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        基于磁場誘導(dǎo)納米金聚集的表面增強(qiáng)拉曼散射傳感器用于細(xì)菌DNA的檢測

        2015-11-16 10:59:32馬群李艷樂龔年春江西宦雙燕
        分析化學(xué) 2015年11期
        關(guān)鍵詞:磁珠巰基拉曼

        馬群 李艷樂 龔年春 江西 宦雙燕

        摘 要 以5,5′-二巰基-雙(2-硝基苯甲酸)( NB)為拉曼標(biāo)記分子,利用磁珠的分選富集作用以及完全互補(bǔ)的兩條DNA鏈間的雜交作用力,構(gòu)建了一種基于表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)檢測細(xì)菌DNA的超靈敏方法。鏈霉親和素包裹的磁珠通過生物素-親和素連接上捕獲探針,與目標(biāo)細(xì)菌DNA序列部分互補(bǔ)雜交,目標(biāo)鏈的另一端與拉曼染料和納米金功能化的報(bào)告探針DNA鏈互補(bǔ)雜交。此設(shè)計(jì)利用磁球的聚集作用誘使顆粒間距離縮短,產(chǎn)生了等離子體共振耦合效應(yīng),從而使得檢測的SERS信號(hào)顯著增強(qiáng)。結(jié)果表明,在優(yōu)化條件下,DNA濃度在5 pmol/L~5 nmol/L范圍內(nèi),拉曼強(qiáng)度與DNA濃度的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系,檢出限約為5 pmol/L。該方法設(shè)計(jì)簡單,花費(fèi)低廉,能用于細(xì)菌DNA靈敏且有選擇性的檢測。

        關(guān)鍵詞 表面增強(qiáng)拉曼; 納米金; 5,5′-二巰基-雙(2-硝基苯甲酸); 細(xì)菌DNA; 磁聚集

        1 引 言

        表面增強(qiáng)拉曼散射(Surface-enhanced raman scattering, SERS)作為一種振動(dòng)光譜,不僅能夠提供分子內(nèi)結(jié)構(gòu)信息,具有指紋識(shí)別特征;并且SERS借助貴金屬納米結(jié)構(gòu)的局域電磁場增強(qiáng)[1,2],其增強(qiáng)因子可高達(dá)1014~1015[3,4]。此外SERS光譜與其它光譜相比具有穩(wěn)定、不易猝滅、可用紅光激發(fā)、對(duì)生物樣品損壞小、不受生物樣品自身熒光及水的干擾等特點(diǎn),已廣泛用于蛋白質(zhì)[5,6]、DNA[7,8]、組織細(xì)胞[9]、小分子[10]、有機(jī)物[11,12]等的檢測。

        在20世紀(jì)80年代初期磁分離技術(shù)就已被提出[13],磁性納米顆粒因具有良好的磁響應(yīng)性,高的分離效率和表面負(fù)載效率,較好的生物相容性和易生物降解等特點(diǎn),可結(jié)合抗體、酶、細(xì)胞、DNA等功能分子,在生物分離、靶向給藥、免疫測定和酶及細(xì)胞的固定等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[14~18]。Jin等[19]合成了Fe2O3@AuNP的核殼結(jié)構(gòu)的磁性納米材料,并基于電化學(xué)方法檢測大腸桿菌的DNA,從而進(jìn)一步檢測水樣中的大腸桿菌;Choo等[20]利用磁球適配體傳感器發(fā)展了一種高靈敏度檢測凝血酶的SERS方法。

        本實(shí)驗(yàn)以拉曼染料功能化的納米金為識(shí)別元件,構(gòu)建了一種新型磁珠分選富集和特異性捕獲的SERS傳感器,用于細(xì)菌DNA的檢測。拉曼染料和DNA序列雙修飾在納米金上作為報(bào)告探針,通過目標(biāo)細(xì)菌DNA互補(bǔ)雜交被捕獲到磁珠上,通過磁珠的分離和富集,檢測其SERS信號(hào)。這種方法不是將體系固定在二維的平面基底上,而是以磁珠為支撐材料,大大提高了捕獲DNA的負(fù)載量,同時(shí)簡化了分離、富集和洗脫程序。此外,通過磁場誘使納米金聚集,產(chǎn)生等離子體耦合效應(yīng),在很大程度上提高了檢測的靈敏度。因此,本方法能簡便、快速地用于細(xì)菌DNA的分析檢測,且具有較高的靈敏度和選擇性。

        2 實(shí)驗(yàn)部分

        2.1 儀器與試劑

        拉曼檢測采用激光共聚焦倒置顯微拉曼光譜儀(英國Renishaw公司)。激發(fā)波長為633 nm,激光功率為10 mW,鏡頭為100倍長焦,光譜采集間隔時(shí)間為10 s,積累次數(shù)1次。

        鏈霉親和素包裹的磁珠(SA-MB, 200 nm,河南惠爾科技有限公司);5,5′-二巰基-雙(2-硝基苯甲酸)(5,5′-Dithio-bis(2-nitrobenzoic acid), NB)、4-對(duì)硝基苯硫酚(4-Nitrothiophenol, NTP)、4-對(duì)巰基苯甲酸(4-Mercaptobenzoic, MBA)、4-對(duì)巰基苯硼酸(4-Sulfanylphenylboronic acid, MPBA),購于Sigma-Aldrich公司;氯金酸(HAuCl4· 2O)、檸檬酸鈉等其它試劑均為分析純(上海國藥試劑有限公司),無需進(jìn)一步處理或純化直接使用。實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)Millipore系統(tǒng)純化(電阻系數(shù)>18.2 MΩ·cm)。實(shí)驗(yàn)室所用緩沖溶液和超純水均需滅菌處理。實(shí)驗(yàn)所用核酸鏈均由TaKaRa生物技術(shù)(大連)合成,序列見表1。

        2.2 金納米顆粒的制備[21]

        根據(jù)經(jīng)典的檸檬酸鈉還原法制備實(shí)驗(yàn)所用粒徑為13 nm的金納米顆粒(Au nanoparticles, AuNPs),步驟如下:將150 mL 0.01%氯金酸(HAuCl4· 2O)溶液邊攪拌邊加熱到沸騰,然后迅速加入4.5 mL 1%檸檬酸鈉溶液。溶液顏色由淺黃色逐漸變成酒紅色后,繼續(xù)加熱沸騰 15 min。撤去熱源,慢慢冷卻至室溫,將制備好的金納米顆粒溶液置于4℃保存。

        2.3 拉曼染料和報(bào)告DNA功能化的金納米顆粒的制備[22,23]

        參照文獻(xiàn),首先,取1 mL金納米顆粒溶液以12000 r/min離心10 min,去除上層溶液,將底部沉淀重新分散在500 μL滅菌水中,然后,加入5 μL 1 mmol/L 拉曼染料溶液。室溫放置30 min后,加入20 μL 100 μmol/L SH-DNA溶液,混合均勻,室溫放置10 min。然后,每隔5 min加入1 μL Citrate-HCl 緩沖液(500 mmol/L,pH 3),使其終濃度為10 mmol/L。再加入HEPES 緩沖液(500 mmol/L, pH 7.6),將溶液的pH值調(diào)回中性,其用量為Citrate-HCl 緩沖液加入量的3倍,室溫培養(yǎng)30 min。所得溶液于12000 r/min下離心10 min,并用5 mmol/L HEPES 緩沖液(pH 7.6)清洗兩次,以充分除去未結(jié)合的拉曼染料和DNA。最后,懸浮在500 μL HEPES 緩沖液(5 mmol/L, pH 7.6),4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

        2.4 捕獲探針的固定

        磁珠使用前, 先洗去其表面的防腐劑。然后加入略過量的生物素修飾的DNA溶液,室溫下放置,時(shí)而輕敲離心管混合,孵育10 min,磁珠此時(shí)被覆了生物素化的DNA片段,用磁力架分離磁珠,操作如上,用緩沖液清洗2~3次。endprint

        2.5 傳感器的制備過程

        8 μL固定了捕獲探針的磁珠加入到100 μL結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,0.5 mol/L NaCl,pH 8.0),再加入不同濃度的細(xì)菌DNA探針,混合液在45℃溫育2 min,冷卻至室溫,磁力架分離,吸棄上清液后,再懸浮在100 μL結(jié)合緩沖液中,最后加入8 μL拉曼染料和報(bào)告DNA功能化的納米金溶液,37℃下孵育30 min,冷卻到室溫,用結(jié)合緩沖液清洗2~3次,并懸浮在10 μL結(jié)合緩沖液中,備用。

        2.6 拉曼檢測

        取上述制備好的溶液置于干燥潔凈的玻璃片上,用磁力架聚集,吸棄上清液,稍干后置于拉曼儀檢測。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

        本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的SERS傳感器的原理如圖1所示,在鏈霉親和素包裹的磁性微球(SA-MB)上,通過親和素-生物素之間強(qiáng)的非共價(jià)作用力,將一端修飾生物素的捕獲探針(Bio-DNA)固定在磁性微球表面,捕獲DNA鏈的堿基與細(xì)菌DNA的部分堿基互補(bǔ)雜交,余下的堿基將與拉曼染料和納米金功能化的報(bào)告DNA探針互補(bǔ)雜交,通過磁珠的分離富集誘導(dǎo)納米金聚集,產(chǎn)生顯著的SERS增強(qiáng)信號(hào)。當(dāng)細(xì)菌DNA不存在時(shí),則無法在磁性微球上組裝納米金功能化的報(bào)告探針,從而無法產(chǎn)生顯著的SERS增強(qiáng)信號(hào)。

        圖2 細(xì)菌DNA濃度為50 nmol/L時(shí)檢測的SERS光譜圖,不加細(xì)菌DNA(a)和加細(xì)菌DNA(b)

        Fig.2 SERS spectra of bacterial DNA(50 nmol/L) detection, without the bacterial DNA (a) and with bacterial DNA (b)

        3.2 DNA檢測的現(xiàn)象驗(yàn)證

        為了最小化熒光背景和提高信噪比,選擇非熒光型的染料分子5,5′-二雙(2-硝基苯甲酸)作為拉曼信標(biāo)。圖2是此傳感器用于細(xì)菌DNA檢測所得到的SERS光譜。對(duì)于空白組,光譜呈現(xiàn)非常弱的SERS信號(hào),拉曼位移在1333 cm

        處的特征峰的峰強(qiáng)為1.53×103 counts/cm(圖2a),說明不存在細(xì)菌DNA鏈時(shí),報(bào)告探針無法組裝在磁珠的表面;對(duì)于實(shí)驗(yàn)組,光譜則呈現(xiàn)顯著增強(qiáng)的SERS信號(hào),拉曼位移在1333 cm

        處的特征峰的峰強(qiáng)2.68×103 counts/cm (圖2b),具有比較理想的信噪比17.6。

        3.3 報(bào)告探針的表征

        貴金屬納米顆粒具有較強(qiáng)的局域表面等離子體共振效應(yīng),在紫外可見波段有很強(qiáng)的吸收,圖3A是采用檸檬酸三鈉還原法制備的納米金顆粒,測得其溶液的UV-Vis最大吸收波長為519 nm,可以推測其粒徑約為13 nm[24]。納米金顆粒表面同時(shí)修飾巰基DNA和拉曼分子 NB后,測得溶液的最大吸收波長為524 nm,與未修飾的納米金溶液最大吸收波長相比紅移了5 nm,這可能是由于納米金顆粒表面通過Au-SH鍵修飾DNA和 NB后所引起的;圖3B顯示的是修飾在金顆粒表面的拉曼信標(biāo) NB的SERS光譜圖,這說明了拉曼信標(biāo) NB和巰基DNA都被成功修飾在了金顆粒的表面。

        3.4 報(bào)告探針濃度的優(yōu)化

        報(bào)告探針AuNPs@ NB@DNA的濃度對(duì)方法的信背比有一定的影響,對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化。在固定細(xì)菌DNA的濃度為50 nmol/L時(shí),檢測了報(bào)告探針AuNPs@ NB@DNA濃度分別為2, 4, 6, 8和10 μmol/L (以拉曼染料 NB的濃度為基準(zhǔn))體系的SERS光譜,獲得了5組空白組和實(shí)驗(yàn)組的光譜圖。分別計(jì)算了實(shí)驗(yàn)組和空白組的SERS

        光譜的特征峰(拉曼位移為1333 cm

        處的特征峰)的峰強(qiáng),由此得到了不同報(bào)告探針濃度所對(duì)應(yīng)的信背比,如圖4所示。

        3.5 多種不同的拉曼染料驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象

        為了進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行驗(yàn)證,選定了多種非熒光型的拉曼染料,如對(duì)巰基苯甲酸(4-MBA)、對(duì)硝基苯硫酚(NTP)、對(duì)巰基苯硼酸(MPBA),進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)。制備了3種不同的金納米顆粒探針(表面修飾不同的拉曼活性染料),分別將其用于細(xì)菌DNA的檢測,得到了3組空白樣品和實(shí)驗(yàn)樣品。圖5是3組樣品的SERS光譜圖,對(duì)于3個(gè)不同的空白樣品,所得到的拉曼光譜均呈現(xiàn)較弱的SERS響應(yīng);而對(duì)于3個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)樣品,均獲得了顯著增強(qiáng)的SERS信號(hào),并且不同的染料具有特征的拉曼指紋圖譜。

        圖5 3種金納米顆粒探針(表面修飾有不同的拉曼活性染料)用于細(xì)菌DNA檢測的SERS光譜圖。(A)對(duì)巰基苯甲酸(MBA);(B)對(duì)硝基苯硫酚(NTP);(C)對(duì)巰基苯硼酸(MPBA)。其中,空白樣品(a),實(shí)驗(yàn)樣品(b)

        Fig.5 SERS spectroscopy of 3 kinds nanoparticle probes (different Raman active dye modified on the surface) for detection of bacterial DNA. (A) 4-mercaptobenzoic acid (MBA); (B)4-nitrothiophenol (NTP); (C)4-sulfanylphenylboronic acid (MPBA). a, blank sample; b, experimental sample.

        圖6 濃度為50 nmol/L時(shí),完全互補(bǔ)、單錯(cuò)配、四錯(cuò)配和非互補(bǔ)序列(A,B,C,D)經(jīng)過相同實(shí)驗(yàn)操作后,位于1333 cm

        譜峰峰強(qiáng)歸一化后的柱狀圖

        Fig.6 Comparison for Raman intensity normalization of sensors hybridized with complementary target (A), single base mis-matched (B), four base mis-matched (C) and non-complementary sequence (D) under the same conditions and concentration 50 nmol/L)endprint

        3.6 堿基錯(cuò)配的檢測

        圖6所示為相同實(shí)驗(yàn)條件下的單堿基錯(cuò)配、四堿基錯(cuò)配、以及完全不互補(bǔ)錯(cuò)配的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。雖然錯(cuò)配序列比空白都顯現(xiàn)出了正信號(hào),但是完全不互補(bǔ)錯(cuò)配的寡核苷酸的信號(hào)明顯來源于背景信號(hào),完全互補(bǔ)的序列產(chǎn)生的信號(hào)大于單堿基錯(cuò)配序列的3倍,說明此檢測DNA的傳感器具有較好的特異性和選擇性。

        3.7 定量檢測

        在優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件后,對(duì)不同濃度的細(xì)菌DNA的SERS響應(yīng)進(jìn)行了考察,圖7a是目標(biāo)探針濃度分別為0,0.005,0.05,0.5,5和50 nmol/L(從下往上)時(shí)所得到的SERS譜圖。雖然在優(yōu)化條件下,空白樣由于磁珠的非特異性吸附而存在的SERS信號(hào),但是,這樣的背景信號(hào)對(duì)檢測并沒有產(chǎn)生影響,而且也可以觀察到了樣品的SERS信號(hào)隨著細(xì)菌DNA濃度的增加而顯著增強(qiáng)。圖7b是細(xì)菌DNA濃度與拉曼位移1333 cm

        處的特征峰強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)響應(yīng)曲線,其中每個(gè)點(diǎn)均代表在不同的區(qū)域10次測量的平均值。圖7c是細(xì)菌DNA濃度與拉曼位移1333 cm

        處的特征峰強(qiáng)度線性關(guān)系圖,本方法中,DNA濃度在5 pmol/L~5 nmol/L范圍內(nèi),拉曼強(qiáng)度與細(xì)菌其濃度的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系,線性方程為I=1.919 lgCDNA+1.3907(I為拉曼強(qiáng)度,lgCDNA為細(xì)菌DNA濃度的對(duì)數(shù)),其相關(guān)系數(shù)為0.9887。

        圖7 (a)不同細(xì)菌DNA濃度所對(duì)應(yīng)的SERS光譜圖;(b)拉曼位移1333 cm

        處特征峰的峰強(qiáng)度與細(xì)菌DNA濃度之間的關(guān)系;(c)拉曼位移1333 cm

        處特征峰的峰強(qiáng)度與細(xì)菌DNA濃度之間的線性關(guān)系。

        4 結(jié) 論

        本實(shí)驗(yàn)將表面增強(qiáng)拉曼(SERS)傳感技術(shù)與磁珠分選富集技術(shù)相結(jié)合,利用納米金比表面積大、具有良好生物相容性以及表面核酸高負(fù)載量的特點(diǎn),構(gòu)建一種基于納米金聚集信號(hào)放大的新型SERS傳感器。采用三維的磁珠作支撐材料,并通過磁性分離使納米金聚集,產(chǎn)生“熱點(diǎn)”,提高了檢測的靈敏度。本方法設(shè)計(jì)簡單,快速,費(fèi)用低,由于互補(bǔ)DNA鏈間的雜交特性而具有較高的特異性和選擇性,為DNA及其它生物分子的檢測提供了一個(gè)簡單實(shí)用的方法。

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