陸潞，謝克恭，韋貴將，王俊利，陸敏安，喬寧寧，盧賢哲，唐毓金

細(xì)胞與分子生物學(xué)

廣西壯族人群IL-12基因的單核苷酸多態(tài)性研究

陸潞，謝克恭，韋貴將，王俊利，陸敏安，喬寧寧，盧賢哲，唐毓金△

目的分析白細(xì)胞介素（IL）-12A基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)rs568408和IL-12B基因SNP位點(diǎn)rs3212227的各基因型和等位基因在廣西壯族人群中的分布頻率，及不同地區(qū)的分布差異。方法采用單堿基延伸的PCR技術(shù)對(duì)165例廣西壯族人群IL-12A rs568408和IL-12B rs3212227進(jìn)行多態(tài)性檢測，對(duì)比國際人類基因組計(jì)劃（HapMap）公布的中國北京、日本、非洲和意大利人群的SNP分型數(shù)據(jù)，分析5個(gè)人群rs568408、rs3212227位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率差異。結(jié)果在廣西壯族人群中存在rs568408和rs3212227多態(tài)性，2位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在男女性別間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），IL-12A rs568408與北京、日本和意大利人群差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但與非洲人群存在差異（P＜0.01）；IL-12B rs3212227與北京和日本人群差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與非洲和意大利人群存在差異（P＜0.01）。結(jié)論IL-12A rs568408和IL-12B rs3212227存在多態(tài)性，2位點(diǎn)基因型和等位基因在廣西壯族人群中的分布頻率與其他種族和地區(qū)人群相比存在差異，這種差異可能是導(dǎo)致某些疾病在不同人群發(fā)病率和臨床表現(xiàn)存在差異的原因之一。

白細(xì)胞介素12；多態(tài)性，單核苷酸；廣西［壯族自治區(qū)］；人種群

白細(xì)胞介素12（interleukin12，IL-12）是一種具有多種生物活性的異戊二聚體細(xì)胞因子，由p35和p40 2個(gè)亞基經(jīng)二硫鍵連接形成，亞基分別由位于染色體3p12～q13.2的IL-12A基因和位于染色體5q31～33的IL-12B基因編碼［1］。研究發(fā)現(xiàn)，IL-12A基因與IL-12B基因存在多個(gè)功能性多態(tài)性位點(diǎn)，且這些多態(tài)性位點(diǎn)可能影響惡性腫瘤［2］、自身免疫性疾?。?］、結(jié)核?。?-5］等疾病的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程。因此，準(zhǔn)確分析IL-12基因多態(tài)性在不同地區(qū)和不同人群中的分布，可以為基因多態(tài)性與某些疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供更多有力的研究依據(jù)。本文采用SNaP?shot SNP分型技術(shù)檢測165例廣西壯族人群IL-12A基因rs568408位點(diǎn)和IL-12B基因rs3212227位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性，為與IL-12相關(guān)的遺傳和疾病等方面的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2012年10月—2013年10月到廣西右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的165例體檢健康者作為考察對(duì)象。籍貫均為廣西，無可查親緣關(guān)系，向上追溯3代均為壯族人群，且長期在廣西居住。其中，男97例，女68例，年齡18～71歲，平均（39.53±14.39）歲；各項(xiàng)臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)均正常。

1.2 基因組DNA的提取清晨抽取健康體檢者肘正中靜脈血2 mL，用EDTA-K2抗凝；采用已建立的改良碘化鈉法提取白細(xì)胞基因組DNA，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）根據(jù)NCBI上查找的IL-12A、IL-12B基因DNA序列，選擇包含rs568408位點(diǎn)和rs3212227位點(diǎn)的序列并輸入引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5，得到用于特異性擴(kuò)增包含rs568408位點(diǎn)IL-12A基因和rs3212227位點(diǎn)IL-12B基因的PCR上、下游引物和延伸引物。其中，rs568408位點(diǎn)的上游引物序列為5′-GAGGTCCCTCCAAA CCGTTGTC-3′，下游5′-CAGGATGGATATTTTCCCTTCT?TAGCA-3′，延伸引物序列為5′-ATGTCAAAAATACTTGAT?CAGAGGTAT-3′。rs3212227位點(diǎn)的上游引物序列為5′-GGCAACTTGAGAGCTGGAAAATCT-3′，下游：5′-TCCAG?GATGAAAATTTGGAGGAAAA-3′，延伸引物序列為5′-TTT TTTTTTGATATCTTTGCTGTATTTGTATAGTT-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系共20μL，其中包括：10×PCR反應(yīng)緩沖液2.0μL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0μL，上、下游引物各1.0μL，基因組DNA 1.0μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，不足體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20μL。PCR反應(yīng)條件：94℃，15 min；94℃×30 s，60℃× 30 s，72℃×20 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃×10 min。PCR產(chǎn)物使用Qiagen公司的HotStarTaq進(jìn)行多重PCR獲得，4℃保存。

1.4 SNaPshot SNP分型技術(shù)PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿酶和外切酶Ⅰ純化后，用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸產(chǎn)物用蝦堿酶純化后在ABI3130XL上樣。SNP分型用Gene Mapper 4.0（Applied biosystems）分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)測序結(jié)果直接計(jì)算廣西壯族人群2個(gè)位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率，Hardy-Weinberg遺傳平衡采用χ2檢驗(yàn)。登錄NCBI查找HapMap公布的4個(gè)人群（北京人群、日本人群、非洲人群和意大利人群）2位點(diǎn)的分型結(jié)果，該人群與廣西壯族人群的基因型和等位基因頻率差異比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-12A rs568408和IL-12B rs3212227的檢測結(jié)果包含IL-12A rs568408位點(diǎn)和IL-12B rs3212227位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段分別為210 bp和217 bp。ABI 3130XL的SNP分型結(jié)果顯示，rs568408位點(diǎn)的基因型有3種，分別為AA、AG和GG，基因分型結(jié)果見圖1。rs3212227位點(diǎn)的基因型有3種，分別為TT、TG和GG，因其為反向測序，反轉(zhuǎn)后分別對(duì)應(yīng)的基因型為AA、AC、CC，基因分型結(jié)果見圖2。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測結(jié)果顯示所選人群群體代表性好（均P＞0.05），可以反映廣西地區(qū)壯族人群的總體情況，見表1。

Fig.1IL-12A gene rs568408 genotyping圖1 IL-12A基因rs568408位點(diǎn)SNP分型結(jié)果

Fig.2IL-12B gene rs3212227 genotyping圖2 IL-12B基因rs3212227位點(diǎn)SNP分型結(jié)果

2.2 IL-12基因多態(tài)性在廣西壯族人群中的分布廣西壯族人群中，rs568408位點(diǎn)的GG基因型最常見，為77.0%；G等位基因型的頻率最高，為87.6%。rs3212227位點(diǎn)的AC基因型最常見，為43.6%；A等位基因型的頻率最高，為50.3%。兩位點(diǎn)基因型及等位基因頻率男女組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2、3。

Tab.1Hardy-Weinberg equilibrium test results of the IL-12A gene rs568408A/G genotype and the IL-12B gene rs3212227 genotype in Zhuang populations in Guangxi表1 廣西壯族人群IL-12A rs568408A/G基因型和IL-12B rs3212227A/C基因型Hardy-Weinberg平衡檢測結(jié)果

Tab.2Genotype distribution and allele frequency of IL-12A gene rs568408 in Zhuang populations in Guangxi表2 IL-12A基因rs568408位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在廣西壯族人群的分布例（%）

2.3 IL-12基因多態(tài)性與其他人群的比較廣西壯族人群IL-12A rs568408基因型和等位基因頻率與北京、日本和意大利人群比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但與非洲人群存在差異（P＜0.01），見表4。IL-12B rs3212227基因型和等位基因頻率與北京和日本人群比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但與意大利和非洲人群存在差異（P＜0.01），見表5。

Tab.3Genotype distribution and allele frequency of IL-12B gene rs3212227 in Zhuang populations in Guangxi表3 IL-12B基因rs3212227位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在廣西壯族人群的分布例（%）

Tab.4Genotype and allele distribution of IL-12A gene rs568408 among different regional groups表4 不同地區(qū)人群IL-12A基因rs568408位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率的比較例（%）

Tab.5Genotype and allele distribution of IL-12B gene rs3212227 among different regional groups表5 不同地區(qū)人群IL-12B基因rs3212227位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率的比較例（%）

3 討論

3.1 IL-12基因的免疫調(diào)節(jié)功能IL-12基因是由一種具有多種生物學(xué)活性的炎性細(xì)胞因子，主要由抗原激活的樹突細(xì)胞（DC）、單核/巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞（APC）產(chǎn)生［6］。IL-12在抗腫瘤及抗結(jié)核的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。IL-12能誘導(dǎo)T細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞釋放干擾素γ（IFN-γ）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）破壞腫瘤內(nèi)血管的生成，并激活P35途徑促使腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的進(jìn)展［7］。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抗原的致敏和基因修飾可促使小鼠DC分泌的IL-12和IFN-γ呈高表達(dá)［8］。在抗結(jié)核免疫中，能通過誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ以及增加CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性等方式參與機(jī)體對(duì)結(jié)核病的免疫應(yīng)答［9］。

3.2 IL-12基因多態(tài)性與疾病在探討IL-12與疾病相關(guān)性的過程中，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，IL-12A、IL-12B基因存在多種功能性多態(tài)性位點(diǎn)，基因的多態(tài)性影響體內(nèi)IL-12的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，可能對(duì)疾病的發(fā)生和進(jìn)展產(chǎn)生影響。Wang等［2］通過對(duì)106例骨肉瘤患者和210例健康人的IL-12A、IL-12B基因多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)，病例組rs568408位點(diǎn)GA、GA/AA基因型和rs3212227位點(diǎn)CC、AC/CC基因型顯著高于對(duì)照組，且IL-12B rs3212227位點(diǎn)的基因多態(tài)性下調(diào)體內(nèi)IL-12p40水平，IL-12基因多態(tài)性與骨肉瘤的易感性相關(guān)。Wong等［3］研究發(fā)現(xiàn)IL-12B rs3212227位點(diǎn)的基因多態(tài)性與強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性，該研究中，攜帶CC和AC基因型的人患強(qiáng)直性脊柱炎的風(fēng)險(xiǎn)分別是攜帶AA基因型的人的1.93倍和1.73倍，同時(shí)，IL-12B基因與IL-23R基因的交互作用影響著強(qiáng)直性脊柱炎的進(jìn)展和嚴(yán)重程度。Peresi等［4］在巴西的研究發(fā)現(xiàn)來自IL-12B基因rs3212227 G/T位點(diǎn)的SNP能影響IL-12p40的表達(dá)水平，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌易感。Wang等［5］研究發(fā)現(xiàn)IL-12A基因的多態(tài)性可能與中國人肺結(jié)核的易感性有關(guān)，IL-12基因和IFNG基因的多態(tài)性可能單獨(dú)或者協(xié)同影響肺結(jié)核遺傳易感性及其預(yù)后。因此，準(zhǔn)確分析IL-12A、IL-12B基因多態(tài)性在不同人群中的分布，可以為不同IL-12相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展提供更多有力的證據(jù)。

3.3 廣西壯族人群2位點(diǎn)基因多態(tài)性分布與其他人群的差異本研究顯示，在廣西壯族人群中，rs568408和rs3212227 2個(gè)位點(diǎn)基因型和等位基因頻率男女性別間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明2位點(diǎn)基因型分布可能與性別無關(guān)，對(duì)比HapMap上4個(gè)人群的SNP分型數(shù)據(jù)，2位點(diǎn)廣西壯族人群的基因型和等位基因頻率與親緣關(guān)系相對(duì)較近同為黃種人的北京和日本人群比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是與親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)的非洲黑種人相比存在差異。表明此2位點(diǎn)基因型分布可能與種族有密切關(guān)系，符合“親緣關(guān)系越近，其基因型分布越相似，反之，則差異顯著”的遺傳學(xué)規(guī)律。在rs568408位點(diǎn)，廣西壯族人群的基因型及等位基因頻率與意大利人比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在rs3212227位點(diǎn)存在差異，則說明了在種族進(jìn)化中的明顯異質(zhì)性，而這種遺傳異質(zhì)性以及基因多態(tài)性的差異，很可能是導(dǎo)致某些疾病在不同地區(qū)不同人群中發(fā)病率和臨床表現(xiàn)存在差異的原因之一。

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（2014-10-21收稿2015-01-13修回）

（本文編輯李鵬）

Single nucleotide polymorphisms of IL-12 gene in Zhuang populations in Guangxi

LU Lu，XIE Kegong，WEI Guijiang，WANG Junli，LU Min'an，QIAO Ningning，LU Xianzhe，TANG Yujin△
Department of Spinal Orthopedic Surgery，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise Guangxi 533000，China△

ObjectiveTo investigate the frequencies of genotype and allele distribution of IL-12A gene single nucleo?tide polymorphisms（SNP）rs568408 and IL-12B gene SNP rs3212227 in Zhuang populations in Guangxi，and to compare the distribution of IL-12A and IL-12B polymorphisms among different races.MethodsThe IL-12A SNP rs568408 and IL-12B SNP rs3212227 were detected by SNaPshot SNP genotyping technique in 165 Zhuang people in Guangxi，frequen?cies of genotype and allele of IL-12A gene rs568408 and IL-12B rs3212227 polymorphisms were analyzed in Zhuang popu?lations compared with the other four populations（HapMap-HCB，HapMap-JPT，HapMap-YRI，HapMap-TSI）from Hap?Map database.ResultsThere were polimorphisms of IL-12A and IL-12B gene in Zhuang populations in Guangxi.The fre?quencies of allele and genotype distribution of IL-12A gene rs568408 polymorphisms were not significantly differenct com?pared with HapMap-HCB，HapMap-JPT and HapMap-TSI（P＞0.05），but were significantly different compared with Hap?Map-YRI（P＜0.01）；The frequencies of allele and genotype distribution of IL-12B rs3212227 polymorphisms were not sig?nificantly differenct compared with HapMap-HCB and HapMap-JPT（P＞0.05），but were significantly different compared with HapMap-YRI and HapMap-TSI（P＜0.01）.ConclusionThere are significant differences in the frequencies of allele and genotype distribution of IL-12A gene rs568408 and IL-12B gene rs3212227 between Zhuang populations and other eth?nic populations，and this variation might contribute to a variety of clinical manifestation and morbidity of some IL-12 related diseases.

interleukin-12；polymorphism，single nucleotide；Guangxi；ethnic group

R394.3

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.005

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81260315）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012GXNSFAA053169）；廣西衛(wèi)生廳醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題項(xiàng)目（重2010059）；廣西衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題項(xiàng)目（Z2012712）

廣西百色，右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱外科（郵編533000）

陸潞（1981），男，碩士在讀，主要從事脊柱與骨關(guān)節(jié)疾病研究

△通訊作者E-mail：tangyujin196709@163.com