt信號通路與慢性牙周炎相關(guān)性的研究卻很少。Napimoga等［4］在有關(guān)人慢性牙周炎與SOST、DKK1相關(guān)性的研究中觀察到了慢性牙周炎中Wnt信號通路抑制劑SOST和DKK1表達的上調(diào)。

本研究發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎患者牙齦組織中Wnt3a配體的表達低于牙周健康者，并且牙齦組織中Wnt3a的表達量與臨床附著喪失的水平呈負相關(guān)。Zhong等［5］研究發(fā)現(xiàn)，在人類和小鼠中均可觀察到Wnt途徑的增強可最終導(dǎo)致成骨增加。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Wnt3a能抑制破骨細胞的分化成熟，抑制骨吸收，同時Wnt3a還有明顯的抗炎作用［6-7］。

慢性牙周炎中Wnt3a表達減弱，Wnt信號通路的抑制劑表達增強［3］，Wnt信號通路的增強可以增加骨量，同時體外細胞實驗觀察到：經(jīng)典的Wnt信號通路可以通過NF-κB調(diào)節(jié)破骨細胞的成熟，抑制骨吸收［8］。多數(shù)情況下，Wnt配體可以促進骨形成［9］，在脛骨可以促進骨整合。最近的一項研究證實Wnt3a通過誘導(dǎo)BMP9的表達促進堿性磷酸酶活性，同時Wnt3a還可以上調(diào)骨鈣素（OC）和骨橋蛋白（OPN）的表達［10］。這與研究中觀察到的Wnt3a的表達水平與附著喪失水平呈負相關(guān)一致。Wnt信號通路中的Wnt配體可以作為骨形成的刺激因子促進骨結(jié)合的形成，提高種植的成功率［11］。

慢性牙周炎中炎癥引起的牙槽骨吸收與Wnt3a的表達有一定的相關(guān)性，這為研究牙周炎引起的骨吸收提供了一個新的研究思路。從機體內(nèi)信號通路的方向進行研究，可能為闡明包括牙周炎在內(nèi)的一些骨破壞性疾病的病理機制提供一定的理論基礎(chǔ)，為預(yù)防和治療牙周炎提供新的靶點。

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（2014-09-18收稿2015-03-05修回）

（本文編輯魏杰）

Expression of Wnt3a in chronic periodontitis and its clinical significance

CHENG Huanzhi，GAO Xiuqiu△
The Second Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121000，China△

ObjectiveTo study the expression of Wnt3a in chronic periodontitis patients and its clinical significance. MethodsWnt3a expression was examined by RT-PCR and Western-Blot in 15 cases of chronic periodontitis gingival tis?sues and 15 normal tissues.Probe depth and attachment loss were also compared between these two groups.Correlation be?tween Wnt3a expression and attachment lose were also analyzed.ResultsProbe depth was deeper in chronic periodonititis groups than that in control group（mm：7.93±1.56 vs 1.83±0.37）.Attachment loss was（7.76±1.34）mm in chronic periodonti?tis group while it was not seen in control gorup.Wnt3a was lower both in transcription level（0.49±0.03 vs 0.36±0.04）and expression level（0.57±0.14 vs 0.43±0.17，P＜0.05）in chronic periodonitis tissue compared with that in normal tissues.The higher clinical attachment loss was negatively correlated with expression of Wnt3a（r=-0.564，P=0.028）.Conclusion Wnt3a is expressed less in chronic periodontitis than that in control group.Wnt3a plays an important role in attachment loss and bone absorption.

periodontitis；chronic disease；gingiva；Wnt proteins；Wnt3a；clinical attachment loss

R781

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.014

遼寧省自然科學(xué)基金項目（2013022024）

錦州，遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院（郵編121000）

程煥芝（1990），女，碩士研究生，主要從事牙周病的預(yù)防和治療方面研究

△通訊作者E-mail：jzgaoxiuqiu1988@163.com