胡瑞利，安峰，林媛媛，馬賽，郭博偉

RhoA和Snail在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)及意義

胡瑞利1，安峰2△，林媛媛2，馬賽2，郭博偉2

目的探討RhoA和Snail在涎腺腺樣囊性癌（SACC）中的表達(dá)及其與癌癥侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)RhoA和Snail在55例SACC（SACC組）與20例癌旁正常組織（對(duì)照組）中的表達(dá)情況，分析RhoA和Snail的表達(dá)與SACC臨床病理特征的關(guān)系及其在SACC組織中表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果SACC組的RhoA（69.1%vs 5.0%）和Snail（72.7%vs 10.0%）蛋白陽性表達(dá)率高于對(duì)照組（均P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的RhoA和Snail陽性表達(dá)率高于無轉(zhuǎn)移者，Ⅲ+Ⅳ期的RhoA和Snail陽性表達(dá)率高于Ⅰ+Ⅱ期者；實(shí)體型的RhoA陽性表達(dá)率高于篩孔型，實(shí)體型和管狀型的Snail陽性表達(dá)率高于篩孔型（均P＜0.05），而不同性別、年齡及腫瘤部位的RhoA和Snail陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；RhoA和Snail在SACC中的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.414，P＜0.001）。結(jié)論RhoA和Snail蛋白可能通過RhoA/ROCK/PKD1/NF-κB/Snail信號(hào)傳導(dǎo)通路聯(lián)合作用促進(jìn)了SACC的浸潤和轉(zhuǎn)移。

涎腺腫瘤；癌；Rho相關(guān)激酶類；腫瘤浸潤；腫瘤轉(zhuǎn)移；RhoA；Snail；涎腺腺樣囊性癌

涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcino?ma，SACC）是較常見的口腔頜面部惡性腫瘤之一，侵襲性強(qiáng)，易侵入神經(jīng)和血管，易沿神經(jīng)及血循環(huán)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，肺轉(zhuǎn)移率較高［1］。SACC的侵襲性生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail為鋅指蛋白超家族的第1個(gè)成員，由1個(gè)高度保守的羧基末端及1個(gè)高度可變的氨基末端組成［2］。其超家族的功能為轉(zhuǎn)錄抑制，這與它復(fù)雜保守的蛋白結(jié)構(gòu)域有密切關(guān)聯(lián)。因?yàn)镾nail可誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化，間接增強(qiáng)了細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲的功能，所以Snail被看作是腫瘤轉(zhuǎn)移的促進(jìn)因素［3-4］。而蛋白R(shí)hoA是小G蛋白超家族的成員之一，它不僅參與了細(xì)胞凋亡的過程，而且在細(xì)胞凋亡的起始中起著開關(guān)的作用［5-6］。RhoA基因與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，但目前關(guān)于RhoA蛋白在SACC中的作用尚不明確，有關(guān)RhoA和Snail兩者在SACC中表達(dá)的報(bào)道較少。本研究運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)RhoA和Snail在SACC中的表達(dá)，探討兩者與SACC侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為有效控制SACC的發(fā)生發(fā)展提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取1997年9月—2013年9月于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科存檔的手術(shù)切除SACC石蠟標(biāo)本55例（SACC組），其中男25例，女30例，年齡17～80歲，平均（54.24±12.52）歲，依照2005年WHO對(duì)涎腺腫瘤的病理分類進(jìn)行分型［7］:篩狀型20例，管狀型19例，實(shí)體型16例；TNM分期法（UICC）進(jìn)行臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期37例、Ⅲ+Ⅳ期18例。同時(shí)選取癌旁正常的組織20例作為對(duì)照組，所選取患者術(shù)前均未接受放療和化療。HE染色切片由2位資深的病理醫(yī)師按照WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。

1.2主要試劑兔抗人RhoA多克隆抗體、兔抗人Snail多克隆抗體均購自上海廣銳生物試劑有限公司。

1.3免疫組織化學(xué)PV兩步法檢測(cè)RhoA、Snail蛋白表達(dá)水平石蠟切片經(jīng)過常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、一抗（RhoA和Snail一抗的工作濃度分別為1∶50和1∶75）和二抗分別孵育、DAB顯色、蘇木精復(fù)染，中性樹脂封片后觀察兩者的表達(dá)情況。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。陽性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒，陰性為無顯色。陽性細(xì)胞比例評(píng)分方法：陰性為0分，陽性細(xì)胞比例＜25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。細(xì)胞染色程度評(píng)分法：腫瘤細(xì)胞不著色為0分，淡黃色為1分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞比例評(píng)分×細(xì)胞染色程度評(píng)分=腫瘤細(xì)胞的染色評(píng)分，總分0分為陰性（-），1～2分為（+），3～6分為（++），7～12分為（+++）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料采用表示，組間比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1RhoA和Snail在2組中的表達(dá)RhoA表達(dá)于上皮細(xì)胞膜，部分表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，見圖1；Snail表達(dá)于細(xì)胞核中，呈棕黃色或棕褐色顆粒，見圖2。SACC組的RhoA和Snail陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，見表1。

2.2RhoA和Snail的表達(dá)與SACC臨床病理特征的關(guān)系RhoA和Snail在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中的陽性表達(dá)率高于無轉(zhuǎn)移者，Ⅲ+Ⅳ期的RhoA和Snail陽性表達(dá)率高于Ⅰ+Ⅱ者；實(shí)體型的RhoA陽性表達(dá)率高于篩孔型，實(shí)體型和管狀型的Snail陽性表達(dá)率高于篩孔型（均P＜0.05），而不同性別、年齡及腫瘤部位的RhoA和Snail陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

Tab.1The positive expression of RhoA and Snail in two groups表1 RhoA和Snail在2組中陽性表達(dá)情況例（%）

Tab.2The relationship between positive expression of RhoA，Snail and clinicopathological feature in SACC表2 RhoA、Snail陽性表達(dá)與SACC臨床病理參數(shù)的關(guān)系例（%）

2.3SACC組織中RhoA和Snail的相關(guān)性RhoA和Snail共同陽性30例，共同陰性7例，兩者呈正相關(guān)（rs=0.414，P＜0.001），見表3

Tab.3Correlation between expression of RhoA and Snail proteins in SACC表3 在SACC中RhoA與Snail蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

Rho蛋白屬于Ras超家族的亞家族成員，由相對(duì)分子質(zhì)量為20 000～30 000的GTP結(jié)合蛋白組成［8］。目前為止，最少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20余個(gè)Rho家族成員，根據(jù)其序列同源性和功能的相似性，可分為RhoA類、Rac1類、Cdc42類和缺乏內(nèi)源性GTP酶活性類。RhoA是細(xì)胞內(nèi)重要的中間信號(hào)分子，在肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞間黏附移動(dòng)和基因轉(zhuǎn)錄等過程中均有RhoA參與［9］。已有研究證實(shí)，RhoA在胃癌、肝癌、大腸癌等組織中均呈高表達(dá)，參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖、凋亡和周期調(diào)控等多個(gè)重要環(huán)節(jié)［10］，并且扮演著許多信號(hào)通路分子開關(guān)的角色。在對(duì)乳腺癌的研究中，Cho等［11］發(fā)現(xiàn)如果抑制了RhoA的活性，可對(duì)Snail的活化起到間接阻斷的作用，進(jìn)一步對(duì)Snail介導(dǎo)的靶基因轉(zhuǎn)錄起到了抑制作用，從而使乳腺癌細(xì)胞失去了浸潤和轉(zhuǎn)移的功能。Cowell等［12］研究表明，如果細(xì)胞的連接被破壞，可以使RhoA/ROCK/PKD1/NF-κB/Snail信號(hào)傳導(dǎo)通路激活，而RhoA也是Snail的一個(gè)上游因子。本課題組前期研究已證明，SACC的浸潤和轉(zhuǎn)移與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）有關(guān)［13］，且有研究顯示，RhoA可通過ROCK信號(hào)通路參與VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和血管生成，也可促進(jìn)腫瘤血管的生成，同時(shí)協(xié)助腫瘤細(xì)胞穿越脈管內(nèi)皮向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［14］。

Snail為鋅指蛋白超家族的第一個(gè)成員，人的Snail基因定位于第20號(hào)染色體20q12.3，全長為5 882 bp，包含了3個(gè)外顯子。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail屬于轉(zhuǎn)錄抑制子中的Snail超家族，它可通過誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，提高細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力，因此Snail被視為腫瘤轉(zhuǎn)移的促進(jìn)因素［3-4］。研究表明，Snail在口腔癌、乳腺癌、宮頸癌的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織［15-16］，與本研究結(jié)果相一致，本研究還發(fā)現(xiàn)RhoA與Snail蛋白表達(dá)與不同類型SACC、TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但與患者的年齡大小、性別及腫瘤所生長的部位無關(guān)，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)，提示RhoA和Snail的高表達(dá)可能隨著SACC的惡性程度的增高而增高，有可能提示預(yù)后不良。這一結(jié)果與Cowell等［12］發(fā)現(xiàn)若破壞細(xì)胞的連接可使信號(hào)傳導(dǎo)通路RhoA/ROCK/PKD1/NF-κB/ Snail激活相一致，并且RhoA還可通過ROCK信號(hào)通路參與VEGF的誘導(dǎo)，提示在SACC中如果抑制RhoA的活性，很有可能在一定程度上為SACC的治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。

（圖1、2見插頁）

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（2014-11-12收稿 2015-01-25修回）

（本文編輯 閆娟）

Significance of RhoA and Snail expression in salivary adenoid cystic carcinoma

HU Ruili1，AN Feng2△，LIN Yuanyuan2，MA Sai2，GUO Bowei2
1 Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China；2 The First Affiliated Hospital of Hebei North University△

ObjectiveTo investigate the relationship of RhoA and Snail expressions，and the invasion and metastasis in salivary adenoid cystic carcinoma（SACC）.MethodsThe expressions of RhoA protein and Snail protein in 55 samples of SACC（SACC group）and 20 samples of para-carcinoma normal tissues（control group）were detected using immunohisto?chemical method.The relationship between RhoA protein and Snail protein expressions and clinical and pathological charac?teristics were analyzed.ResultsThe positive expressions of RhoA protein（69.1%vs 5.0%）and Snail protein（72.7%vs 10.0%）were significantly higher in SACC group than those in control group（P＜0.05）.The positive expression rates of RhoA protein and Snail protein were significantly higher in patients with lymph node metastasis than those in patients with?out lymph node metastasis.The positive expression rates of RhoA protein and Snail protein were significantly higher in pa?tients atⅢ+Ⅳstage than those in patients atⅠ+Ⅱstage.The positive expression rates of RhoA protein and Snail protein were significantly higher in substantive carcinal tissues than those in screen roller type and tubular carcinal tissues.The posi?tive expression of Snail protein was significantly higher in substantive and tubular carcinal tissues than that in screen roller type carcinal tissues（P＜0.05）.There were no significant differences in positive expression rates of RhoA and Snail between different gender，age and different carcinal tissues.There was a positive correlation beween expression rates of RhoA and Snail protein in SACC（r=0.414，P＜0.001）.ConclusionRhoA and Snail may both facilitate the infiltration and metastasis of SACC through RhoA/ROCK/PKD1/NF-kappa B/Snail signaling pathways.

salivary gland neoplasms；carcinoma；Rho-associated kinases；neoplasm invasiveness；neoplasm metasta?sis；RhoA；Snail；salivary adenoid cystic carcinoma

R739.87

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.016

張家口市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃指令項(xiàng)目（11110012D）；河北北方學(xué)院自然科學(xué)面上項(xiàng)目（2013010）

1河北北方學(xué)院（郵編075000）；2河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院

胡瑞利（1986），女，碩士在讀，主要從事口腔頜面頭頸部腫瘤研究

△通訊作者E-mail：kq126@126.com