劉敏，馬富玲，韓榮，李美，劉淑芬，張淑敏

診斷技術(shù)

吖啶橙熒光染色法在循環(huán)腫瘤細(xì)胞篩查中的應(yīng)用

劉敏，馬富玲△，韓榮，李美，劉淑芬，張淑敏

目的應(yīng)用吖啶橙熒光（AO-F）染色法搭建循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）篩選平臺(tái)，并將其應(yīng)用于腎癌患者外周血CTCs篩查。方法選擇轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者27例（研究組），用不同濃度的血清培養(yǎng)腎癌原代腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞系769-P，分別制備涂片于熒光顯微鏡下，觀察細(xì)胞形態(tài)及著色情況是否一致；隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野下AO-F陽性（+）細(xì)胞占769-P細(xì)胞的比例，評(píng)估AO-F染料對腫瘤細(xì)胞的敏感性；清晨抽取10例健康體檢者（對照組）空腹外周血，紅細(xì)胞裂解后富集單個(gè)核細(xì)胞，配制含1×106個(gè)細(xì)胞的懸液；取對數(shù)生長期腎腫瘤細(xì)胞，配制成每管分別含500、200、100、50、10個(gè)腫瘤細(xì)胞的懸液，與1×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞混合，建立腎癌外周血CTCs模型，AO-F染色后計(jì)算腫瘤細(xì)胞回收率；另計(jì)算2組外周血AO-F+細(xì)胞的檢出率，分析其與患者臨床參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果腎癌原代腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞系769-P均呈現(xiàn)出鮮明色彩，兩者具有相似的形態(tài)學(xué)特征，平均每個(gè)視野下AO-F+細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的比例為93%±3%。含500、200、100、50個(gè)細(xì)胞的懸液組腫瘤細(xì)胞回收率（%）分別為10.2±3.8、9.2±2.3、10.8±2.6、10.5±1.9，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。含10個(gè)細(xì)胞的懸液組偶然可檢測到AO-F+細(xì)胞。對照組無一例陽性，研究組9例檢測到AO-F+細(xì)胞，檢出率為33.33%；檢出率在不同年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、Furhman分級(jí)、轉(zhuǎn)移部位及帶瘤狀態(tài)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論AO-F染色法篩查腎癌患者外周血CTCs切實(shí)可行，并具有高度的特異性和可重復(fù)性，對早期預(yù)測腎癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有一定參考價(jià)值。

吖啶橙；顯微鏡檢查，熒光；癌，腎細(xì)胞；循環(huán)腫瘤細(xì)胞

近年來，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）作為腫瘤的“液體活檢標(biāo)本”，在腫瘤早期診斷、療效判定、預(yù)后判斷方面的價(jià)值備受關(guān)注。CTCs的出現(xiàn)可作為評(píng)估腫瘤患者預(yù)后的因素之一，并與腫瘤有無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)［1］。近年來有許多前沿技術(shù)應(yīng)用于CTCs檢測，目前只有Cell Search系統(tǒng)得到歐美國家認(rèn)同。Cell Search系統(tǒng)通過細(xì)胞表面標(biāo)志富集CTCs，但因腎癌細(xì)胞缺乏特異性標(biāo)志物限制了其在腎癌領(lǐng)域的應(yīng)用。吖啶橙（acridine orange fluorescent，AO-F）作為一種熒光絡(luò)黃染料，具有高度異染性，已經(jīng)應(yīng)用于胸水、腹水、尿液等標(biāo)本的腫瘤細(xì)胞檢測［2］。本研究旨在建立吖啶橙熒光法篩查CTCs的技術(shù)，并將其應(yīng)用于腎癌患者的早期診斷及術(shù)后隨訪。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2013年7月—2014年5月我院收治的轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者27例（研究組），其中男19例，女8例；年齡28～79歲，平均（61.63±12.04）歲?；颊呔忻鞔_病理組織學(xué)診斷證實(shí)為腎細(xì)胞癌，且具有充分臨床或影像學(xué)證據(jù)確診為轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌，均未接受任何治療。另擇10例健康體檢者作對照組，其中男6例，女4例；年齡26～79歲，平均（50.1±16.88）歲。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且獲研究對象知情同意。

1.2主要試劑和儀器769-P細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，RPMI-1640培養(yǎng)基、熱滅活胎牛血清、淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊锟萍加邢薰?，胰蛋白酶、膠原酶Ⅱ、紅細(xì)胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司，熒光顯微鏡（Olympus BX51），離心機(jī)（BAIYANG B160A），超凈臺(tái)（Labeier），CO2培養(yǎng)箱（Forma Scientific）。

1.3方法

1.3.1腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)新鮮腎癌組織經(jīng)膠原酶Ⅱ消化，加淋巴細(xì)胞分離液，離心獲得原代腎癌細(xì)胞。加含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2條件下傳代培養(yǎng)。同時(shí)將769-P細(xì)胞系加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細(xì)胞覆蓋瓶底80%時(shí)，胰蛋白酶消化后按1∶3傳代。每5 d傳代1次。取對數(shù)生長期769-P細(xì)胞備用。

1.3.2AO-F染色評(píng)估AO-F染料對腫瘤細(xì)胞的敏感性分別制備原代和769-P細(xì)胞涂片，涂片經(jīng)AO-F染色：AO-F染液中浸泡3 min，PBS沖洗；HCl溶液沖洗5 s，PBS沖洗；CaCl2溶液浸泡3 min，PBS沖洗。加蓋片于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及著色情況。隨機(jī)讀取5個(gè)視野計(jì)算AO-F陽性（+）細(xì)胞占769-P細(xì)胞的比例，評(píng)估AO-F染料對腫瘤細(xì)胞的敏感性。

1.3.3富集對照組外周血單個(gè)核細(xì)胞對照組清晨空腹抽取肘正中靜脈血5 mL，低張紅細(xì)胞裂解液破紅，乙二胺四乙酸（EDTA）漂洗后固定2次，2 000 r/min離心10 min，獲得單個(gè)核細(xì)胞。制備細(xì)胞涂片，經(jīng)AO-F染色后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及著色情況。同時(shí)PBS逐級(jí)稀釋，配制含1×106個(gè)細(xì)胞的懸液置于玻璃管中，共20管，備用。

1.3.4模擬腎癌患者外周血樣取對數(shù)生長期的769-P，計(jì)數(shù)后PBS逐級(jí)稀釋，配制成每管分別含500、200、100、50、10個(gè)769-P細(xì)胞的懸液，與1×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞混合，模擬腎癌患者外周血樣，離心、固定、涂片、染色，重復(fù)4次，計(jì)算腫瘤細(xì)胞回收率。

1.3.5檢測研究組外周血中AO-F+細(xì)胞研究組患者于清晨空腹抽取肘正中靜脈血6 mL。為避免污染摒棄前1 mL。按1.3.3中方法于2 h內(nèi)處理。計(jì)算AO-F+細(xì)胞的檢出率，并分析檢出率與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀（1）AO-F+細(xì)胞：細(xì)胞明顯增大，核異型性明顯，核漿比例失調(diào)；胞核、胞漿均著色，胞核呈亮黃綠色，邊緣不齊；胞漿呈桔紅色，含量少，即為CTCs。（2）AO-F陰性（-）細(xì)胞：細(xì)胞體積小，可見多核、桿狀核、分葉核等白細(xì)胞亞群；胞核呈亮綠色熒光，胞漿不著色。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1腫瘤細(xì)胞生長特點(diǎn)細(xì)胞生長迅速且良好，3次傳代后，質(zhì)量和數(shù)量均能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。見圖1。

Fig.1The primary renal cancer cells observed under inverted microscope（×200）圖1 原代腎癌細(xì)胞光鏡觀察（×200）

2.2各組AO-F染色情況比較AO-F染色后，原代細(xì)胞和細(xì)胞系均呈現(xiàn)出鮮明色彩，兩者具有相似的形態(tài)學(xué)特征：細(xì)胞大小不一，形態(tài)各異，核漿比例失調(diào)，胞核呈明亮黃綠色，胞漿呈鮮亮桔紅色，見圖2a。對照組外周血白細(xì)胞大小均一，胞核被染為亮綠色，胞漿不著色，可見各亞群細(xì)胞核形態(tài)，見圖2b；研究組涂片上可見到兩類細(xì)胞，大部分為白細(xì)胞，僅有個(gè)別AO-F+的腫瘤細(xì)胞，數(shù)目少，但醒目（箭頭所示），見圖2c。

Fig.2Comparison of AO-F staining between three groups（×200）圖2 各組細(xì)胞AO-F染色情況比較（×200）

2.3AO-F染料對腫瘤細(xì)胞的敏感性及腫瘤細(xì)胞回收率平均每個(gè)視野下AO-F+細(xì)胞占769-P細(xì)胞的比例為93%±3%。含500、200、100、50個(gè)細(xì)胞的懸液組腫瘤細(xì)胞回收率（%）分別為：10.2±3.8、9.2± 2.3、10.8±2.6、10.5±1.9，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 1.001，P＞0.05）。含10個(gè)細(xì)胞的懸液組偶然可檢測到AO-F+細(xì)胞。

2.4研究組CTCs檢出率及與臨床病理資料的關(guān)系9例檢測到AO-F+細(xì)胞，檢出率為33.33%。檢出率在不同年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、Furhman分級(jí)、轉(zhuǎn)移部位及帶瘤狀態(tài)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Tab.1Clinical parameters and AO-F positive rate in 27 patients with metastasized renal cancer表1 27例轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者CTCs檢測結(jié)果及與臨床病理資料的關(guān)系例（%）

3 討論

腫瘤微轉(zhuǎn)移是單個(gè)細(xì)胞或微小細(xì)胞團(tuán)形式存在的隱匿性轉(zhuǎn)移，存在于血液循環(huán)中，但常規(guī)臨床病理學(xué)和影像學(xué)方法均不能檢出，需要借助特殊手段才能檢出。早在1869年，澳大利亞學(xué)者Ashworth首次提出了CTCs的概念。細(xì)胞自原發(fā)灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)在遠(yuǎn)處組織、器官增殖并形成轉(zhuǎn)移灶，這部分進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的細(xì)胞即被稱之為CTCs。腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血中是發(fā)生微轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前提［3］。因此，檢測CTCs對監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有重要意義。

目前許多前沿技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到CTCs檢測，如RT-PCR、microRNA、生物芯片等［4-5］，但各自因其不能克服的缺點(diǎn)未被認(rèn)可。Cell Search系統(tǒng)是目前國際上唯一認(rèn)可的技術(shù)，已被批準(zhǔn)用于乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌中CTCs的檢測。腎癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤之一，起源于腎小管上皮細(xì)胞，術(shù)后患者死亡的主要原因是發(fā)生轉(zhuǎn)移。腎癌作為上皮組織來源的腫瘤，理論上細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）表達(dá)率應(yīng)該較高，但Gradilone等［6］選用CK8/18/19抗體標(biāo)志腫瘤細(xì)胞對25例轉(zhuǎn)移性腎癌患者血中CTCs使用Cell Search系統(tǒng)進(jìn)行檢測，檢出率僅有16%，同時(shí)對檢出的CTCs行RT-PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)CK8/18/19表達(dá)率極低，表明腎腫瘤細(xì)胞表面抗原進(jìn)入血液循環(huán)成為CTCs后發(fā)生了變化，導(dǎo)致其表面缺乏特異性腫瘤標(biāo)志物。由于腫瘤的異質(zhì)性，Cell Search系統(tǒng)通過細(xì)胞表面標(biāo)志物篩查CTCs，不可避免地使不表達(dá)特異性標(biāo)志物的腫瘤細(xì)胞亞群“逃脫法網(wǎng)”，造成一定的假陰性。另外由于檢測成本和技術(shù)要求較高，難于在基層醫(yī)院普及，這些都使得Cell Search系統(tǒng)的臨床價(jià)值得不到體現(xiàn)。因此，發(fā)展一種新的檢測方法很有必要。

AO-F作為一種熒光絡(luò)黃染料，具有高度異染性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的研究中。AO-F染色法的原理是腫瘤細(xì)胞能夠特異性地與DNA和RNA結(jié)合，從而使腫瘤細(xì)胞變成“彩色”，在顯微鏡下明顯區(qū)別于正常外周血單個(gè)核細(xì)胞。此法綜合細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)兩方面的特點(diǎn)來判斷細(xì)胞良、惡性，為不表達(dá)特異性標(biāo)志物的CTCs檢測提供了新思路。

本研究結(jié)果顯示，AO-F染色后平均每個(gè)視野下AO-F+細(xì)胞占769-P細(xì)胞的比例為93%±3%，證實(shí)AO-F染料對腫瘤細(xì)胞敏感性高。一定數(shù)量的腫瘤細(xì)胞與健康外周血單個(gè)核細(xì)胞混合，建立腎癌外周血CTCs模型，用AO-F法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示各組腫瘤細(xì)胞回收率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示應(yīng)用AO-F法檢測CTCs較穩(wěn)定，具有較好可重復(fù)性。含10個(gè)細(xì)胞的懸液組偶然可檢測到AO-F+細(xì)胞，與李燕等［7］建立的膜濾過聯(lián)合激光掃描細(xì)胞計(jì)量儀（ISET+LSC）檢測CTCs相比，回收率基本相仿，但較新近出現(xiàn)的CTCs芯片技術(shù)相比，尚不夠理想。整個(gè)過程中的離心、漂洗、計(jì)數(shù)、染色以及AO耐光性弱的內(nèi)在特性［8］等都可造成不同程度的細(xì)胞丟失，需繼續(xù)優(yōu)化。對照組未檢測到AO-F+細(xì)胞，提示該方法有較高的特異性。

本研究結(jié)果顯示，研究組有9例采用AO-F染色法檢測到CTCs，檢出率為33.33%。檢出率在不同年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、Furhman分級(jí)、轉(zhuǎn)移部位及帶瘤狀態(tài)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。李蕾等［9］研究顯示乳腺癌患者血中CTCs檢出率與轉(zhuǎn)移部位存在一定關(guān)系。本研究未發(fā)現(xiàn)兩者存在相關(guān)關(guān)系，可能與腫瘤類型、樣本例數(shù)大小有關(guān)，尚需大樣本研究驗(yàn)證。Bluemke等［10］檢測154例腎癌患者的233份血樣中的CTCs發(fā)現(xiàn)，CTCs檢出率與患者年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)，與本研究結(jié)果基本一致，另外該研究發(fā)現(xiàn)CTCs是腎癌的獨(dú)立預(yù)后因素之一，與淋巴結(jié)陽性及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。對于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移但外周血中未檢出CTCs的患者，這種不一致性可能是由于腫瘤細(xì)胞釋放進(jìn)入血液的周期性變化以及疾病進(jìn)展過程中腫瘤組織與宿主免疫狀態(tài)的相互抗衡等導(dǎo)致的［11］。

AO-F法篩查CTCs作為一種新的檢測方法有其獨(dú)特優(yōu)勢，可以提供CTCs形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)方面的詳細(xì)信息，且克服腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性等問題，為不表達(dá)特異性上皮標(biāo)志物的CTCs檢測提供了新思路。

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（2014-10-13收稿 2015-03-02修回）

（本文編輯 陳麗潔）

The application of acridine orange fluorescent staining method in circulating tumor cell

LIU Min，MA Fuling△，HAN Rong，LI Mei，LIU Shufen，ZHANG Shumin
Department of Urology，The Second Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin Institute of Urinary Surgery，Tianjin 300211，China△

ObjectiveTo establish the screening platform of circulating tumor cells（CTCs）using acridine orange fluo?rescent（AO-F）dyeing method，and to apply it in the screening of peripheral blood CTCs in patients with kidney cancer. MethodsTwenty-seven patients with metastatic renal cell carcinoma was included in this study.Primitive tumor cells and kidney cancer cell line 769-P were cultured with different concentrations of fetal bovine serum.Smears were prepared and observed under fluorescence microscopy.The percentage of AO-F positive staining of 769-P cells under 5 random sights was calculated.The sensitivity of AO-F staining to cells was evaluated.The 5 mL morning fasting venous blood was obtained from 10 subjects with healthy check-up.The 1×106cell suspension was prepared.The logarithmic phase of renal tumor cells was used to prepare tube containing 500，200，100，50 and 10 tumor cell suspension，which were mixed with 1×106nucleated cells to establish CTCs model of renal cancer.AO-F staining method was used to detect the expression of AO-F positive cells.The correlation between expression of AO-F positive cells and clinical parameters was analyzed.ResultsThe prima?ry cells and cell line 769-P showed similar bright color and morphological characteristics.The percentage of AO-F positive staining in 769-P cells was 93%±3%under 5 random sights.The recovery rates（%）of four groups（500，200，100 and 50 tu?mor cell suspension）were 10.2±3.8，9.2±2.3，10.8±2.6 and 10.5±1.9，respectively.There were no significant differences in recovery rates between four groups（P＞0.05）.The group of 10 tumor cell suspension could find AO-F positive staining cells occasionally.Zero case was positive in controls.Nine of 27 patients were positive and the rate was 33.33%.There were no significant statistical differences in AO-F positive rates between gender，age，tumor size，pathological pattern，F(xiàn)urhman stage，metastasis of lung and presence of tumor（P＞0.05）.ConclusionIt is confirmed that the method of CTCs staining with AO-F，which has high specificity and reproducibility，is feasible to detect CTCs and worthy of being studied.There is a certain reference value to predict tumor recurrence and metastasis.

acridine orange；microscopy，fluorescence；carcinoma，renal cell；circulating tumor cells

R737.11；R446-39

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.025

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所（郵編300211）

劉敏（1989），女，碩士在讀，主要從事腎癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞臨床價(jià)值研究

△通訊作者E-mail：18722569796@163.com