馬群　李艷樂　龔年春　江西　宦雙燕

摘 要 以5，5′-二巰基-雙（2-硝基苯甲酸）（ NB）為拉曼標(biāo)記分子，利用磁珠的分選富集作用以及完全互補(bǔ)的兩條DNA鏈間的雜交作用力，構(gòu)建了一種基于表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)檢測細(xì)菌DNA的超靈敏方法。鏈霉親和素包裹的磁珠通過生物素-親和素連接上捕獲探針，與目標(biāo)細(xì)菌DNA序列部分互補(bǔ)雜交，目標(biāo)鏈的另一端與拉曼染料和納米金功能化的報(bào)告探針DNA鏈互補(bǔ)雜交。此設(shè)計(jì)利用磁球的聚集作用誘使顆粒間距離縮短，產(chǎn)生了等離子體共振耦合效應(yīng)，從而使得檢測的SERS信號(hào)顯著增強(qiáng)。結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下，DNA濃度在5 pmol/L～5 nmol/L范圍內(nèi)，拉曼強(qiáng)度與DNA濃度的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，檢出限約為5 pmol/L。該方法設(shè)計(jì)簡單，花費(fèi)低廉，能用于細(xì)菌DNA靈敏且有選擇性的檢測。

關(guān)鍵詞 表面增強(qiáng)拉曼； 納米金； 5，5′-二巰基-雙（2-硝基苯甲酸）； 細(xì)菌DNA； 磁聚集

1 引 言

表面增強(qiáng)拉曼散射（Surface-enhanced raman scattering， SERS）作為一種振動(dòng)光譜，不僅能夠提供分子內(nèi)結(jié)構(gòu)信息，具有指紋識(shí)別特征；并且SERS借助貴金屬納米結(jié)構(gòu)的局域電磁場增強(qiáng)[1，2]，其增強(qiáng)因子可高達(dá)1014～1015[3，4]。此外SERS光譜與其它光譜相比具有穩(wěn)定、不易猝滅、可用紅光激發(fā)、對(duì)生物樣品損壞小、不受生物樣品自身熒光及水的干擾等特點(diǎn)，已廣泛用于蛋白質(zhì)[5，6]、DNA[7，8]、組織細(xì)胞[9]、小分子[10]、有機(jī)物[11，12]等的檢測。

在20世紀(jì)80年代初期磁分離技術(shù)就已被提出[13]，磁性納米顆粒因具有良好的磁響應(yīng)性，高的分離效率和表面負(fù)載效率，較好的生物相容性和易生物降解等特點(diǎn)，可結(jié)合抗體、酶、細(xì)胞、DNA等功能分子，在生物分離、靶向給藥、免疫測定和酶及細(xì)胞的固定等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[14～18]。Jin等[19]合成了Fe2O3@AuNP的核殼結(jié)構(gòu)的磁性納米材料，并基于電化學(xué)方法檢測大腸桿菌的DNA，從而進(jìn)一步檢測水樣中的大腸桿菌；Choo等[20]利用磁球適配體傳感器發(fā)展了一種高靈敏度檢測凝血酶的SERS方法。

本實(shí)驗(yàn)以拉曼染料功能化的納米金為識(shí)別元件，構(gòu)建了一種新型磁珠分選富集和特異性捕獲的SERS傳感器，用于細(xì)菌DNA的檢測。拉曼染料和DNA序列雙修飾在納米金上作為報(bào)告探針，通過目標(biāo)細(xì)菌DNA互補(bǔ)雜交被捕獲到磁珠上，通過磁珠的分離和富集，檢測其SERS信號(hào)。這種方法不是將體系固定在二維的平面基底上，而是以磁珠為支撐材料，大大提高了捕獲DNA的負(fù)載量，同時(shí)簡化了分離、富集和洗脫程序。此外，通過磁場誘使納米金聚集，產(chǎn)生等離子體耦合效應(yīng)，在很大程度上提高了檢測的靈敏度。因此，本方法能簡便、快速地用于細(xì)菌DNA的分析檢測，且具有較高的靈敏度和選擇性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

拉曼檢測采用激光共聚焦倒置顯微拉曼光譜儀（英國Renishaw公司）。激發(fā)波長為633 nm，激光功率為10 mW，鏡頭為100倍長焦，光譜采集間隔時(shí)間為10 s，積累次數(shù)1次。

鏈霉親和素包裹的磁珠（SA-MB， 200 nm，河南惠爾科技有限公司）；5，5′-二巰基-雙（2-硝基苯甲酸）（5，5′-Dithio-bis（2-nitrobenzoic acid）， NB）、4-對(duì)硝基苯硫酚（4-Nitrothiophenol， NTP）、4-對(duì)巰基苯甲酸（4-Mercaptobenzoic， MBA）、4-對(duì)巰基苯硼酸（4-Sulfanylphenylboronic acid， MPBA），購于Sigma-Aldrich公司；氯金酸（HAuCl4· 2O）、檸檬酸鈉等其它試劑均為分析純（上海國藥試劑有限公司），無需進(jìn)一步處理或純化直接使用。實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)Millipore系統(tǒng)純化（電阻系數(shù)>18.2 MΩ·cm）。實(shí)驗(yàn)室所用緩沖溶液和超純水均需滅菌處理。實(shí)驗(yàn)所用核酸鏈均由TaKaRa生物技術(shù)（大連）合成，序列見表1。

2.2 金納米顆粒的制備[21]

根據(jù)經(jīng)典的檸檬酸鈉還原法制備實(shí)驗(yàn)所用粒徑為13 nm的金納米顆粒（Au nanoparticles， AuNPs），步驟如下：將150 mL 0.01%氯金酸（HAuCl4· 2O）溶液邊攪拌邊加熱到沸騰，然后迅速加入4.5 mL 1%檸檬酸鈉溶液。溶液顏色由淺黃色逐漸變成酒紅色后，繼續(xù)加熱沸騰 15 min。撤去熱源，慢慢冷卻至室溫，將制備好的金納米顆粒溶液置于4℃保存。

2.3 拉曼染料和報(bào)告DNA功能化的金納米顆粒的制備[22，23]

參照文獻(xiàn)，首先，取1 mL金納米顆粒溶液以12000 r/min離心10 min，去除上層溶液，將底部沉淀重新分散在500 μL滅菌水中，然后，加入5 μL 1 mmol/L 拉曼染料溶液。室溫放置30 min后，加入20 μL 100 μmol/L SH-DNA溶液，混合均勻，室溫放置10 min。然后，每隔5 min加入1 μL Citrate-HCl 緩沖液（500 mmol/L，pH 3），使其終濃度為10 mmol/L。再加入HEPES 緩沖液（500 mmol/L， pH 7.6），將溶液的pH值調(diào)回中性，其用量為Citrate-HCl 緩沖液加入量的3倍，室溫培養(yǎng)30 min。所得溶液于12000 r/min下離心10 min，并用5 mmol/L HEPES 緩沖液（pH 7.6）清洗兩次，以充分除去未結(jié)合的拉曼染料和DNA。最后，懸浮在500 μL HEPES 緩沖液（5 mmol/L， pH 7.6），4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 捕獲探針的固定

磁珠使用前， 先洗去其表面的防腐劑。然后加入略過量的生物素修飾的DNA溶液，室溫下放置，時(shí)而輕敲離心管混合，孵育10 min，磁珠此時(shí)被覆了生物素化的DNA片段，用磁力架分離磁珠，操作如上，用緩沖液清洗2～3次。endprint

2.5 傳感器的制備過程

8 μL固定了捕獲探針的磁珠加入到100 μL結(jié)合緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH 8.0），再加入不同濃度的細(xì)菌DNA探針，混合液在45℃溫育2 min，冷卻至室溫，磁力架分離，吸棄上清液后，再懸浮在100 μL結(jié)合緩沖液中，最后加入8 μL拉曼染料和報(bào)告DNA功能化的納米金溶液，37℃下孵育30 min，冷卻到室溫，用結(jié)合緩沖液清洗2～3次，并懸浮在10 μL結(jié)合緩沖液中，備用。

2.6 拉曼檢測

取上述制備好的溶液置于干燥潔凈的玻璃片上，用磁力架聚集，吸棄上清液，稍干后置于拉曼儀檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的SERS傳感器的原理如圖1所示，在鏈霉親和素包裹的磁性微球（SA-MB）上，通過親和素-生物素之間強(qiáng)的非共價(jià)作用力，將一端修飾生物素的捕獲探針（Bio-DNA）固定在磁性微球表面，捕獲DNA鏈的堿基與細(xì)菌DNA的部分堿基互補(bǔ)雜交，余下的堿基將與拉曼染料和納米金功能化的報(bào)告DNA探針互補(bǔ)雜交，通過磁珠的分離富集誘導(dǎo)納米金聚集，產(chǎn)生顯著的SERS增強(qiáng)信號(hào)。當(dāng)細(xì)菌DNA不存在時(shí)，則無法在磁性微球上組裝納米金功能化的報(bào)告探針，從而無法產(chǎn)生顯著的SERS增強(qiáng)信號(hào)。

圖2 細(xì)菌DNA濃度為50 nmol/L時(shí)檢測的SERS光譜圖，不加細(xì)菌DNA（a）和加細(xì)菌DNA（b）

Fig.2 SERS spectra of bacterial DNA（50 nmol/L） detection， without the bacterial DNA （a） and with bacterial DNA （b）

3.2 DNA檢測的現(xiàn)象驗(yàn)證

為了最小化熒光背景和提高信噪比，選擇非熒光型的染料分子5，5′-二雙（2-硝基苯甲酸）作為拉曼信標(biāo)。圖2是此傳感器用于細(xì)菌DNA檢測所得到的SERS光譜。對(duì)于空白組，光譜呈現(xiàn)非常弱的SERS信號(hào)，拉曼位移在1333 cm

處的特征峰的峰強(qiáng)為1.53×103 counts/cm（圖2a），說明不存在細(xì)菌DNA鏈時(shí)，報(bào)告探針無法組裝在磁珠的表面；對(duì)于實(shí)驗(yàn)組，光譜則呈現(xiàn)顯著增強(qiáng)的SERS信號(hào)，拉曼位移在1333 cm

處的特征峰的峰強(qiáng)2.68×103 counts/cm （圖2b），具有比較理想的信噪比17.6。

3.3 報(bào)告探針的表征

貴金屬納米顆粒具有較強(qiáng)的局域表面等離子體共振效應(yīng)，在紫外可見波段有很強(qiáng)的吸收，圖3A是采用檸檬酸三鈉還原法制備的納米金顆粒，測得其溶液的UV-Vis最大吸收波長為519 nm，可以推測其粒徑約為13 nm[24]。納米金顆粒表面同時(shí)修飾巰基DNA和拉曼分子 NB后，測得溶液的最大吸收波長為524 nm，與未修飾的納米金溶液最大吸收波長相比紅移了5 nm，這可能是由于納米金顆粒表面通過Au-SH鍵修飾DNA和 NB后所引起的；圖3B顯示的是修飾在金顆粒表面的拉曼信標(biāo) NB的SERS光譜圖，這說明了拉曼信標(biāo) NB和巰基DNA都被成功修飾在了金顆粒的表面。

3.4 報(bào)告探針濃度的優(yōu)化

報(bào)告探針AuNPs@ NB@DNA的濃度對(duì)方法的信背比有一定的影響，對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化。在固定細(xì)菌DNA的濃度為50 nmol/L時(shí)，檢測了報(bào)告探針AuNPs@ NB@DNA濃度分別為2， 4， 6， 8和10 μmol/L （以拉曼染料 NB的濃度為基準(zhǔn)）體系的SERS光譜，獲得了5組空白組和實(shí)驗(yàn)組的光譜圖。分別計(jì)算了實(shí)驗(yàn)組和空白組的SERS

光譜的特征峰（拉曼位移為1333 cm

處的特征峰）的峰強(qiáng)，由此得到了不同報(bào)告探針濃度所對(duì)應(yīng)的信背比，如圖4所示。

3.5 多種不同的拉曼染料驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象

為了進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行驗(yàn)證，選定了多種非熒光型的拉曼染料，如對(duì)巰基苯甲酸（4-MBA）、對(duì)硝基苯硫酚（NTP）、對(duì)巰基苯硼酸（MPBA），進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)。制備了3種不同的金納米顆粒探針（表面修飾不同的拉曼活性染料），分別將其用于細(xì)菌DNA的檢測，得到了3組空白樣品和實(shí)驗(yàn)樣品。圖5是3組樣品的SERS光譜圖，對(duì)于3個(gè)不同的空白樣品，所得到的拉曼光譜均呈現(xiàn)較弱的SERS響應(yīng)；而對(duì)于3個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)樣品，均獲得了顯著增強(qiáng)的SERS信號(hào)，并且不同的染料具有特征的拉曼指紋圖譜。

圖5 3種金納米顆粒探針（表面修飾有不同的拉曼活性染料）用于細(xì)菌DNA檢測的SERS光譜圖。（A）對(duì)巰基苯甲酸（MBA）；（B）對(duì)硝基苯硫酚（NTP）；（C）對(duì)巰基苯硼酸（MPBA）。其中，空白樣品（a），實(shí)驗(yàn)樣品（b）

Fig.5 SERS spectroscopy of 3 kinds nanoparticle probes （different Raman active dye modified on the surface） for detection of bacterial DNA. （A） 4-mercaptobenzoic acid （MBA）； （B）4-nitrothiophenol （NTP）； （C）4-sulfanylphenylboronic acid （MPBA）. a， blank sample； b， experimental sample.

圖6 濃度為50 nmol/L時(shí)，完全互補(bǔ)、單錯(cuò)配、四錯(cuò)配和非互補(bǔ)序列（A，B，C，D）經(jīng)過相同實(shí)驗(yàn)操作后，位于1333 cm

譜峰峰強(qiáng)歸一化后的柱狀圖

Fig.6 Comparison for Raman intensity normalization of sensors hybridized with complementary target （A）， single base mis-matched （B）， four base mis-matched （C） and non-complementary sequence （D） under the same conditions and concentration 50 nmol/L）endprint

3.6 堿基錯(cuò)配的檢測

圖6所示為相同實(shí)驗(yàn)條件下的單堿基錯(cuò)配、四堿基錯(cuò)配、以及完全不互補(bǔ)錯(cuò)配的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。雖然錯(cuò)配序列比空白都顯現(xiàn)出了正信號(hào)，但是完全不互補(bǔ)錯(cuò)配的寡核苷酸的信號(hào)明顯來源于背景信號(hào)，完全互補(bǔ)的序列產(chǎn)生的信號(hào)大于單堿基錯(cuò)配序列的3倍，說明此檢測DNA的傳感器具有較好的特異性和選擇性。

3.7 定量檢測

在優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件后，對(duì)不同濃度的細(xì)菌DNA的SERS響應(yīng)進(jìn)行了考察，圖7a是目標(biāo)探針濃度分別為0，0.005，0.05，0.5，5和50 nmol/L（從下往上）時(shí)所得到的SERS譜圖。雖然在優(yōu)化條件下，空白樣由于磁珠的非特異性吸附而存在的SERS信號(hào)，但是，這樣的背景信號(hào)對(duì)檢測并沒有產(chǎn)生影響，而且也可以觀察到了樣品的SERS信號(hào)隨著細(xì)菌DNA濃度的增加而顯著增強(qiáng)。圖7b是細(xì)菌DNA濃度與拉曼位移1333 cm

處的特征峰強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)響應(yīng)曲線，其中每個(gè)點(diǎn)均代表在不同的區(qū)域10次測量的平均值。圖7c是細(xì)菌DNA濃度與拉曼位移1333 cm

處的特征峰強(qiáng)度線性關(guān)系圖，本方法中，DNA濃度在5 pmol/L～5 nmol/L范圍內(nèi)，拉曼強(qiáng)度與細(xì)菌其濃度的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，線性方程為I=1.919 lgCDNA+1.3907（I為拉曼強(qiáng)度，lgCDNA為細(xì)菌DNA濃度的對(duì)數(shù)），其相關(guān)系數(shù)為0.9887。

圖7 （a）不同細(xì)菌DNA濃度所對(duì)應(yīng)的SERS光譜圖；（b）拉曼位移1333 cm

處特征峰的峰強(qiáng)度與細(xì)菌DNA濃度之間的關(guān)系；（c）拉曼位移1333 cm

處特征峰的峰強(qiáng)度與細(xì)菌DNA濃度之間的線性關(guān)系。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)將表面增強(qiáng)拉曼（SERS）傳感技術(shù)與磁珠分選富集技術(shù)相結(jié)合，利用納米金比表面積大、具有良好生物相容性以及表面核酸高負(fù)載量的特點(diǎn)，構(gòu)建一種基于納米金聚集信號(hào)放大的新型SERS傳感器。采用三維的磁珠作支撐材料，并通過磁性分離使納米金聚集，產(chǎn)生“熱點(diǎn)”，提高了檢測的靈敏度。本方法設(shè)計(jì)簡單，快速，費(fèi)用低，由于互補(bǔ)DNA鏈間的雜交特性而具有較高的特異性和選擇性，為DNA及其它生物分子的檢測提供了一個(gè)簡單實(shí)用的方法。

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