烏洪芳，孫茜，李玉珠，張敏，孟玲玲，李代清△

糖尿病足分離的銅綠假單胞菌對氨基糖苷類抗生素耐藥機制探討

烏洪芳1，孫茜2，李玉珠1，張敏1，孟玲玲1，李代清1△

目的分析糖尿病足潰瘍感染（DFI）銅綠假單胞菌（PA）的臨床特點及對氨基糖苷類抗生素（AmAn）耐藥的表型和基因型。方法采集本院209例DFI患者感染部位的細菌學報告及藥敏結果，篩選出41株PA菌株，以聚合酶鏈反應（PCR）檢測AmAn修飾酶基因aac（3′）-Ⅱ、aac（6′）-Ⅰb、aac（6′）-Ⅱ、ant（2′′）-Ⅰ、ant（3′′）-Ⅰ及aac（3′）-Ⅰ，結合患者的臨床資料和耐藥報告，對耐藥基因型及耐藥表型進行相關分析。結果DFI患者創(chuàng)面分離出的致病菌以革蘭陽性（G+）菌為主（51.67%）；PA的總檢出率為19.62%，且是革蘭陰性菌（G-）的首位致病菌（47.67%）。PA組患者潰瘍面積≥4 cm2的比例高于非PA組和G+組，差異有統(tǒng)計學意義；與G+組相比，PA組患者缺血性潰瘍、骨髓炎的發(fā)生率均較高，患者臨床特點及潰瘍深度評分（SAD評分）、超敏C反應蛋白增高，差異均有統(tǒng)計學意義。30株PA對AmAn耐藥（73.17%）；耐藥基因檢出最多的為ant（3′′）-Ⅰ（65.85%），aac（3′）-Ⅰ未檢出。結論DFI患者PA檢出率較高，且多見于潰瘍面積較大、潰瘍較深及缺血嚴重的患者中；PA對AmAn的耐藥現(xiàn)象較為嚴重；ant（3′′）-Ⅰ是檢出的最常見的耐藥基因。

糖尿病足；假單胞菌，銅綠；氨基糖苷類；微生物敏感性試驗；DNA限制修飾酶類

糖尿病足潰瘍感染（DFI）是糖尿病足致殘、致死的主要原因之一，嚴重威脅著糖尿病患者的生活質量［1］。近幾年DFI中革蘭陰性（G-）菌的檢出率呈逐年上升趨勢，甚至有超越革蘭陽性（G+）菌的報道［2-3］。一般而言，革蘭陰性桿菌和厭氧菌主要在感染嚴重的創(chuàng)面中檢出［4］。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeru?ginosa，PA）對臨床常用抗菌藥物的耐藥性亦呈現(xiàn)上升趨勢，且PA的耐藥機制很復雜，極大加重了臨床治療的困難。本研究通過分析患者的臨床資料、檢測PA分離菌株耐藥基因，揭示PA耐藥與糖尿病足潰瘍感染程度間的相關性，及PA對臨床上常用的氨基糖苷類抗生素（aminoglycoside antibiotics，AmAn）耐藥所檢測出的表型和基因型的關系，以指導臨床抗生素的選擇。

1 對象與方法

1.1對象收集2009年11月—2011年1月于我院糖尿病足病科住院治療的209例DFI患者的臨床資料。糖尿病足感染診斷標準采用2004年美國感染疾病學會制定的糖尿病足潰瘍合并感染的臨床診治指南。

1.2方法

1.2.1細菌培養(yǎng)與藥敏試驗患者入院首次換藥時，對足潰瘍感染部位適度清創(chuàng)后，以刮除或咬剪的方式獲取深部組織樣本，迅速送檢進行細菌培養(yǎng)及藥敏試驗。細菌鑒定參照全國臨床檢驗操作規(guī)程進行。通過觀察菌落形態(tài)、溶血環(huán)識別，革蘭染色以及生化試驗，分離出41株PA菌株。質控菌株ATCC27853購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。采用K-B紙片擴散法對我院常用的抗菌藥物進行藥敏試驗：頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢地嗪、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、氧氟沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、慶大霉素。實驗操作及結果判斷均按美國國家臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）標準進行。

1.2.2DNA模板提取將保存于-20℃的鑒定完畢的PA菌液經(jīng)血平皿37℃培養(yǎng)22 h后用磷酸鹽緩沖液（PBS）適量稀釋，然后室溫下1 500×g，離心15 min，重復2次，收集細菌沉淀，以細菌DNA提取試劑盒（Axygen）提取DNA。

1.2.3應用PCR法檢測基因（1）PCR反應體系。氨基糖苷類修飾酶基因的檢測：擴增aac（3′）-Ⅰ，aac（3′）-Ⅱ，aac（6′）-Ⅰb，aac（6′）-Ⅱ，ant（2′′）-Ⅰ及ant（3′′）-Ⅰ6個基因。引物序列及擴增產(chǎn)物長度見表1。PCR擴增反應體系為：Dream Tap Green PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物（濃度為10 pmol/L）各1.0 μL、DNA模板5 μL以及雙蒸水7.5 μL，總體積為27 μL。PCR反應條件：94℃5 min，然后94℃40 s、58℃40 s、72℃40 s，33個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。（2）PCR產(chǎn)物鑒定。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴酚藍染色后將膠塊置于紫外凝膠成像儀（法國VILBER LOURMAT公司）中觀察，照相保存并記錄結果，出現(xiàn)與陽性對照片段大小相同的條帶即為陽性。對于陽性條帶，隨機抽樣進行DNA序列測定，驗證擴增片段的正確性。

Tab.1Primer sequences and PCR product length表1引物序列及擴增產(chǎn)物長度

1.3統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行處理。計數(shù)資料以%或例表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料進行正態(tài)分布檢驗，非正態(tài)分布計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗；正態(tài)分布計量資料以表示，組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準為0.05；并通過Bonferroni法將χ2及秩和檢驗的組間多重比較的檢驗水準調整為0.016 7。

2 結果

2.1DFI檢出的致病菌分布特點209例DFI患者中G+菌、G-菌及真菌的檢出率分別為51.67%（108/ 209）、41.15%（86/209）、7.18%（15/209）。PA的總檢出率為19.62%（41/209），G-菌中以PA居首位（47.67%，41/86），見表2。

Tab.2Profile of bacteria pathogens isolated from DFI patients表2 DFI患者致病菌分布

2.2患者基本情況見表3。209例致病菌檢出患者（除15例真菌外）分為G-組（86例）和G+組（108例），前者又進一步分為PA組（41例）和非PA組（45例）。PA組與非PA組及G+組相比，患者的糖基化血紅蛋白（HbA1c）水平、血白細胞計數(shù)、中性粒細胞比值等均無明顯差異；但PA組患者年齡，潰瘍面積≥4 cm2的比例均明顯大于非PA組和G+組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PA組與G+組相比，超敏C-反應蛋白（hs-CRP）增高，血紅蛋白水平降低，患者臨床特點及潰瘍深度評分（SAD評分）增高，缺血性潰瘍、骨髓炎比例均明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3DFI中PA的氨基糖苷類修飾酶基因的檢出

2.3.1DFI中PA對AmAn的耐藥情況及耐藥修飾酶基因檢測結果PA對AmAn的總耐藥率高達73.17%（30/41）；對慶大霉素及阿米卡星的耐藥率分別為65.85%（27/41）和17.07%（7/41）。共有38株PA檢出耐藥基因，以ant（3′′）-Ⅰ及aac（3′）-Ⅱ檢出率較高，分別為65.85%（27/41）和63.41%（26/41），未檢出aac（3′）-Ⅰ。見表4、圖1。

2.3.2氨基糖苷類修飾酶基因分型與其耐藥表型的關系41株PA中有1株無修飾酶檢出且對慶大霉素及阿米卡星均敏感，2株無修飾酶基因檢出但對慶大霉素耐藥。10株有修飾酶基因檢出但對慶大霉素及阿米卡星均敏感，見表4。

Tab.3The basic data of DFI patients表3 DFI患者基本情況

Tab.4Aminoglycoside modifying enzyme genes detection and the relationship with the resistance phenotypes表4 氨基糖苷類修飾酶基因檢測情況及其與耐藥表型的關系

3 討論

糖尿病足潰瘍細菌感染中的PA感染是導致足潰瘍發(fā)生截肢的一個重要原因［5］，PA感染也是導致下肢非創(chuàng)性截肢的重要原因。印度的最新資料顯示PA感染在所有糖尿病足潰瘍致病菌感染中占35%，土耳其一項研究顯示為13%～15%［6-7］。本研究中PA的總檢出率為19.62%，在足潰瘍中發(fā)生率較高，與其他國家檢測結果相比處于中間位置；PA檢出率在G-感染中居首位，與筆者前期研究結果一致［8］。這可能與本院患者臨床特點有關，如高齡、局部損傷嚴重（潰瘍面積大、SAD評分較高及伴發(fā)骨髓炎）、缺血性潰瘍伴發(fā)率較高及hs-CRP顯著增高等，均為PA的生長創(chuàng)造了較有利的條件，但具體機制有待進一步研究。

Fig.1The expression of resistance gene mRNA in PA strains detected by gel electrophoresis圖1 凝膠電泳檢測PA耐藥基因mRNA的表達

本研究中顯示PA對AmAn的總耐藥率高達73.17%，對慶大霉素及阿米卡星的耐藥率也分別達到了65.86%和17.07%，與國內外相關報道有所不同［9-10］。原因可能是在使用AmAn治療PA感染時，后者會產(chǎn)生較復雜的耐藥機制，進而對此類抗生素不敏感，甚至產(chǎn)生耐藥。其中由PA質?；蛉旧|編碼表達的修飾酶可導致AmAn失活，此耐藥機制最為常見。在本研究中，6種常見修飾酶基因型的檢測結果顯示，以ant（3″）-Ⅰ（65.85%）和aac（3′）-Ⅱ（63.41%）為主。Vakulenko等［11］報道aac（6′）-Ⅰ為最常檢出的修飾酶基因，檢出率大于70%；Aghazadeh等［12］報道aph（3′）-Ⅵa（90.6%）及aph（3′）-Ⅱb（61.8%）的檢出率較高。以上結果的不同可能是AmAn在不同國家、不同地區(qū)的使用劑型、劑量、療程等方面的差異及Ⅰ型整合子在不同地區(qū)流行的差異所致［13］。此外，本研究中診治的患者年齡偏高、伴發(fā)癥較多、潰瘍較嚴重等，這些因素的差異可能促使PA中不同的耐藥基因由靜默態(tài)轉為激活態(tài)而產(chǎn)生耐藥。特別值得注意的是，本研究顯示有10株PA對慶大霉素及阿米卡星均敏感，但均有耐藥修飾酶基因檢出。其原因可能是產(chǎn)生此酶的細菌不一定都高度耐藥，有時經(jīng)酶修飾后的抗生素只是部分失活，但仍具有相當?shù)目咕钚?；或者由于細菌攝取和轉運抗生素的速度遠遠超過藥物被酶修飾的速度，因此仍有較多藥物進入菌體發(fā)揮抗菌作用。

有研究曾報道過一種NDM-1耐藥基因［14］，該基因極易導致細菌對絕大多數(shù)抗生素產(chǎn)生耐藥。本研究所檢測的PA是否也因攜帶此基因而造成了嚴重的耐藥現(xiàn)象尚不明確，需要進行更精細的基因測序。且出于對安全性及經(jīng)濟性問題的考慮，本院在治療DFI時所選用的AmAn種類偏少，所檢測的PA耐藥率與選用多種此類抗生素治療時所檢測的耐藥率相比有一定的差異，需要拓寬這類抗生素藥敏檢測的范圍，得到更精確的數(shù)據(jù)，從而更好地指導臨床用藥。

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（2014-11-13收稿 2015-01-21修回）

（本文編輯 李國琪）

Study on aminoglycoside antibiotics resistance of Pseudomonas aeruginosa isolated from diabetic foot infections

WU Hongfang1，SUN Qian2，LI Yuzhu1，ZHANG Min1，MENG Lingling1，LI Daiqing1△
1 Key Lab of Hormones&Development，Ministry of Health，Metabolic Diseases Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Endocrine Department of CNPC Central Hospital，Langfang of Hebei Province△

ObjectiveTo investigate the clinical features，phenotypes and genotypes of Pseudomonas aeruginosa（PA）strains isolated from patients with diabetic foot infection（DFI）resisting to aminoglycosides antibiotics（AmAn）.Methods The clinical profiles of 209 DFI patients hospitalized in the Tianjin Metabolic Diseases Hospital were collected and ana?lyzed.Forty-one PA strains were identified，and their antibiotic resistance profiles were obtained.The DNAs of PA isolates were extracted and applied to amplifications for several aminoglycosides modifying enzyme genes，including aac（3′）-Ⅰ，aac（3′）-Ⅱ，aac（6′）-Ⅰb，aac（6′）-Ⅱ，ant（2′′）-Ⅰand ant（3′′）-Ⅰby PCR method.Combining with the clinical features and the antibiotic resistance profiles，the relationship between genotypes and phenotypes of the PA strains was analyzed.Results Gram positive bacteria（G+）were the majority of the pathogen with 51.67%detection rate.The total detection rate of PA was 19.62%，listed as the top one pathogenic bacterium among gram negative bacteria（47.67%）.There was significant difference in the ratio of ulcer area≥4 cm2between PA group and non-PA group and G+group.There were significantly higher inci?dence rate of ischemic ulcer and osteomyelitis in PA group than those of G+group.There were higher clinical characteristics and ulcer depth（SAD）score，and increased hypersensitive C-reactive protein in PA group than those of G+group.There were 30 strains of PA being resistant to AmAn（73.17%）.The predominant drug resistance gene to AmAn was ant（3′′）-Ⅰ（65.85%），and aac（3′）-Ⅰgene was not found from all PA isolates.ConclusionThe detection rate of PA isolated from DFI patients was higher，and patients were with the characteristics of larger，deeper and severe ischemia of ulcer area.The phe?nomenon of PA resistant to AmAn was more serious，and ant（3′′）-Ⅰgene identified from PA isolates was the most common resistance gene identified to AmAn.

diabetic foot；pseudomonas aeruginosa；aminoglycosides；microbial sensitivity tests；DNA restriction-modi?fication enzymes

R587.2

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.019

1天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院、衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點實驗室（郵編300070）；2河北省廊坊市，中國石油中心醫(yī)院內分泌科

烏洪芳（1989），女，碩士研究生，主要從事內分泌與糖尿病學方面研究

△通訊作者E-mail:daiqingli68@126.com