孟凡兵　范東旭　劉麗　金松

[摘要]目的：探討Notch信號通路對體外培養(yǎng)糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞的mRNA水平的影響。方法：本課題從不同梯度濃度v-分泌酶抑制劑（DAPT）干預(yù)Notch信號通路后對DM大鼠VSMCs基因影響進(jìn)行論述。結(jié)果：通過實時定量PCR方法分析得出，加γ-分泌酶抑制劑（DAPT）的培養(yǎng)基的DM大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）溶解溫度峰值Tm進(jìn)行檢測得出：溶解曲線呈單峰，溶解溫度在86.0℃-84.0℃之間，溶解溫度變化小，表明為特異性擴增。結(jié)論：實驗結(jié)果顯示DAPT干預(yù)Notch信號通路后，對體外培養(yǎng)的DM大鼠VSMCs的mRNA有抑制趨勢，復(fù)制率下降，使其溶解溫度峰值前移，溶解曲線呈單峰，將會導(dǎo)致進(jìn)一步細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]PCR；糖尿病大鼠；DAPT；血管平滑肌細(xì)胞；mRNA

1材料與方法

本課題前期的糖尿病大鼠模型建立、糖尿病大鼠主動脈血管病變檢測、糖尿病大鼠VSMCs體外培養(yǎng)及鑒定以及不同梯度濃度γ-分泌酶抑制劑（DhPT）干預(yù)Notch信號通路后對DM大鼠VSMCs活性及毒性、凋亡、細(xì)胞周期的影響均已完成，且DM大鼠VSMCs已完成凍存。僅從不同梯度濃度γ-分泌酶抑制劑（DAPT）干預(yù)Notch信號通路后對DM大鼠VSMCs基因影響進(jìn)行論述。

1.1實驗對象

取已完成的糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇與傳代。

1.1.1VSMCsmRNA的抽提

取凍存已裂解的細(xì)胞，在常溫下放置到完全溶解。溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃，作為實時定量PCR擴增實的模版。

1.1.2 RNA質(zhì)量檢測，紫外吸收法測定

取少量RNA溶液用TE稀釋（1：100）后，讀取260nm和280nm兩處的吸收值，測定RNA溶液的濃度和純度。進(jìn)行濃度測定，在進(jìn)行純度檢測，mRNA純度為mRNA溶液的A260/A280的比值，比值范圍1.9到2.1.

2反應(yīng)條件

如表1。

3引物設(shè)計軟件

Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補。

根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計出相應(yīng)的引物。

目標(biāo)基因：

上游引物為5'：TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGCTAT 3'

下游引物為5'：GAC GAC CCCGAACCG CGACCG TAACAG 3'

擴增條目的條帶大小為155bp。

對照基因：

上游引物5'：TTATTA GAG GGTGGGGTGGATTGTTAT3'

下游引物5'：CAAGAC CCC GAACCG CGACCGATACCA3'

擴增條目的條帶大小為156bp。

4結(jié)果

通過實時定量PCR方法分析得出，加γ-分泌酶抑制劑（DAPT）的培養(yǎng)基的DM大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）溶解溫度峰值Tm進(jìn)行檢測看見：溶解溫度在86.0℃——84.0℃之間，溶解溫度單一，溶解曲線呈單峰，標(biāo)明為特異性擴增。而對照組（正常培養(yǎng)基）未見特異性峰值。從PCR溶解曲線我們看見DAPT干預(yù)Notch信號通路后對體外培養(yǎng)的DM大鼠VSMCs的mRNA有抑制趨勢，使其溶解溫度峰值前移，溶解曲線呈單峰，復(fù)制率下降，將會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

5結(jié)論

本課題通過實時定量PCR技術(shù)分析探討Notch信號通路在糖尿病大鼠血管再生及成熟中的作用機制，分析探討Notch信號通路對體外培養(yǎng)糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞的mRNA水平有何影響，為進(jìn)一步研究糖尿病患者血管再生提供依據(jù)，有可能成為獲得更多有功能的血管以促進(jìn)血管新生，為臨床治療糖尿病足潰瘍、缺血性疾病、改善預(yù)后提供新思路和新途徑，并為以后系統(tǒng)科學(xué)地研究血管再生提供方向，為缺血性疾病的治療提供靶向藥物，希望在不久之后會應(yīng)用到臨床治療中，造福廣大糖尿病足潰瘍、缺血性疾病患者，實現(xiàn)從實驗室到臨床的完整對接，進(jìn)一步提升糖尿病足潰瘍、缺血性疾病治療的基礎(chǔ)研究水平。

（通訊作者：金松）