陳明政 鄒學(xué)森 李金高 龔小昌 敖 帆 陳文學(xué)

從基因組研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)高等動(dòng)物及人類基因組中編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域只占1%～2%，大多數(shù)區(qū)域不編碼蛋白質(zhì)，但是會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大量的非編碼 RNA(noncoding RNA，ncRNA)，這些ncRNA沒(méi)有開(kāi)放性讀碼框，或者有一個(gè)保守性非常差的短開(kāi)放性讀碼框。ncRNA分為兩類，一類為長(zhǎng)度小于200 nt的RNA分子稱為小分子RNA，包括microRNA和小干擾RNA，另一類為長(zhǎng)度大于200 nt的RNA分子稱為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)。近10年的研究發(fā)現(xiàn)大量的小分子RNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的調(diào)控作用，而對(duì)lncRNA的發(fā)現(xiàn)和功能研究比較少，到目前為止只有十幾種lncRNA的功能研究的比較清楚，近期的研究顯示lncRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性［1-2］。本研究通過(guò)EST數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和電子差異表達(dá)差減算法等生物學(xué)信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了5個(gè)可能與鼻咽癌相關(guān)的lncRNA，通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)其在細(xì)胞株和鼻咽癌組織表達(dá)量篩選出與鼻咽癌的相關(guān)性lncRNA。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本收集

30例組織標(biāo)本均取自江西省腫瘤醫(yī)院放三科鼻咽鏡室，其中初治鼻咽癌患者20例，鼻咽淋巴組織增生標(biāo)本10例，所有的組織標(biāo)本均經(jīng)過(guò)病理學(xué)檢查明確診斷。組織標(biāo)本離體后立即放入無(wú)RNA酶的凍存管中，浸入液氮中保存。

1.2 細(xì)胞株

鼻咽正常細(xì)胞株NP69和鼻咽癌細(xì)胞株HK1由本室保存。培養(yǎng)條件NP69用K-SFM培養(yǎng)基(GIBCO公司)，HK1用汗10%滅火胎牛血清的1640培養(yǎng)基(GIBCO 公司)，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取和純化及cDNA合成 細(xì)胞株RNA提取參照TRIZOL試劑(Invitrogen)說(shuō)明書(shū)，組織標(biāo)本參照微量RNA提取試劑盒(天根生化)提取。所有提取的RNA都用DnaseⅠ去除總RNA中混雜的基因組DNA污染。提取結(jié)束后用紫外分光光度儀檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm和280 nm下RNA光密度值，計(jì)算出RNA純度并定量。采用隨機(jī)引物將純化后的RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增 PCR引物序列見(jiàn)表1，按照Sybgreen PCR mix試劑盒(Takala公司)說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行PCR操作，操作結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，K-S檢驗(yàn)檢測(cè)各種數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞株中5個(gè)lncRNA的表達(dá)情況

熒光PCR結(jié)果采用2△△ct方法計(jì)算各lncRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示LINC00520在HK-1中呈低表達(dá)，MIR100HG、LINC00340、DNM30S、LINC01135 在HK-1中呈高表達(dá)。

2.2 組織lncRNA中5個(gè)的表達(dá)情況

20例鼻咽癌標(biāo)本中有5例標(biāo)本RNA提取失敗，10例鼻咽良性病變標(biāo)本有2例RNA提取失敗。所有的標(biāo)本用熒光PCR結(jié)果采用2△△ct方法計(jì)算各lncRNA的表達(dá)情況。將所有標(biāo)本中的極大值極小值去除，鼻咽癌組和非鼻咽癌組的表達(dá)情況見(jiàn)圖1。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LINC00340、DNM30S在鼻咽癌組表達(dá)水平高于非鼻咽癌組，P值分別為0.014和0.005。LINC00520在非鼻咽癌組表達(dá)高于鼻咽癌組，P值為0.038。

圖1 lncRNA在鼻咽癌組和非鼻咽癌組中表達(dá)情況

3 討論

近幾年對(duì)非編碼RNA尤其是microRNA研究非常廣泛，但是對(duì)lncRNA研究較少，尤其是在腫瘤研究領(lǐng)域。Baranova首先使用電子差異表達(dá)算法預(yù)測(cè)腫瘤特異性ESD片段，后來(lái)經(jīng)過(guò)對(duì)6個(gè)沒(méi)有編碼蛋白質(zhì)潛能的ESD片段進(jìn)行PCR分析，發(fā)現(xiàn)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本上相互吻合［3-4］。因此本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)在鼻咽癌中有差異表達(dá)的lncRNA，通過(guò)對(duì)5個(gè)lncRNA進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)lncRNA在鼻咽癌與非鼻咽癌之間有差異表達(dá)。

在標(biāo)本RNA的提取過(guò)程中如果污染了基因組DNA，在擴(kuò)增過(guò)程中將無(wú)法區(qū)分?jǐn)U增信號(hào)的真實(shí)來(lái)源，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。本研究在PCR擴(kuò)增過(guò)程中采用基因組對(duì)照以明確是否有基因組污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果。lncRNA不同于mRNA，不一定具備多聚A尾，因此我們使用隨機(jī)引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以減小誤差。

研究顯示lncRNA通過(guò)不同的分子機(jī)制起不同的生物學(xué)作用包括遺傳印跡(如H19 RNA)、反式基因調(diào)節(jié)(如HOTAIR)、P53應(yīng)答下調(diào)控全基因抑制活動(dòng)(如linc RNA-p21)、作用于X染色體失活(如Xist)和調(diào)節(jié)細(xì)胞核輸入(如 Nron)。近期研究顯示，H19和 HOTAIR等一些 linc RNA參與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移［5-6］。本研究發(fā)現(xiàn)的3個(gè)有差異表達(dá)的linc RNA分別為L(zhǎng)INC00520、LINC00340、DNM30S。LINC00520 是 2012年新發(fā)現(xiàn)的基因，它與西班牙兒童肥胖有相關(guān)性［7］，2014年全基因組研究顯示LINC00520與孟加拉國(guó)成年人體重相關(guān)的一個(gè)基因表型［8］。LINC00340目前被認(rèn)為是抑癌基因，大部分相關(guān)研究神經(jīng)母細(xì)胞瘤中有報(bào)道，低水平的LINC00340表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)展有高度相關(guān)性，患者預(yù)后更差，基因表達(dá)分析顯示隨著LINC00340表達(dá)的降低，神經(jīng)母細(xì)胞內(nèi)的分子標(biāo)志降低，細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞粘附能力增加［9-10］。DNM30S可以形成mir199A2前體調(diào)節(jié)mir199A2/214表達(dá)，在卵巢癌干細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)mir199A2/214可以調(diào)節(jié)卵巢癌干細(xì)胞的分化，原始卵巢癌干細(xì)胞mir199A2/214低表達(dá)，成熟的卵巢癌干細(xì)胞mir199A2/214高表達(dá)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)的 3個(gè) linc RNA在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后中起什么樣的作用還有待于后續(xù)的研究。

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