袁文靜+鐘+彤+閆晶+薛中原+齊偉+王樺

摘 要 硼酸受體識(shí)別體系近年來被廣泛用于糖的分子識(shí)別研究，硼酸在一定酸度條件下，可特異性結(jié)合含順式鄰位多羥基的物質(zhì)（如二醇、糖等）。本實(shí)驗(yàn)利用EDC/NHS化學(xué)交聯(lián)，3-氨基苯硼酸 （APBA） 與聚丙烯酸 （PAA） 反應(yīng)，制得苯硼酸接枝的聚合物PAA-PBA，進(jìn)而將此聚合物進(jìn)行層層組裝，獲得苯硼酸功能化薄膜。利用石英晶體微天平（QCM）和原子力顯微鏡（AFM）分別從宏觀和微觀的角度監(jiān)測(cè)分析了此薄膜表面對(duì)糖類化合物的識(shí)別性質(zhì)。結(jié)果表明此類薄膜對(duì)一定濃度（>50 μg/mL）的糖類化合物均能表現(xiàn)出明顯識(shí)別，其中，對(duì)果糖識(shí)別最為明顯。此體系抗干擾性好，可重復(fù)使用，長(zhǎng)期保存后仍能較好保持性能。微觀表面形貌觀察發(fā)現(xiàn)糖類化合物在薄膜表面識(shí)別均勻，識(shí)別后薄膜表面粗糙度發(fā)生明顯變化。本研究成果可望用于開發(fā)高選擇性、高靈敏度的糖識(shí)別體系。

關(guān)鍵詞 苯硼酸； 層層組裝技術(shù)； 糖識(shí)別； 石英晶體微天平； 原子力顯微鏡

1 引 言

糖作為生物體能源物質(zhì)，在生命活動(dòng)中起著不可替代的作用。識(shí)別生物體中各種糖已成為生命科學(xué)各領(lǐng)域的主要研究?jī)?nèi)容，建立高靈敏和高選擇性的糖分子識(shí)別方法在生命科學(xué)領(lǐng)域中有著重要意義。近年來，硼酸受體識(shí)別體系被廣泛用于糖的分子識(shí)別研究，硼酸在一定酸度條件下，可特異性結(jié)合含順式鄰位多羥基的物質(zhì)（如二醇、糖等）。與酶法相比，硼酸受體識(shí)別體系無需酶介體且識(shí)別作用是可逆的，但多數(shù)在溶液中進(jìn)行，其用作功能膜識(shí)別糖的研究尚較少開展[1～3]。

近年來，層層組裝多層膜在生物傳感器、藥物傳輸載體、光學(xué)器件、電催化等方面開展了許多工作，并引起廣泛關(guān)注。層層組裝技術(shù)是由帶相反電荷的聚電解質(zhì)通過靜電作用層層組裝形成多層膜的技術(shù)[4～7]。由于具有組裝過程操作簡(jiǎn)便，適用范圍廣泛，薄膜厚度易于控制，成分易于調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)，而引起了人們極大的興趣。

石英晶體微天平（QCM）具有高度的靈敏性，可監(jiān)測(cè)到納米范圍內(nèi)薄膜的厚度變化和納克范圍內(nèi)痕量物質(zhì)質(zhì)量的變化，特別適合薄膜的質(zhì)量、厚度的測(cè)量，生物/化學(xué)傳感器及痕量物質(zhì)在表面的吸附過程研究，在分析科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，特別在聚合物多層薄膜的結(jié)構(gòu)與性能研究中的應(yīng)用備受關(guān)注[8，9]。原子力顯微鏡（AFM）是重要的表面分析工具，適用于各種體系的表面分析及各環(huán)境的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定，其分辨率可達(dá)原子級(jí)水平[8，10]。QCM獲得的宏觀動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)和AFM獲得的微觀靜態(tài)信息相結(jié)合，有利于在分子水平上理解硼酸受體與糖分子間的識(shí)別作用及機(jī)理。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜（美國(guó)尼高力公司）；UV-3600紫外光譜（日本島津公司）；ESCALab 250XiX光電子能譜（XPS，美國(guó)賽默飛公司）測(cè)試；Q-Sense E4 QCM（瑞典）；Nanoscope IIIa掃描探針顯微鏡（美國(guó)Digital Instruments公司）。

聚丙烯酸（PAA，Mn 130000）、3-氨基苯硼酸半硫酸鹽（APBA）、N-羥基琥珀酰亞胺丙烯酸酯（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、50% （w/V）聚乙烯亞胺（PEI）、Tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate （TRITC）、4-（2-羥乙基）哌嗪-1-乙磺酸 N-（2-羥乙基）哌嗪-N′-（2-乙磺酸）（HEPES）、抗壞血酸（AA）、尿素（UA）和多巴胺（DA）均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、葡萄糖等購(gòu)自天津市廣成化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用緩沖溶液為50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液和50 mmol/L HEPES緩沖溶液，所有實(shí)驗(yàn)用水均為Millipore超純水。

2.2 苯硼酸接枝聚合物PAA-PBA的合成

PAA-PBA利用EDC/NHS交聯(lián)法使PAA的羧基與APBA的氨基反應(yīng)，形成酰胺鍵[11，12]：3 mmol PAA溶于HEPES緩沖溶液中，調(diào)節(jié)至pH 8.5，加入25 mL 0.06 mol/L APBA溶液， 4 mL 0.03 mol/L NHS和等量EDC，攪拌12 h。用清水透析1周后，凍干，即得PAA-PBA。

2.3 PEI/PAA-PBA多層膜的組裝

在石英晶體電極（13.7 mm石英晶體和5.1 mm金電極）表面組裝時(shí)，先將金電極表面徹底清潔。首先，加入500 μL 10% SDS溶液，用棉棒擦拭，用超純水洗去剩余溶液，并用氮?dú)獯蹈杀砻?。然后? μL Piranha溶液（濃H2SO4-30% H₂O₂，7∶3，V/V）覆蓋整個(gè)金電極表面，10 min后，用超純水清洗。在清潔的金表面開始組裝第一層，取500 μL PEI溶液（含0.2 mol/L NaCl）加入檢測(cè)池，直到儀器信號(hào)穩(wěn)定，20 min后，用超純水清洗3次，加入第二層組裝，500 μL PAA-PBA溶液（含0.2 mol/L NaCl）加入檢測(cè)池，直到信號(hào)穩(wěn)定，依此循環(huán)，直到所需層數(shù)。QCM實(shí)時(shí)記錄組裝過程頻率變化。

在石英片、硅片表面組裝PEI/PAA-PBA多層膜進(jìn)行同樣的操作，分別用紫外可見光譜和原子力顯微鏡表征。

3 結(jié)果與討論

3.1 苯硼酸接枝聚丙烯酸PAA-PBA的合成與表征

苯硼酸接枝的聚丙烯酸是借助EDC和NHS的化學(xué)交聯(lián)合成獲得的，合成原理如圖1所示。首先，產(chǎn)物PAA-PBA利用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行了光譜測(cè)試，紅外譜圖（圖2）中2950 cm

對(duì)應(yīng)PAA中亞甲基的伸縮振動(dòng)，1565和1678 cm1為酰胺鍵的伸縮振動(dòng)峰，由于苯環(huán)的特征峰也在附近，因而交聯(lián)體的峰更強(qiáng)一些，這在PAA-PBA中均檢測(cè)到。1361 cmendprint

為硼酸基團(tuán)中BO鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰；1438 cm為苯環(huán)變形振動(dòng)特征位置，這表明PAA和APBA已發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)，形成了PAA-PBA。

另外，通過XPS測(cè)試獲得產(chǎn)物PAA-PBA的元素分析結(jié)果（圖3）表明，產(chǎn)物中存在B，N等元素，含量較低，信號(hào)較弱，但仍可計(jì)算出，APBA在PAA上的接枝率約為38%。因此，PAA-PBA中仍然有大量的自由羧基存在，這為后期的靜電組裝提供了便利。

圖1 3-氨基苯硼酸接枝聚丙烯酸反應(yīng)示意圖

Fig.1 Synthetic scheme of poly（acrylic acid）-phenylboronic acid （PAA-PBA）

3.2 PEI/PAA-PBA多層薄膜的表征

帶正電的聚乙烯亞胺作為第一層組裝在處理過的石英晶體電極上，含較多羧基的PAA-PBA在

圖2 3-氨基苯硼酸和接枝產(chǎn)物PAA-PBA的紅外光譜圖

Fig.2 FTIR spectra of 3-aminophenylboronic acid hemisulfate （APBA） and PAA-PBA

pH 9.0時(shí)帶明顯負(fù)電荷，作為第二層進(jìn)行組裝，依此循環(huán)，直至所需層數(shù)。組裝的多層膜分別用紫外-可見光譜、QCM和AFM進(jìn)行了觀測(cè)。

圖3 接枝產(chǎn)物PAA-PBA的XPS圖

Fig.3 XPS spectra of PAA-PBA

為了更清楚監(jiān)測(cè)其組裝過程，用TRITC對(duì)PEI進(jìn)行了熒光標(biāo)記，由圖4可見，550 nm峰強(qiáng)隨著組裝層數(shù)的增加而明顯增強(qiáng)，表明組裝的成功進(jìn)行。QCM也可監(jiān)測(cè)到層層組裝的發(fā)生，由共振頻率的減少反映出電極表面質(zhì)量的增加，隨著組裝層數(shù)增加，共振頻率降低越來越顯著，證明了薄膜的成功組裝（圖5）。AFM也可以觀察到組裝不同層數(shù)的表面形貌變化，如圖6所示，分別表示組裝2個(gè)雙層、4個(gè)雙層、6個(gè)雙層的PEI/PAA-PBA薄膜。原子力顯微鏡下呈現(xiàn)典型的層層組裝多層膜的表面形貌，表面由連續(xù)的結(jié)節(jié)組成，隨著組裝層數(shù)增加，結(jié)節(jié)逐漸變大。

圖4 （PEI/PAA-PBA）n 多層膜組裝紫外光譜圖（A）及其石英晶體微天平監(jiān)測(cè)共振頻率變化圖（B）

Fig.4 UV-vis spectra （A） and frequency shift （B） observed during assembly of （PEI/PAA-PBA）n multilayer

PEI： Poly（ethyleneimine）.

圖5 原子力顯微鏡觀測(cè)不同層數(shù)（PEI/PAA-PBA）n 多層膜的表面形貌圖（5 μm×5 μm）： （A） （PEI/PAA-PBA）2； （B） （PEI/PAA-PBA）4； （C） （PEI/PAA-PBA）6

Fig.5 AFM height images of （A） （PEI/PAA-PBA）2 multilayer， （B） （PEI/PAA-PBA）4 multilayer and （C） （PEI/PAA-PBA）6 multilayer

3.3 PEI/PAA-PBA多層薄膜對(duì)葡萄糖的識(shí)別

薄膜對(duì)葡萄糖的識(shí)別通過QCM技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，記錄不同層數(shù)的薄膜對(duì)相同濃度的葡萄糖溶液（100 μg/mL）的識(shí)別時(shí)間曲線（圖6）。圖7顯示了典型的共振頻率變化，在空白電極表面，在監(jiān)測(cè)時(shí)間范圍內(nèi)沒有看到頻率變化。在1個(gè)雙層薄膜表面，觀察到頻率的變化，但是頻率減少較弱，說明識(shí)別在薄膜上的糖分子少，表明兩者間的識(shí)別作用弱。隨著組裝層數(shù)增加，薄膜表面PBA基團(tuán)越來越多，對(duì)糖的識(shí)別作用逐漸增強(qiáng)，頻率減少程度增大，直到達(dá)到5個(gè)雙層后，識(shí)別不再有明顯增加，說明在薄膜表面的識(shí)別已達(dá)到飽和。

為準(zhǔn)確探討薄膜與糖的識(shí)別作用，選4個(gè)雙層的薄膜為模型體系，監(jiān)測(cè)了不同濃度葡萄糖溶液在此膜表面的識(shí)別性質(zhì)。圖7表明，當(dāng)葡萄糖濃度較低時(shí)，如50 μg/mL，共振頻率變化很小，表明二者識(shí)別作用弱，而當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，共振頻率有了顯著的變化，這時(shí)識(shí)別作用增強(qiáng)，進(jìn)一步地增加葡萄糖濃度到300 μg/mL后，識(shí)別作用又有了明顯增強(qiáng)，但當(dāng)葡萄糖溶液濃度增加至500 μg/mL時(shí)，識(shí)別作用不再有明顯的增強(qiáng)，表明此時(shí)識(shí)別作用已達(dá)平衡。

圖6 不同層數(shù)PEI/PAA-PBA多層膜對(duì)100 μg/mL的葡萄糖溶液的QCM頻率變化曲線

Fig.6 Time courses of frequency shift observed during recognition of （PEI/PAA-PBA）n multilayer to glucose at concentration of 100 μg/mL

圖7 （PEI/PAA-PBA）4膜對(duì)不同濃度葡萄糖溶液的QCM頻率變化曲線

Fig.7 Time courses of frequency shift observed during recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer to glucose with different concentrations

圖8 （PEI/PAA-PBA）4膜對(duì)葡萄糖識(shí)別前后的原子力顯微鏡觀察圖（10 μm×10 μm）： （A）識(shí)別前形貌圖； （B）識(shí)別前相圖；（C）識(shí)別平衡后形貌圖； （D）識(shí)別平衡后相圖

Fig.8 （A） AFM height images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer before recognition to glucose， （B） AFM phase images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer before the recognition to glucose， （C） AFM height images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer in recognition equilibrium to glucose and （D） AFM phase images of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer in recognition equilibrium to glucoseendprint

利用AFM技術(shù)對(duì)葡萄糖在薄膜表面的被識(shí)別行為進(jìn)行了表面分析。圖8顯示了識(shí)別前和識(shí)別平衡后的薄膜表面，表面粗糙度Ra在2.494～3.502 nm之間明顯變化，同時(shí)，PEI/PAA-PBA膜表面識(shí)別結(jié)合葡萄糖比較均勻。

3.4 PEI/PAA-PBA多層薄膜對(duì)其他糖類化合物的識(shí)別

圖9顯示了此薄膜對(duì)其它糖類化合物的識(shí)別性質(zhì)，相比相同濃度的葡萄糖、甘露糖及半乳糖，薄膜對(duì)果糖識(shí)別更明顯，而對(duì)其它3種糖識(shí)別性能相似，這是因?yàn)楣鞘俏ㄒ缓?個(gè)順式二元醇的分子，會(huì)與硼酸基產(chǎn)生更強(qiáng)的識(shí)別作用[12]。

圖9 （PEI/PAA-PBA）4膜對(duì)相同濃度100 μg/mL的葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖的QCM頻率變化曲線

Fig.9 Time courses of frequency shift observed during recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer to glucose， fructose， mannose and galactose with same concentration of 100 μg/mL

3.5 PEI/PAA-PBA多層薄膜的干擾實(shí)驗(yàn)、重復(fù)利用和穩(wěn)定性

為了進(jìn)一步考察此類薄膜材料用于實(shí)際樣品檢測(cè)的可能性，分別考察了生命體內(nèi)常見干擾物質(zhì)AA、UA、DA等，研究其抗干擾能力。由圖10可見，加入干擾物質(zhì)未影響此薄膜對(duì)糖類化合物的識(shí)別，并且此薄膜對(duì)AA、UA、DA等干擾物質(zhì)都完全沒有識(shí)別作用。這表明此類薄膜的抗干擾性好，能用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

圖10 （PEI/PAA-PBA）4膜對(duì)300 μg/mL葡萄糖（A）在100 μg/mL AA和100 μg/mL UA的干擾下；（B）在100 μg/mL DA的干擾下的QCM頻率變化曲線

Fig.10 Time courses of frequency shift observed during the recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer to glucose concentration of 300 μg/mL （A） in the absence and the presence of ascorbic acid （AA）， uric acid （UA）； （B） in the absence and presence of dopamine （DA）

如前所述，硼酸基與順式二元醇的識(shí)別是可逆的，這種識(shí)別高度依賴體系酸度，圖11A表明，此薄膜在pH 8.0體系中，原已識(shí)別的葡萄糖會(huì)脫落，兩者不再存在相互作用；而在pH 10.0時(shí)，體系沒有明顯變化，說明此條件下識(shí)別作用能夠穩(wěn)定存在；pH≤8.0時(shí)，已經(jīng)識(shí)別的葡萄糖會(huì)從薄膜表面脫落，此薄膜可重復(fù)使用。將重復(fù)使用1次、2次的薄膜分別與新鮮制備的薄膜對(duì)比，發(fā)現(xiàn)三者對(duì)相同濃度葡萄糖的識(shí)別基本沒有差別，這些結(jié)果進(jìn)一步證明了PEI/PAA-PBA薄膜對(duì)糖的識(shí)別是可逆的，并可重復(fù)使用，這也正是此類薄膜擬作為傳感識(shí)別體系的優(yōu)勢(shì)所在。

圖11 （A）識(shí)別了葡萄糖的（PEI/PAA-PBA）4膜在pH 8.0和pH 10.0時(shí)的QCM頻率變化曲線 ；（B）重復(fù)利用的（PEI/PAA-PBA）4膜識(shí)別300 μg/mL葡萄糖的QCM頻率變化曲線

Fig.11 Time courses of frequency shift observed （A） （PEI/PAA-PBA）4 multilayer recognized with glucose at pH 8.0 and pH 10.0， respectively； （B） during the recognition of （PEI/PAA-PBA）4 multilayer newly fabricated， that recycled once and twice to glucose at the concentration of 300 μg/mL， respectively

考察了此薄膜的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，將薄膜修飾的晶體電極置于4℃條件下保存，每周測(cè)試其對(duì)相同濃度葡萄糖的識(shí)別響應(yīng)，在4周內(nèi)，QCM響應(yīng)曲線基本沒有發(fā)生變化，表明此薄膜長(zhǎng)期保存后仍能較好地保持對(duì)糖的識(shí)別性能。這是與酶法體系相比的另一優(yōu)勢(shì)，蛋白類氧化酶雖然催化活性高，但易受環(huán)境干擾而失活。

4 結(jié) 論

合成了苯硼酸接枝的高分子化合物PAA-PBA，通過靜電層層組裝獲得了PBA功能化表面，并分別用QCM和AFM技術(shù)表征了此表面對(duì)葡萄糖等糖類化合物的識(shí)別性能。結(jié)果表明，此類薄膜能夠明顯識(shí)別葡萄糖、果糖、甘露糖及半乳糖等糖類化合物，其中對(duì)果糖識(shí)別最為明顯，并且，此體系抗干擾性和穩(wěn)定性好，可重復(fù)使用，同時(shí)，此方法體系可擴(kuò)展至其他苯硼酸接枝聚合物，適用性廣，可望應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域傳感識(shí)別體系的開發(fā)。

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