孟艾，楊濤，王娉婷，王劍，隋磊△

大內徑多壁碳納米管基靶向緩釋載藥系統(tǒng)的制備及性能

孟艾1，楊濤1，王娉婷1，王劍2，隋磊1△

目的制備大內徑多壁碳納米管（LID-MWCNT）基靶向抗腫瘤藥物緩釋系統(tǒng)，分析其功能特性并檢測其對腫瘤細胞的增殖抑制作用。方法純化、切割LID-MWCNT，制備碳管載體及同源封堵物超短LID-MWCNT（UST）。碳管表面負載靶向分子葉酸（FA）及熒光標記分子；管內負載抗腫瘤藥物順鉑（CDDP），并以UST封堵藥物通道。觀察載藥系統(tǒng)顯微形態(tài)；測定載藥率及藥物釋放曲線；觀察載藥系統(tǒng)對腫瘤細胞的靶向趨化狀況及增殖抑制效應。結果成功制備大內徑多壁碳納米管基靶向抗腫瘤藥物緩釋系統(tǒng)（CDDP@UST-FA-LID-MWCNT），其載藥率為70.97%。體外釋放呈雙相緩釋模式，持續(xù)釋放時間約18 h。載體系統(tǒng)具備了一定靶向趨化能力；較低載藥濃度的CDDP@UST-FA-LID-MWCNT即對腫瘤細胞具有增殖抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強。結論載藥系統(tǒng)CDDP@UST-FA-LID-MWCNT具有較高的載藥率及良好的藥物緩釋效果，能夠靶向作用于腫瘤細胞，具有較強的抗腫瘤作用。

納米管，碳；順鉑；抗腫瘤藥；藥物載體；遲效制劑；多壁碳納米管；靶向作用；釋放模式

近年來，功能化碳納米管（CNT）載藥研究成為生物醫(yī)學領域的新興熱點［1］。CNT載藥方式分為管外載藥和管內載藥，管內載藥相較管外載藥具有以下優(yōu)勢：避免光敏感性藥物暴露在CNT載體表面可能發(fā)生的運載過程中失活；易于實現(xiàn)緩釋或控釋；避免藥物與管壁功能修飾基團競爭位點，從而確保改性效果［2-3］。然而，由于常規(guī)CNT內徑較小，造成管內載藥量較低［4-5］，成為管內載藥研究的瓶頸。大內徑多壁碳納米管（LID-MWCNT）為解決上述問題提供了可能。其內徑為常規(guī)CNT的2～3倍，管內可以容納更多生物分子。本研究旨在利用LID-MWCNT管內負載抗腫瘤藥物和超短LID-MWCNT（UST）封堵藥物釋放通道，同時管外負載葉酸（FA）作為靶向分子，以期獲得高載藥率并具有靶向緩釋性能的抗腫瘤載藥系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料LID-MWCNT（中國科學院成都有機化學有限公司），F(xiàn)A、異硫氰酸熒光素（FITC）、順鉑（CDDP）購自Sigma公司，人頜面部舌鱗癌細胞株（CAL-27）及人乳腺癌細胞株（MCF-7）均由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供。掃描電鏡（SEM，Inspect F50，F(xiàn)EI，美國），紫外可見光光度計（UV-VIS，HTS 7000 Plus，PerkinElmer，美國），透射電子顯微鏡（HR-TEM，Tecnai G2 F20，F(xiàn)EI，美國），電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP-OES；Spark公司，德國），酶標儀（HTS 7000 Plus，PerkinElmer，美國），倒置熒光顯微鏡（Olympus IX 710 microscope，日本）。

1.2 LID-MWCNT純化氧化及UST制備以本課題組前述方法［6］制備高純度氧化LID-MWCNT。使用0.1 μm孔徑的聚四氟乙烯（PTFE）膜過濾LID-MWCNT懸浮液：濾液于150℃空氣煅燒1 h獲得UST；沉淀洗滌至中性后用0.2 μm及0.1 μm孔徑的PTFE膜過濾，得到長度為100～200 nm的LIDMWCNT。150℃下煅燒30 min獲得氧化LID-MWCNT（OLID-MWCNT）。采用SEM觀察處理前后碳管的表面形貌和分散情況。

1.3 功能化LID-MWCNT的制備分別稱取20 mg O-LIDMWCNT與20 mg磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基（PEG）置于超純水中超聲2 h，過濾洗去未反應PEG。收集沉淀并重懸得到PEG-LID-MWCNT懸液。取20 mg FA溶于DMSO中，加入PEG-LID-MWCNT懸液，避光超聲2 h，洗滌重懸得到FA-LIDMWCNT懸液。用相同方法接枝熒光標記分子異硫氰酸熒光素（FITC），得到FA-LID-MWCNT-FITC懸液。采用紫外可見分光光度法觀察碳管接枝FA前后吸收光譜變化。

1.4 藥物負載及通道封堵稱取20 mg CDDP及10 mL DMSO加入到10 mL 1 g/L FA-LID-MWCNT懸液中，室溫下避光攪拌72 h。過濾洗滌，重懸沉淀得到CDDP@FA-LIDMWCNT懸液。4 mg UST加入到CDDP@FA-LID-MWCNT懸液中（含4 mg LID-MWCNT），暗室攪拌24 h。過濾洗去未反應的US-O-LID-MWCNT，重懸沉淀得到CDDP@USTFA-LID-MWCNT懸液。采用HR-TEM及SEM，觀察載藥后及封堵后載藥系統(tǒng)的顯微形貌。分別取2 mL CDDP@FALID-MWCNT及CDDP@UST-FA-LID-MWCNT懸液，ICPOES測定Pt含量。將Pt質量換算為CDDP質量后計算CDDP載藥率：載藥率=CDDP質量/LID-MWCNT質量×100%。

1.5 CDDP體外釋放實驗使用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）和醋酸緩沖液（pH 5.5）體外模擬中性以及酸性體液環(huán)境。分別取2 mL CDDP@FA-LID-MWCNT及CDDP@UST-FA-LIDMWCNT懸液裝入截留相對分子質量為1 000的透析袋內，置于198 mL緩沖液中，于37℃水平恒溫振蕩器內進行動態(tài)透析；分別于0.25、0.5、1、3、6、12、24、48、72 h后取出緩沖液2 mL，同時補充2 mL新鮮緩沖液。ICP-OES測定不同時間點懸液中Pt的含量，獲得CDDP在中性和酸性條件下的體外釋放曲線。

1.6 載藥系統(tǒng)靶向性測定取對數(shù)生長期的CAL-27及MCF-7細胞，分別接種于6孔板中，孵育24 h，加入1 mL CDDP@UST-FA-LID-MWCNT-FITC及CDDP@UST-LIDMWCNT-FITC懸液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，以4%多聚甲醛固定15 min，1.2μmol/L DAPI染色5 min，洗去游離染料后于倒置熒光顯微鏡下觀察2組載藥系統(tǒng)細胞內外的分布情況。

1.7 載藥系統(tǒng)的細胞毒性實驗采用CCK-8法檢測空載體及不同CDDP濃度載藥系統(tǒng)對細胞增殖的影響。將細胞接種于96孔板中，分為4組，每組5個復孔。FA-LID-MWCNT組分別加入質量濃度為2.5、5、10、20、40和80 mg/L的FALID-MWCNT懸液。其他3組分別加入2.5、5、10、20、40和80 mg/L CDDP等效濃度的CDDP、CDDP@FA-LID-MWCNT及CDDP@UST-FA-LID-MWCNT懸液，共培養(yǎng)24 h后加入10 μL CCK-8溶液，低速振蕩10 min，繼續(xù)孵育2 h后常規(guī)檢測各孔光密度（OD）值并計算細胞存活率。

1.8 統(tǒng)計學方法應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，采用方差分析進行組間比較，多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 功能化LID-MWCNT表征SEM觀察結果顯示，未處理的LID-MWCNT碳管彎曲，分散性差，長度為5～10 μm；管壁表面存在大量無定形碳、金屬顆粒等雜質粒子，見圖1a。經氧化處理后，碳管管間團聚程度減弱，碳管長度減小；管壁出現(xiàn)大量孔洞，表面雜質被去除。所得O-LID-MWCNT經濾膜篩選后長度為100～200 nm者被用于管內負載藥物，見圖1b。而長度小于100 nm者被用于封堵藥物釋放通道，見圖1c。紫外-可見吸收光譜結果表明通過酰胺化反應，F(xiàn)A成功接枝到管壁表面，見圖2。

Fig.2UV-Vis spectra of PEG-LID-MWCNT，F(xiàn)A，and FA-LID-MWCNT圖2 PEG-LID-MWCNT、FA、FA-LID-MWCNT紫外-可見吸收光譜

2.2 載藥體系觀察及載藥率計算HR-TEM結果顯示載藥反應后O-LID-MWCNT載體管內存在平均直徑為1～2 nm的黑色圓點，見圖3a，并由能量色散X射線檢測證實其為CDDP，見圖3b。SEM觀察顯示US-O-LID-MWCNT與載藥系統(tǒng)反應后結合在載體管外壁表面及末端開口處，實現(xiàn)了對藥物進出通道的封堵，見圖3c。而隨時間的延長，US-OLID-MWCNT封堵物逐漸與載體脫離，管內藥物進而得到釋放，見圖3d。計算得CDDP@UST-FALID-MWCNT的載藥率為70.97%；而未封堵的CDDP@FA-LID-MWCNT載藥率為84.28%。

2.3 體外釋放模式未以US-O-LID-MWCNT封堵的CDDP@FA-LID-MWCNT呈單相釋放模式，在最初3 h內釋放率達81%～82%，而在之后的69 h內釋放量僅約10%；CDDP@UST-FA-LID-MWCNT呈雙相釋放模式，在最初3 h內藥物釋放57%～58%，隨后15 h內緩慢釋放約22%～24%，之后54 h內釋放極少；釋放曲線受pH影響不明顯，見圖4。

Fig.4The CDDP release profile of drug delivery system under different pH圖4 封堵及未封堵載藥系統(tǒng)在不同pH環(huán)境中的CDDP釋放曲線

2.4 載藥系統(tǒng)的靶向性觀察CDDP@UST-FALID-MWCNT-FITC及CDDP@UST-LID-MWCNTFITC分別作用于CAL-27和MCF-7細胞后的分布見圖5。大部分CDDP@UST-FA-LID-MWCNTFITC位于細胞質內，且其細胞攝入量明顯高于未接枝FA的CDDP@UST-LID-MWCNT-FITC。

2.5 載藥系統(tǒng)對腫瘤細胞增殖的影響CCK-8結果顯示不同濃度FA-LID-MWCNT懸液分別作用于細胞CAL-27和MCF-7 24 h后，細胞存活率均在90%以上。游離CDDP、CDDP@FA-LID-MWCNT和CDDP@UST-FA-LID-MWCNT分別作用于細胞CAL-27和MCF-7 24 h后，細胞的存活率隨管內CDDP濃度增加而降低。在CDDP等效質量濃度為10、20、40 mg/L時，CDDP@UST-FA-LID-MWCNT對CAL-27細胞的細胞毒性顯著高于其他實驗組（P＜0.05）；在CDDP等效質量濃度為10、20 mg/L時，CDDP@UST-FA-LID-MWCNT對MCF-7細胞的細胞毒性顯著高于其他實驗組（P＜0.05），見圖6。

Fig.6The viability of CAL-27 cells（a）and MCF-7 cells（b）with different concentration of FA-LID-MWCNT，CDDP@UST-FA-LIDMWCNT，CDDP@FA-LID-MWCNT，and CDDP圖6 經不同濃度FA-LID-MWCNT、CDDP@UST-FA-LIDMWCNT、CDDP@FA-LID-MWCNT及CDDP處理后CAL-27（a）細胞及MCF-7（b）細胞的存活率

3 討論

LID-MWCNT的發(fā)現(xiàn)為解決CNT管內載藥空間有限的問題提供了新的可能。本課題組已建立了有效純化LID-MWCNT并同時完成碳管氧化切割的方法，獲得了具有良好分散性的O-LID-MWCNT，其末端開口及側壁孔洞將成為理想的藥物進出碳管的通道；而通道周圍的含氧基團則為LID-MWCNT的功能化修飾奠定了基礎。

本研究中，通過濾膜篩選長度為100～200 nm的純化LID-MWCNT作為CDDP載體，其原因在于這一長度范圍的LID-MWCNT既具有較好的分散性，又能夠保證較高的管內藥物負載量，同時由于其長度小于常規(guī)無菌膜孔徑尺寸，利于后續(xù)進行除菌操作。

為避免CDDP突釋可能造成的中性粒細胞減少、腎小管損傷、神經毒性等不良反應［7］，在將CDDP載入管腔內后需要對藥物通道進行有效封堵，進而實現(xiàn)藥物緩釋。由于LID-MWCNT末端開口及側壁孔洞的直徑較大，常規(guī)的CNT封堵物如液相C60［8］、聚吡咯膜和烷硫醇功能化納米金顆粒［9-10］等均因尺寸太小而無法完成封堵。本實驗中發(fā)現(xiàn)，在O-LIDMWCNT中，長度小于100 nm的UST呈球狀結構，其直徑接近O-LID-MWCNT的末端開口及側壁孔洞的尺寸，同時其與載體碳管為同源產物，生物相容性可靠，可以作為封堵物應用。UST可有效封堵藥物通道。封堵后CDDP釋放呈緩釋模式，釋放時間約為封堵前的6倍。載藥系統(tǒng)在不同pH環(huán)境下表現(xiàn)出相似的釋放曲線，表明UST與載體碳管間的吸附作用無pH敏感性，可能源于范德華力作用。

本實驗所得CDDP@FA-LID-MWCNT及CDDP@UST-FA-LID-MWCNT的載藥率顯著高于以往報道的CNT基載藥系統(tǒng)［11-12］，表明其能夠以較低載體濃度來獲得CDDP的有效臨床劑量，有利于最大程度降低不良反應及納米顆粒累積的風險。由于封堵后需要進行洗滌處理以去除未反應的UST，管內一部分CDDP在此過程中釋放，因此封堵后載藥系統(tǒng)的載藥率略低于封堵前。

性能優(yōu)異的抗腫瘤載藥系統(tǒng)除須具有較高的載藥率及合理的藥物釋放模式外，還應具有腫瘤細胞靶向性。本研究通過PEG的氨基與FA的羧基發(fā)生酰胺反應，在碳管表面接枝FA，即旨在利用其受體在腫瘤細胞表面高表達的特點［13］，使載體系統(tǒng)具有一定的腫瘤靶向性。從熒光顯微鏡觀察結果可以看出，相同作用時間內，CDDP@UST-FA-LID-MWCNT處理組腫瘤細胞內部熒光顯著強于CDDP@USTLID-MWCNT處理組，雖然單純應用LID-MWCNT載體也可以將CDDP轉運至腫瘤細胞內，但接枝靶向分子FA后的載藥系統(tǒng)通過受體介導的內吞效應能夠獲得更高的轉運效率［14］，且該效應具有腫瘤細胞特異性，因此可以提高藥物的利用率并減少對正常細胞的損傷。

體外細胞毒性實驗表明，LID-MWCNT基載體具有良好的生物相容性，而各載藥實驗組對于鱗癌細胞CAL-27及腺癌細胞MCF-7均有抑制作用，且在相同CDDP濃度下CDDP@UST-FA-LID-MW?CNT較CDDP以及未封堵載藥體系具有更強的抑制作用。

（圖1、3、5見插頁）

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（2014-10-15收稿2015-03-01修回）

（本文編輯魏杰）

Preparation and performance of LID-MWCNT based sustained release targeted drug delivery system

MENG Ai1，YANG Tao1，WANG Pingting1，WANG Jian2，SUI Lei1△
1 Department of Prosthodontics，Hospital of Stomatology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Prosthodontics，West China Hospital of Stomatology，Sichuan University△

ObjectiveTo prepare a targeted antitumor drug delivery system using large-inner-diameter multi-walled carbon nanotubes（LID-MWCNTs）for sustained release and to study its performance.MethodsLID-MWCNTs were puri?fied and oxidized，then use nanocarriers and USTs as homologous blockers.Folic acid and fluorescent labels were conjugat?ed onto the external surfaces of nanocarriers.CDDP（cisplatin）was encapsulated and ultrashort tubes（USTs）were employed to block the drug entry/exit paths.The microstructure of resulted drug delivery system（DDS）was observed，while drug load?ing efficiency and drug release profile in vitro were determined.The tumor-targeting property and cytotoxicity of DDS were also assessed.ResultsLID-MWCNT based sustained release targeted drug delivery system was established.Drug loading efficiency of CDDP@UST-FA-LID-MWCNTs was as high as 70.97%.A typical biphasic sustained release pattern was dem?onstrated，and the accumulating release time was 18 h.DDS exhibited a certain kind of tumor-targeting property，and inhibit?ed proliferation of tumor cells in a dose-dependent manner.ConclusionCDDP@UST-FA-LID-MWCNT drug delivery system exhibited an improved drug loading efficiency and a sustained drug release profile.It could specifically target the tu?mor cells and had a significant antitumor effect.

nanotubes，carbon；cisplatin；antineoplastic agents；drug carriers；delayed-action preparations；multiwalled carbon nanotubes；targeting property；release profile

R318.08

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.006

天津市應用基礎及前沿技術研究計劃項目（11JCYBJC10100）；四川省科技支撐計劃項目（2014SZ0201）；教育部留學回國科研啟動基金（2013-693-11-8）

1天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院（郵編300070）；2四川大學華西口腔醫(yī)院

孟艾（1989），女，碩士，主要從事材料方面研究

△通訊作者E-mail：suilei@tmu.edu.cn