張松柏+鄭麗英+胡霞+沈廣宇++劉學(xué)文+沈國勵(lì)+俞汝勤

摘 要 利用目標(biāo)蛋白、適體探針、掛鎖探針和與適體探針匹配的互補(bǔ)序列之間的競爭反應(yīng)，發(fā)展了一種基于滾環(huán)擴(kuò)增的高靈敏熒光適配體傳感器。在不含目標(biāo)蛋白時(shí)，互補(bǔ)序列由于與適體探針雜交形成雙鏈，因此不能與掛鎖探針雜交以觸發(fā)連接-滾環(huán)放大反應(yīng)。相反，有目標(biāo)蛋白存在時(shí)，由于目標(biāo)蛋白與適體探針結(jié)合，使得互補(bǔ)序列被置換下來，從而可以與掛鎖探針雜交。在DNA連接酶的作用下，掛鎖探針被進(jìn)一步環(huán)化并在Phi 29 DNA聚合酶的作用下發(fā)生滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物含有許多能與分子信標(biāo)檢測(cè)探針環(huán)狀部分雜交的重復(fù)序列，從而分子信標(biāo)被打開產(chǎn)生熒光信號(hào)。對(duì)互補(bǔ)序列的長度及掛鎖探針的濃度進(jìn)行了考察。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，本傳感系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)的凝血酶高靈敏檢測(cè)，線性范圍為0.067～32 nmol/L，檢出限為0.03 nmol/L（約90 amol目標(biāo)分子）。通過設(shè)計(jì)不同的適體探針和相關(guān)核酸序列，本傳感系統(tǒng)可以作為一種通用型方法用于其它目標(biāo)物的分析。

關(guān)鍵詞 核酸適配體； 滾環(huán)擴(kuò)增； 分子信標(biāo)； 熒光； 凝血酶

1 引 言

臨床上對(duì)惡性腫瘤進(jìn)行快速靈敏篩查常以腫瘤標(biāo)志物作為檢測(cè)的目標(biāo)分子。腫瘤標(biāo)志物是一類由腫瘤組織和細(xì)胞產(chǎn)生的與腫瘤形成、發(fā)生相關(guān)的物質(zhì)，主要是腫瘤抗原、激素、酶及其同工酶等。例如凝血酶是一種由凝血酶前體形成的絲氨酸蛋白質(zhì)水解酶，具有催化纖維蛋白元變成纖維蛋白，促進(jìn)血液凝固和調(diào)控凝血等作用，在解釋腫瘤的發(fā)生機(jī)制及作為早期診斷、療效及預(yù)后判斷等方面均具有重要意義[1，2]。發(fā)展可以高靈敏檢測(cè)這些腫瘤標(biāo)志物蛋白質(zhì)的生物傳感器是惡性腫瘤早期診斷的一個(gè)非常有效的方法。

近年來，核酸適配體技術(shù)的發(fā)展為腫瘤標(biāo)志物蛋白質(zhì)的檢測(cè)提供了新的契機(jī)。核酸適配體是通過配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)在體外篩選得到的單鏈DNA或RNA寡核苷酸片段[3，4]，可高特異性結(jié)合蛋白質(zhì)、小分子，甚至細(xì)胞。核酸適配體作為一種新型分子識(shí)別元件，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如適體合成簡單、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、容易標(biāo)記和修飾等， 被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析、藥物篩選、疾病診斷、生物傳感器和分子識(shí)別元件的設(shè)計(jì)等方面。已報(bào)道的利用核酸適配體檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)和方法包括比色法[5]、熒光法[6]、電化學(xué)法[7]等。相比于電化學(xué)方法需要多步的界面反應(yīng)及繁瑣的操作，熒光法具有操作方便、響應(yīng)快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，但其檢測(cè)靈敏度低于電化學(xué)方法。因此，熒光適配體傳感器中常需要進(jìn)行信號(hào)放大。

滾環(huán)擴(kuò)增作為一種恒溫下進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)，常用于蛋白質(zhì)分析的生物傳感方法[8]。本研究基于競爭觸發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，利用適體探針、目標(biāo)蛋白、互補(bǔ)序列和掛鎖探針之間的競爭反應(yīng)發(fā)展了一種高靈敏檢測(cè)凝血酶的熒光適配體傳感方法。當(dāng)樣品中含有待測(cè)目標(biāo)分子凝血酶時(shí)，凝血酶與其適配體序列特異性結(jié)合形成獨(dú)特的空間三維結(jié)構(gòu)，則互補(bǔ)序列只能與掛鎖探針雜交，并在E.coli DNA連接酶的作用下使掛鎖探針環(huán)化形成環(huán)狀DNA。進(jìn)而在phi 29 DNA聚合酶的作用下進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，得到大量與掛鎖探針模板互補(bǔ)的長鏈DNA產(chǎn)物。使用分子信標(biāo)作為信號(hào)探針與所得長鏈DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)，分子信標(biāo)熒光基團(tuán)的熒光恢復(fù)，熒光強(qiáng)度大小與目標(biāo)分子凝血酶的濃度相關(guān)，基于此建立了高靈敏檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物凝血酶的熒光適配體傳感器。此生物傳感系統(tǒng)的構(gòu)建策略具有普適性，通過改變適配體探針的序列，可用于其它目標(biāo)分子的檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Hitachi F-2500 熒光分光光度計(jì)（日本Hitachi公司），150 W氙燈光源，檢測(cè)器為R928F紅敏光電倍增管。激發(fā)光和發(fā)射光狹縫寬度均為5.0 nm。激發(fā)波長為495 nm，發(fā)射波長采集范圍為505～650 nm，其中520 nm處的熒光強(qiáng)度用于評(píng)價(jià)本檢測(cè)方法的分析性能。如無特殊說明，所有檢測(cè)均在室溫（20℃）下進(jìn)行

實(shí)驗(yàn)所用到的寡核苷酸序列均由生工生物（上海）有限公司合成，其序列如表1所示。核酸適配體探針的雙下劃線部分為凝血酶的核酸適配體，能與凝血酶特異性結(jié)合，也能與互補(bǔ)序列（CDNA）的一段序列（下劃線部分）互補(bǔ)。掛鎖探針的5′端進(jìn)行了磷酸化，5′端和3′端下劃線且斜體部分能與CDNA完全互補(bǔ)。作為檢測(cè)探針的分子信標(biāo)其5′端和3′端分別修飾了熒光基團(tuán)FAM和猝滅基團(tuán)DABCYL，斜體部分為莖干序列，黑體部分為與滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的序列。

凝血酶購自上海源葉生物科技有限公司。E. coli DNA連接酶試劑盒（包括E. coli DNA連接酶，10×E. coli DNA連接酶反應(yīng)緩沖液和10×BSA（0.5%））購自大連寶生物有限公司。Phi 29 DNA聚合酶購自Fermentas公司（包括10×Phi 29反應(yīng)緩沖液）。其它化學(xué)試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)中直接使用。實(shí)驗(yàn)所用水均為3次蒸餾水，阻抗≥18 MΩ·cm。

2.2 連接反應(yīng)

將凝血酶用儲(chǔ)存緩沖液稀釋，取不同濃度的凝血酶3 μL與等體積的適配體探針（60 nmol/L）混合，反應(yīng)30 min；加入相同體積的互補(bǔ)序列CDNA（60 nmol/L）再反應(yīng)30 min， 然后再加入90 nmol/L掛鎖探針3 μL與游離的CDNA進(jìn)行雜交反應(yīng)30 min。向所得反應(yīng)液中相繼加入10×E. coli DNA連接酶反應(yīng)緩沖液2 μL，10×BSA溶液2 μL 及1 U/μL E. coli DNA連接酶4 μL，37℃下溫育60 min進(jìn)行連接反應(yīng)，得到20 μL連接反應(yīng)液。

2.3 滾環(huán)擴(kuò)增及蛋白質(zhì)分析

向2.2節(jié)中所得到的20 μL連接反應(yīng)液中相繼加入10×Phi 29反應(yīng)緩沖液4 μL，dNTPs溶液（含A， T， G， C各10 mmol/L）4 μL，滅菌水10 μL，最后加入10 U/μL Phi29 DNA聚合酶2 μL，所得聚合反應(yīng)液總體積為40 μL，其中4種dNTPs濃度均為1 mmol/L，Phi29 DNA聚合酶濃度為0.5 U/μL。將所得溶液于37℃溫育30 min進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)完成后將溶液在65℃水浴中加熱10 min，使Phi29 DNA聚合酶失活，終止擴(kuò)增反應(yīng)，然后將溶液冷卻至室溫。最后加入分子信標(biāo)檢測(cè)探針溶液60 μL與滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)30 min后，測(cè)量所得溶液的熒光光譜。endprint

3 結(jié)果與討論

3.1 傳感器構(gòu)建原理

在典型的滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)中，當(dāng)有環(huán)狀DNA模板、引物和聚合酶時(shí)，通過DNA聚合酶的作用，以環(huán)形DNA為模板進(jìn)行復(fù)制，引物被延伸并最終形成一條與環(huán)狀DNA模板互補(bǔ)的具有成千上萬重復(fù)序列的線狀單鏈DNA，由此可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸的檢測(cè)信號(hào)的放大，該方法靈敏度高，理論上可以檢測(cè)到一個(gè)拷貝的核酸分子[9]。本實(shí)驗(yàn)利用滾環(huán)擴(kuò)增的原理，設(shè)計(jì)了一種利用核酸適配體競爭反應(yīng)觸發(fā)滾環(huán)放大檢測(cè)蛋白質(zhì)的新方法。本方法的關(guān)鍵在于競爭反應(yīng)相關(guān)核酸序列的設(shè)計(jì)。本研究通過專業(yè)的DNA分析軟件mfold設(shè)計(jì)各核酸的序列，使適體探針的3′端包含15個(gè)堿基的凝血酶的適配體序列?；パa(bǔ)DNA序列（CDNA）既能與適體探針的一段互補(bǔ)也能與掛鎖探針的5′和3′端互補(bǔ)。當(dāng)樣品中沒有目標(biāo)蛋白時(shí)，CDNA與適體探針互補(bǔ)雜交形成穩(wěn)定的雙鏈DNA，因此掛鎖探針不能與CDNA雜交，無法成環(huán)和擴(kuò)增。相反，在有目標(biāo)蛋白存在的條件下，由于目標(biāo)蛋白與適體探針高特異性結(jié)合，使得CDNA不能與適體探針雜交，未反應(yīng)的CDNA則能與掛鎖探針的5′和3′端雜交。在大腸桿菌DNA連接酶的作用下，掛鎖探針5′和3′端連接成環(huán)。形成的環(huán)狀掛鎖探針以CDNA作為引物在Phi29 DNA聚合酶作用下進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，得到如圖1所示長鏈單鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。該擴(kuò)增產(chǎn)物含有成千上萬與環(huán)狀掛鎖探針互補(bǔ)的重復(fù)序列，而每段重復(fù)序列又包含能與分子信標(biāo)檢測(cè)探針環(huán)狀部分互補(bǔ)的序列，

分子信標(biāo)與其雜交反應(yīng)后，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，熒光基團(tuán)信號(hào)得以恢復(fù)，其熒光強(qiáng)度大小與目標(biāo)蛋白含量相關(guān)，基于此構(gòu)建了可以對(duì)超微量樣品中的目標(biāo)蛋白快速靈敏檢測(cè)的熒光適配體傳感器。該傳感方法將適體與蛋白質(zhì)的特異反應(yīng)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)核酸的擴(kuò)增反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的信號(hào)放大和靈敏檢測(cè)，檢測(cè)速度快，操作簡單易行。通過改變適體探針、掛鎖探針和CDNA的序列，還可以將該方法應(yīng)用于其它目標(biāo)分子的檢測(cè)，具有通用性。

3.2 CDNA序列的考察

本研究采用的基于滾環(huán)擴(kuò)增的熒光適配體傳感方法包含兩組反應(yīng)，即目標(biāo)蛋白和CDNA均能與適體探針反應(yīng)，而適體探針和掛鎖探針又競爭結(jié)合CDNA，其中CDNA同時(shí)參與了兩組反應(yīng)，其序列的長短直接影響兩組反應(yīng)的程度，因此實(shí)驗(yàn)中考察了不同長度的CDNA序列對(duì)傳感器響應(yīng)性能的影響。設(shè)計(jì)了4條不同長度的CDNA，序列如表1所示。其下劃線部分能與適體探針互補(bǔ)雜交，5′端和3′端分別延伸不同數(shù)量的T堿基以依次增加CDNA和掛鎖探針雜交的堿基對(duì)數(shù)。將此4條不同長度的CDNA分別按照實(shí)驗(yàn)部分的步驟構(gòu)建熒光適配體傳感器，考察傳感器在有無目標(biāo)蛋白時(shí)的熒光響應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。

圖2A中4條曲線從下往上依次為使用CDNA1， CDNA2， CDNA3和CDNA4構(gòu)建的適配體傳感器對(duì)32.4 nmol/L凝血酶的熒光響應(yīng)?？梢?，CDNA1引起的熒光響應(yīng)相對(duì)較小，這可能是CDNA1序列較短，與掛鎖探針雜交不夠穩(wěn)定所致；而當(dāng)CDNA序列延長后，傳感器熒光響應(yīng)急劇升高（如CDNA2）；但繼續(xù)延長序列，熒光升高不夠明顯（如CDNA3和CDNA4），這可能是因?yàn)镃DNA序列延伸到一定長度后，已經(jīng)可以與掛鎖探針穩(wěn)定雜交，繼續(xù)延長序列對(duì)其穩(wěn)定性影響較小。

圖2B圖中4條曲線從下往上依次對(duì)應(yīng)使用CDNA1， CDNA2， CDNA3和CDNA4構(gòu)建的適配體傳感器對(duì)空白樣品的熒光響應(yīng)?？梢姡瑢?duì)于空白樣品，CDNA1和CDNA2引起的熒光響應(yīng)均很小，說明當(dāng)待測(cè)樣品中沒有目標(biāo)蛋白時(shí)，適體探針仍然與CDNA穩(wěn)定雜交，導(dǎo)致CDNA沒有與掛鎖探針反應(yīng)，進(jìn)而沒有后續(xù)的滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生。這可能是因?yàn)镃DNA1和CDNA2與適體探針雜交后，掛鎖探針與適體探針競爭時(shí)不足以將CDNA競爭置換下來。而當(dāng)CDNA的序列延長到一定程度后，例如CDNA3和CDNA4，其與掛鎖探針的雜交穩(wěn)定性要高于與適體探針雜交的穩(wěn)定性，從而即使沒有目標(biāo)蛋白存在，掛鎖探針也可將部分CDNA競爭置換下來，引發(fā)后續(xù)的滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，進(jìn)而與檢測(cè)探針反應(yīng)后可以檢測(cè)到較強(qiáng)的熒光。

圖2 使用不同長度序列CDNA所構(gòu)建傳感器對(duì)相同濃度（32.4 nmol/L）的目標(biāo)蛋白（A圖）和空白樣品（B圖）的熒光響應(yīng)（從下往上依次對(duì)應(yīng)使用CDNA1、CDNA2、CDNA3和CDNA4所構(gòu)建傳感器的熒光響應(yīng)）以及其熒光強(qiáng)度（C圖，黑色柱代表凝血酶樣品，灰色柱代表空白樣品）和相對(duì)熒光強(qiáng)度（D圖）的直接比較。

將圖2A和圖2B中不同CDNA構(gòu)建的傳感系統(tǒng)對(duì)有無目標(biāo)分子的熒光響應(yīng)進(jìn)行直接對(duì)比，發(fā)現(xiàn)隨著互補(bǔ)探針序列的增長，傳感系統(tǒng)的熒光響應(yīng)也均呈增加趨勢(shì)，如圖2C圖所示。對(duì)比發(fā)現(xiàn)CDNA1和CDNA2在有無目標(biāo)分子時(shí)其熒光強(qiáng)度有較大的差值（相對(duì)熒光強(qiáng)度），而CDNA3和CDNA4的相對(duì)熒光強(qiáng)度較小，其中采用CDNA2時(shí)的信噪比最大。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均使用CDNA2用于構(gòu)建本傳感系統(tǒng)。

3.3 掛鎖探針濃度的考察

掛鎖探針與適體探針競爭結(jié)合CDNA，其濃度對(duì)競爭反應(yīng)有一定的影響。實(shí)驗(yàn)考察了掛鎖探針與CDNA濃度在不同的比例關(guān)系下傳感系統(tǒng)的熒光響應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。隨著掛鎖探針和CDNA摩爾濃度比增大，傳感器熒光響應(yīng)也相應(yīng)地增加，在比例關(guān)系為3∶2時(shí)有最大的熒光響應(yīng)。比例關(guān)系繼續(xù)增加，系統(tǒng)熒光響應(yīng)反而降低。這可能是因?yàn)閽戽i探針超過一定濃度后，其濃度越大，越容易導(dǎo)致CDNA的兩端分別連接一分子掛鎖探針。這種情況下掛鎖探針不能被環(huán)化，因而也不能發(fā)生后續(xù)的滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。因此，為了獲得最佳檢測(cè)性能，實(shí)驗(yàn)中選擇掛鎖探針與CDNA的摩爾濃度之比為3∶2。

3.4 傳感器分析性能

本研究利用滾環(huán)擴(kuò)增的基本原理結(jié)合核酸適配體對(duì)目標(biāo)蛋白的特異性識(shí)別發(fā)展了一種有效的熒光適配體傳感方法，將適體探針對(duì)目標(biāo)蛋白的識(shí)別轉(zhuǎn)化為核酸的擴(kuò)增從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，理論上可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單分子目標(biāo)蛋白的檢測(cè)。傳感器對(duì)不同濃度的凝血酶溶液的熒光響應(yīng)如圖4所示。圖4A為此熒光適配體傳感器對(duì)不同樣品溶液的熒光響應(yīng)曲線。隨著凝血酶濃度的增大，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)。在0.067 ～32.4 nmol/L的范圍內(nèi)，520 nm處熒光峰強(qiáng)度與目標(biāo)分子凝血酶濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，線性方程為F=396.5lgC+625.1，相關(guān)系數(shù)為0.9934，以3倍信噪比計(jì)算其檢出限為0.03 nmol/L。endprint

圖4 傳感器對(duì)空白樣品和不同濃度（從a到h： 0.067 nmol/L， 0.2 nmol/L， 0.6 nmol/L， 1.8 nmol/L， 5.4 nmol/L， 16.2 nmol/L和32.4 nmol/L）凝血酶的熒光響應(yīng)（A圖）以及傳感器的線性相關(guān)曲線（B圖）。

Fig.4 （A） Fluorescence response of the sensor to blank sample and thrombin with different concentrations （0.067 nmol/L， 0.2 nmol/L， 0.6 nmol/L， 1.8 nmol/L， 5.4 nmol/L， 16.2 nmol/L and 32.4 nmol/L）； （B） Linear regression curve of the proposed biosensor

與文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)凝血酶的適配體傳感器相比，本研究提出的基于競爭觸發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增的熒光適配體傳感方法其檢測(cè)靈敏度要高于大多數(shù)光學(xué)[10，11]和電化學(xué)[12，13]檢測(cè)方法，可與一些應(yīng)用了其它信號(hào)放大方法的適體傳感方法相媲美。例如，Giusto等[14]基于鄰近延伸信號(hào)放大發(fā)展的熒光適配體傳感器對(duì)凝血酶的檢出限為30 pmol/L，Deng等[15]利用金納米顆粒信號(hào)放大發(fā)展的阻抗型適體傳感器對(duì)凝血酶檢出限達(dá)20 pmol/L。但由于本實(shí)驗(yàn)中凝血酶樣品的用量僅為3 μL，換算成摩爾量后僅為90 amol，遠(yuǎn)低于其它信號(hào)放大方法的實(shí)際用量。而且，本方法很容易通過修改適體探針及其對(duì)應(yīng)的CDNA和掛鎖探針的序列實(shí)現(xiàn)對(duì)其它目標(biāo)分子的檢測(cè)，具有普適性，在腫瘤標(biāo)志物蛋白或小分子等檢測(cè)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3.5 特異性和重現(xiàn)性

本方法的選擇性主要取決于傳感系統(tǒng)的特異性。如圖5所示，32.4 nmol/L凝血酶（約1 μg/mL）引起的傳感器熒光響應(yīng)約為1220 a.u.，而1 mg/mL IgG、10 mg/mL anti-IgG和10 mg/mL BSA引起的熒光響應(yīng)非常小，接近分子信標(biāo)的背景熒光，表明本傳感系統(tǒng)具有良好的選擇性，這主要是由核酸適配體對(duì)其對(duì)應(yīng)目標(biāo)分子的高親和力、高特異性識(shí)別。

考察了傳感器的重現(xiàn)性。實(shí)驗(yàn)中對(duì)線性范圍內(nèi)不同濃度（0.2， 0.6和5.4 nmol/L）的凝血酶樣品進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～5.7%，表明本傳感系統(tǒng)對(duì)凝血酶的檢測(cè)具有較好的重現(xiàn)性。

3.6 回收率測(cè)定

為考察所構(gòu)建傳感器的實(shí)用性，在稀釋10倍的人血清樣品中進(jìn)行了凝血酶的回收率測(cè)定，結(jié)果見表2。平均回收率為98.8%，說明通過本檢測(cè)方案構(gòu)建的傳感系統(tǒng)可用于血液樣品中凝血酶的測(cè)定。

圖5 傳感器特異性考察。32.4 nmol/L凝血酶、1 mg/mL IgG、10 mg/mL anti-IgG和10 mg/mL BSA。

Fig.5 Specificity of the sensor. Conditions： 32.4 nmol/L thrombin， 1 mg/mL IgG， 10 mg/mL anti-IgG and 10 mg/mL BSA.

4 結(jié) 論

建立了一種利用競爭反應(yīng)觸發(fā)連接和滾環(huán)放大以檢測(cè)凝血酶的熒光適配體傳感方法。使用背景熒光低的分子信標(biāo)作檢測(cè)探針，此方法對(duì)模型目標(biāo)蛋白凝血酶可實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)，檢出限可低至0.03 nmol/L。通過設(shè)計(jì)不同的適體探針、CDNA及掛鎖探針，可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同目標(biāo)蛋白質(zhì)的檢測(cè)，具有普適性。

References

1 TUYong-Hua， CHENG Gui-Fang， LIN Li. Chem. J. Chinese Universities， 2006， 27（12）： 2266-2270

徒永華， 程圭芳， 林 莉. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)， 2006， 27（12）： 2266-2270

2 YUAN Tao， LIU Zhong-Yuan， HU Lian-Zhe， XU Guo-Bao. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（7）： 972-977

袁 濤， 劉中原， 胡連哲， 徐國寶. 分析化學(xué)， 2011， 39（7）： 972-977

3 FENG Ya-Juan， YANG Yun-Hui. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（8）： 1137-1142

馮亞娟， 楊云慧. 分析化學(xué)， 2014， 42（8）： 1137-1142

4 Ho H A， Leclerc M. J. Am. Chem. Soc.， 2004， 126（5）： 1384-1387

5 Alsager O A， Kumar S， Zhu B C， Travas-Sejdic J， McNatty K P， Hodgkiss J M. Anal. Chem.， 2015， 87（8）： 4201-4209

6 Yang C， Spinelli N， Perrier S， Defrancq E， Peyrin E. Anal. Chem.， 2015， 87（6）： 3139-3143

7 Zhang S B， Hu X，Yang X H， Sun Q L， Xu X L， Liu X W， Shen G Y， Lu J L， Shen G L， Yu R Q. Biosens. Bioelectron.， 2015， 66： 363-369

8 Wu Z S， Zhang S B， Zhou H， Shen G L， Yu R Q. Anal. Chem.， 2010， 82（6）： 2221-2227

9 Frank B D， John R N， Theresa L G， Roger S L. Genome Res.， 2001， 11（6）： 1095-1099

10 Hamaguchi N， Ellingtion A， Stanton M. Anal. Biochem.， 2001， 294（2）： 126-131

11 Choi J H， Chen K H， Strano M S. J. Am. Chem. Soc.， 2006， 128（49）： 15584-15585

12 Radi A， Snchez J L A， Baldrich E， O′Sulivan C K. J. Am. Chem. Soc.， 2006， 128（1）： 117-124

13 Xiao Y， Piorek B D， Plaxco K W， Heeger A J. J. Am. Chem. Soc.， 2005， 127（51）： 17990-17991

14 Giusto D A D， Wlassoff W A， Gooding J J， Messerle B A， King G C. Nucleic Acids Res.， 2005， 33（6）： e64

15 Deng C Y， Chen J H， Nie Z， Wang M D， Chu X C， Chen X L， Xiao X L， Lei C Y， Yao S Z. Anal. Chem.， 2009， 81（2）： 739-745endprint