唐亮，馮世慶，高瑞霄

不同時(shí)期移植人臍血CD34+細(xì)胞對(duì)大鼠脊髓損傷修復(fù)的對(duì)比研究

唐亮1，2，馮世慶1△，高瑞霄2

目的研究不同時(shí)期移植人臍血CD34+細(xì)胞修復(fù)大鼠脊髓損傷的效果和機(jī)制。方法免疫磁珠法從人新鮮臍血中分離得到CD34+細(xì)胞。雌性Wistar大鼠96只，以IMPACTOR MODEL-Ⅱ脊髓損傷打擊器建立T10脊髓損傷模型，隨機(jī)均分為免疫抑制劑應(yīng)用組、損傷后急性期移植組和損傷后亞急性期移植組，對(duì)各組后肢功能恢復(fù)情況進(jìn)行BBB評(píng)分，損傷中心行雙重免疫熒光染色、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色和血管明膠墨汁灌注觀察。結(jié)果損傷后第8～56天，細(xì)胞急性期移植組的BBB評(píng)分高于其余2組（P＜0.05）；TTC染色示組織活力降低區(qū)域比例小于其余2組（P＜0.01）；明膠墨汁灌注示脊髓損傷中心血管密度大于其余2組（P＜0.01）；亞急性期移植組的細(xì)胞存活密度大于急性期移植組（個(gè)/視野：7.51±1.00 vs 5.51±0.89，t=6.051，P＜0.01），2組均未觀察到移植細(xì)胞的神經(jīng)分化。結(jié)論人臍血CD34+細(xì)胞急性期移植可通過(guò)提高脊髓損傷中心血管密度促進(jìn)微循環(huán)恢復(fù)，增加組織活力，促進(jìn)大鼠脊髓損傷后肢體功能恢復(fù)。

脊髓損傷；臍血干細(xì)胞移植；人臍血CD34+細(xì)胞；組織活力；血管密度；神經(jīng)分化

產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的人臍血造血干細(xì)胞已于實(shí)驗(yàn)研究中證明對(duì)脊髓損傷（spinal cord inju?ry，SCI）有修復(fù)功能［1-2］。分離、純化人臍血得到的CD34+細(xì)胞即人臍血造血干細(xì)胞，其免疫原性較低，急慢性移植抗宿主反應(yīng)概率和程度均較骨髓移植低，并且較骨髓增殖、分化能力強(qiáng)［3］，長(zhǎng)年凍存影響不大［4］，成瘤性較胚胎干細(xì)胞低，倫理學(xué)爭(zhēng)議少，但是人臍血CD34+細(xì)胞移植修復(fù)SCI的時(shí)機(jī)、途徑和其修復(fù)SCI的機(jī)制尚未得到深入研究。本實(shí)驗(yàn)擬將人臍血CD34+細(xì)胞分別在SCI后急性期和亞急性期局部移植入大鼠脊髓T10損傷中心，通過(guò)比較不同時(shí)期BBB（Basso，Beattie and Bresnahan）評(píng)分及病理改變情況，研究人臍血CD34+細(xì)胞移植修復(fù)SCI的機(jī)制及其在損傷局部的存活和神經(jīng)分化情況。

1 材料與方法

1.1主要試劑小鼠抗人細(xì)胞核單克隆抗體（MAB1281，CHEMICON，USA），兔抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），兔抗人髓鞘堿性蛋白（MBP）多克隆抗體、兔抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）多克隆抗體、TRITC-山羊抗小鼠IgG和FITC-山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），DAPI（北京泛博生物化學(xué)公司），環(huán)孢霉素A（CsA，杭州中美華東制藥有限公司），地塞米松（Dex，天津金耀氨基酸有限公司），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，北京索萊寶科技有限公司）。

1.2動(dòng)物分組和模型制備雌性Wistar大鼠96只（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院四所），10周齡，體質(zhì)量（250±20）g，用隨機(jī)數(shù)字表法均分成3組：Ⅰ組（免疫抑制劑應(yīng)用組），CsA+Dex治療；Ⅱ組（損傷后急性期移植組），損傷后第1天細(xì)胞局部移植+CsA+ Dex治療；Ⅲ組（損傷后亞急性期移植組），損傷后第6天細(xì)胞局部移植+CsA+Dex治療。模型制備：大鼠麻醉后，以脊柱T10節(jié)段為中心，切開暴露T9～T11節(jié)段，咬除棘突、椎板，顯露硬膜，置于IMPACTOR MODEL-Ⅱ脊髓損傷打擊器下，參數(shù)10 g×25 mm打擊T10節(jié)段，雙后肢抽動(dòng)、甩尾，隨后完全松弛，關(guān)閉切口。

1.3細(xì)胞移植免疫磁珠分選法從人新鮮臍血中分選CD34+細(xì)胞（純度達(dá)90%以上），離心后用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，計(jì)數(shù)大于1×105/μL。按1.2中的方法暴露Ⅱ組和Ⅲ組大鼠脊髓，于損傷中心頭、尾側(cè)間隔4～5 mm取2點(diǎn)，用微量注射器傾斜45°向損傷中心注入2.5 μL細(xì)胞懸液，止血關(guān)閉切口。

1.4免疫抑制劑使用Ⅰ組和Ⅱ組于損傷當(dāng)天、損傷后第1、3、5天，Ⅲ組于損傷后第6、7、9、11天灌胃，分別給予CsA 2.5、5.0、5.0、10.0 mg；Ⅰ組和Ⅱ組于損傷后第1、3、5天，Ⅲ組于損傷后第7、9、11天尾靜脈注入Dex 0.125 mg。

1.5BBB評(píng)分損傷當(dāng)天、損傷后第8、14、21、28、35、42、49、56天，由未知分組的經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的2名人員對(duì)3組的各8只大鼠后肢功能恢復(fù)情況進(jìn)行BBB評(píng)分。

1.6損傷中心雙重免疫熒光染色每組選8只大鼠，于損傷后第21天麻醉后開胸，游離心臟，灌注針頭刺入左心室至主動(dòng)脈，剪開右心耳，PBS、4%多聚甲醛依次灌注后取出脊髓，4%多聚甲醛4℃保存。損傷中心間隔50 μm做5 μm厚冰凍橫切片6張。一抗MAB1281（1∶20）和兔抗人NSE（1∶400）［或兔抗人MBP（1∶200）或兔抗人GFAP（1∶200）］混合染色（每種染色組合2張片子），4℃濕盒過(guò)夜；二抗TRITC-山羊抗小鼠IgG（1∶1 600）和FITC-山羊抗兔IgG（1∶800）混合染色，37℃孵育1 h后DAPI染色，封片。另行人臍血CD34+細(xì)胞懸液染色和PBS替代一抗的損傷中心橫切片染色。倒置熒光顯微鏡下分別以550、490和360 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光觀察TRITC、FITC和DAPI染色，每張切片近中心位置讀取任意3個(gè)400倍視野，數(shù)碼照相記錄后計(jì)數(shù)各組大鼠染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)。

1.7損傷中心TTC染色Ⅰ組和Ⅱ組于損傷后第3天，Ⅲ組于損傷后第9天，每組選8只大鼠行心臟穿刺同前，4℃PBS灌注后距脊髓損傷中心上、下各約2 cm處迅速離斷取出脊髓，橫斷損傷中心，2%TTC中37℃避光孵育30 min，4%多聚甲醛4℃固定，手術(shù)顯微鏡（LEICA M501，德國(guó)）下觀察損傷中心橫斷面，數(shù)碼照相記錄后計(jì)算組織活力降低區(qū)域占整個(gè)橫斷面的比例。

1.8血管明膠墨汁灌注損傷后第14天，每組選8只大鼠行心臟穿刺同前，60℃條件下PBS、4%多聚甲醛、明膠墨汁（明膠，New Industry，Canada；墨汁，北京一得閣墨汁）依次灌注后迅速將大鼠置入冰水混合物中，距損傷中心上、下各約2 cm處離斷取出脊髓，4%多聚甲醛4℃固定。損傷中心間隔50 μm做5 μm厚冰凍橫切片3張，HE染色。顯微鏡下觀察，損傷區(qū)域腹側(cè)、背側(cè)各取3個(gè)200倍視野，數(shù)碼照相記錄后計(jì)算血管面積占整個(gè)視野面積的比例作為血管密度。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件采集圖像并分析；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 11.5軟件，使用表示，各組BBB評(píng)分、TTC染色、脊髓血管明膠墨汁灌注所得數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，對(duì)損傷中心雙重免疫熒光染色所得數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1BBB評(píng)分術(shù)前動(dòng)物毛色潔白有光澤，行動(dòng)敏捷，對(duì)外界反應(yīng)靈敏。手術(shù)前BBB評(píng)分雙后肢均為21分。損傷后當(dāng)天，各組大鼠蘇醒后均出現(xiàn)雙側(cè)后肢癱瘓，BBB評(píng)分0分。損傷后第8～56天，各組大鼠BBB評(píng)分均呈上升趨勢(shì)，Ⅱ組評(píng)分明顯高于其余2組（P＜0.05），見表1。

2.2損傷中心雙重免疫熒光染色結(jié)果各組中均未見到TRITC、FITC和DAPI三陽(yáng)性細(xì)胞，Ⅱ組和Ⅲ組可見到TRITC和DAPI雙陽(yáng)性細(xì)胞（存活移植細(xì)胞），見圖1。Ⅲ組存活移植細(xì)胞密度明顯大于Ⅱ組（個(gè)/視野：7.51±1.00 vs 5.51±0.89，t=6.051，P＜0.01）。

Tab.1Comparison of BBB locomotor score after spinal injury between three groups表1 脊髓損傷后各組BBB評(píng)分比較（n=8）

Tab.1Comparison of BBB locomotor score after spinal injury between three groups表1 脊髓損傷后各組BBB評(píng)分比較（n=8）

＊＊P＜0.01；a與Ⅱ組比較，P＜0.05

組別Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組F 56 d 11.13±0.35a 12.13±0.44 11.69±0.37a 13.117＊＊8 d 4.13±0.35a 5.75±0.46 4.44±0.32a 40.374＊＊14 d 8.25±0.53a 9.38±0.64 8.38±0.35a 11.109＊＊21 d 9.00±0.38a 10.44±0.42 9.81±0.46a 23.669＊＊28 d 10.19±0.37a 11.13±0.52 10.38±0.44a 9.800＊＊35 d 10.69±0.26a 11.75±0.27 10.75±0.27a 40.660＊＊42 d 10.94±0.32a 12.19±0.37 11.13±0.35a 29.793＊＊49 d 11.06±0.42a 12.13±0.44 11.56±0.42a 12.451＊＊

2.3損傷中心TTC染色結(jié)果脊髓橫斷面組織活力正常部分色紅潤(rùn)、表面平整，灰質(zhì)色較深，活力降低部分色灰暗，組織水腫表面微凸起，見圖2。Ⅱ組組織活力降低區(qū)域比例明顯小于其余2組（P＜0.01），見表2。

Tab.2The proportion of decreased vitality area and the blood vessel density in three groups表2 各組組織活力降低區(qū)域比例和損傷中心血管密度（n=8

Tab.2The proportion of decreased vitality area and the blood vessel density in three groups表2 各組組織活力降低區(qū)域比例和損傷中心血管密度（n=8

＊＊P＜0.01；a與Ⅱ組比較，P＜0.01

組別Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組F脊髓損傷中心血管密度（×10-3）7.283±0.524a 10.995±0.663 8.470±0.692a 72.279＊＊組織活力降低區(qū)域比例0.50±0.04a 0.31±0.03 0.45±0.04a 54.665＊＊

2.4脊髓血管明膠墨汁灌注正常脊髓T10節(jié)段多顯示血管橫截面，灰質(zhì)較白質(zhì)密集；損傷脊髓T10節(jié)段顯示損傷中心血管，見圖3。Ⅱ組脊髓損傷中心血管密度明顯大于其余2組（P＜0.01），見表2。

3 討論

3.1修復(fù)機(jī)制細(xì)胞移植治療SCI的機(jī)制包括代替壞死或凋亡的神經(jīng)細(xì)胞和改善損傷局部微環(huán)境促進(jìn)軸突再生或保護(hù)神經(jīng)。本實(shí)驗(yàn)中未觀察到移植后人臍血CD34+細(xì)胞的神經(jīng)分化，結(jié)果與Nishio等［2］和Taguchi等［5］的研究結(jié)果一致，這3個(gè)實(shí)驗(yàn)中CD34+細(xì)胞的純度都達(dá)到了90%以上，可以減少CD34-細(xì)胞中具有神經(jīng)細(xì)胞分化潛力的細(xì)胞，如臍血間充質(zhì)干細(xì)胞［6］的干擾。但是，Sigurjonsson等［7］研究發(fā)現(xiàn)人骨髓來(lái)源的CD34+細(xì)胞在雞胚脊髓環(huán)境中可表達(dá)神經(jīng)元特異性抗原微管相關(guān)蛋白2和神經(jīng)元特異性核抗原，提示移植細(xì)胞向神經(jīng)元的分化；Reali等［8］在少突膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的人骨髓CD34+細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)神經(jīng)分化，且向各種神經(jīng)細(xì)胞分化的比例受接觸界面的影響，可見，CD34+細(xì)胞的神經(jīng)分化受其來(lái)源和培養(yǎng)環(huán)境的影響。CD34是造血干細(xì)胞分化成熟到一定時(shí)期共有的抗原標(biāo)志，又以CD38、 HLA-DR等抗原標(biāo)志分成具有不同增殖分化能力的細(xì)胞亞群，提示以CD34為單一抗原標(biāo)志分選造血干細(xì)胞，不能有效分離不同特性的細(xì)胞。對(duì)人臍血CD34+細(xì)胞的神經(jīng)分化還需進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)尚不能排除神經(jīng)替代機(jī)制。

TTC可和活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，生成紅色的甲臜，用來(lái)表示細(xì)胞活力，反映組織血運(yùn)供氧情況。Kao等［1］制作SD大鼠脊髓T8或T9的壓迫損傷模型后立即尾靜脈注入人臍血CD34+細(xì)胞，損傷中心TTC染色結(jié)果顯示人臍血CD34+細(xì)胞移植組的組織活力降低區(qū)域隨時(shí)間變化顯著減小，且明顯小于人臍血CD34-細(xì)胞移植組、單純椎板打開組和生理鹽水注射組。本實(shí)驗(yàn)TTC染色表明人臍血CD34+細(xì)胞在SCI后急性期和亞急性期移植均可顯著促進(jìn)損傷中心組織活力恢復(fù)，且急性期較亞急性期移植效果明顯。

血管明膠墨汁灌注可以對(duì)血管進(jìn)行有效鑄型，血管形態(tài)保持較好［9］。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用濃度為10%的明膠不僅灌注充分，而且明膠韌性較好，不易斷裂，血管鑄型完整。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示人臍血CD34+細(xì)胞移植可以顯著提高損傷中心血管密度，且急性期移植較亞急性期移植效果明顯。

SCI機(jī)制中，原發(fā)、繼發(fā)損傷都會(huì)影響組織活力，本實(shí)驗(yàn)中，組織活力的恢復(fù)、損傷中心血管密度的增大和后肢功能的改善具有一致性，支持人臍血CD34+細(xì)胞移植修復(fù)SCI的血管修復(fù)機(jī)制。大量研究表明人臍血CD34+細(xì)胞移植修復(fù)SCI可能主要通過(guò)增強(qiáng)損傷中心血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)從而提高損傷中心血管密度，促進(jìn)微循環(huán)恢復(fù)及內(nèi)源性神經(jīng)干/祖細(xì)胞（NSC/NPCs）的增生、遷移和神經(jīng)元分化［10-11］。另外，人臍血CD34+細(xì)胞還可能通過(guò)分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）-1等促進(jìn)新生血管形成［11］。臍血CD34+細(xì)胞含有內(nèi)皮祖細(xì)胞CD34+/Flk-1+細(xì)胞［5］，在缺氧條件下VEGF表達(dá)可誘導(dǎo)其向內(nèi)皮細(xì)胞分化和增生，結(jié)構(gòu)性參與生成缺血組織的新生血管，從而促進(jìn)微循環(huán)恢復(fù)。

3.2移植時(shí)機(jī)SCI后的血液動(dòng)力學(xué)變化在24 h內(nèi)即可基本恢復(fù)正常［12］，急性炎癥反應(yīng)在72 h內(nèi)達(dá)到高峰，此后逐漸緩解，慢性炎癥反應(yīng)開始成為損傷后炎癥反應(yīng)的主要特征，這些變化特點(diǎn)影響移植細(xì)胞的成活分化。橫斷的脊髓由于損傷的溶酶體、組織水腫和一些毒性物質(zhì)的釋放可引起脊髓殘端變性、壞死和空洞形成，這一過(guò)程要維持1周左右。在損傷后1周內(nèi)移植物可能出現(xiàn)退變甚至壞死，損傷后較長(zhǎng)時(shí)間移植，神經(jīng)纖維很難再生通過(guò)膠質(zhì)瘢痕，而在損傷后1周左右移植可以阻止膠質(zhì)瘢痕生成，利于移植物的生長(zhǎng)［13］。研究發(fā)現(xiàn)大腦缺血損傷后第3天損傷中心血管內(nèi)皮增生最明顯，第7天已經(jīng)減弱，2周時(shí)接近損傷前水平［5］。毛星剛等［14］通過(guò)單寧酸-氯化鐵灌注結(jié)合形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)法觀察大鼠正常脊髓和脊髓擠壓損傷后不同時(shí)間的血管形態(tài)變化及其與星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系，認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞一方面可形成膠質(zhì)瘢痕而成為神經(jīng)纖維再生的障礙，同時(shí)對(duì)損傷后血管結(jié)構(gòu)的恢復(fù)起到重要作用，而星形膠質(zhì)細(xì)胞與血管廣泛關(guān)聯(lián)的建立也預(yù)示著血脊髓屏障功能的逐漸恢復(fù)，SCI后72 h內(nèi)可能是治療SCI后損傷區(qū)組織缺血的時(shí)間窗。Patel等［15］應(yīng)用動(dòng)態(tài)對(duì)比度增強(qiáng)磁共振成像觀察到大鼠SCI后，損傷局部VEGF緩釋法對(duì)血脊髓屏障通透性的提高及對(duì)后肢功能的改善，且Ritz等［16］利用定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)VEGF在大鼠SCI后局部的持續(xù)低表達(dá)，尤以SCI后第3天明顯；Taguchi等［5］實(shí)驗(yàn)證明損傷后48 h內(nèi)移植人臍血CD34+細(xì)胞可促進(jìn)缺血區(qū)域血管新生，保護(hù)殘留組織，獲得功能恢復(fù)。以上實(shí)驗(yàn)均提示急性期臍血CD34+細(xì)胞移植治療SCI的潛力。

3.3問(wèn)題與展望本實(shí)驗(yàn)表明SCI后急性期人臍血CD34+細(xì)胞局部移植可通過(guò)提高脊髓損傷中心血管密度促進(jìn)微循環(huán)恢復(fù)，增強(qiáng)組織活力，促進(jìn)大鼠SCI后肢體功能恢復(fù)，但缺少對(duì)人臍血CD34+細(xì)胞移植后促進(jìn)血管新生的相關(guān)因素、因子的深入研究?？傊瑢?duì)已用于臨床治療并且其獲取、儲(chǔ)存已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化的人臍血CD34+細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性修復(fù)脊髓損傷的研究，支持其急性期移植的有效性，具有深入研究的價(jià)值和很好的臨床應(yīng)用前景。

（圖1～3見插頁(yè)）

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（2014-12-12收稿 2015-02-12修回）

（本文編輯 閆娟）

Experimental study on repairing spinal cord injury by human umbilical cord blood CD34+cell transplantation at different time points

TANG Liang1，2，F(xiàn)ENG Shiqing1△，GAO Ruixiao2
1 Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China；2 Department of Orthopaedics，Tianjin Haihe Hospital△

ObjectiveTo investigate the effect of transplantation of human umbilical cord blood CD34+cells on spinal cord injury.MethodsCD34+cells were separated from fresh human umbilical cord blood by magnetic cell sorting.Ninetysix female Wistar rats were injured at T10 by IMPACTOR MODEL-Ⅱ，and then randomly assigned to three groups:Cyclo?sporin A（CsA）+Dexamethasone（Dex）treated group（Ⅰ，n=32），local transplantation of cells+CsA+Dex treated group（Ⅱ）at the first day after operation（DAO 1，n=32），local transplantation of cells+CsA+Dex treated group（Ⅲ）at DAO 6（n=32）. BBB locomotor scoring system was used to assess the recovery of the lower limbs.The survival and neural differentiation of transplanted cells at the injury site were observed by double immunofluorescence.The tissue vitality at the injury site was ob?served by 2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride（TTC）staining，and the blood vessel density was observed by infusing mixture of Chinese ink and glutin followed by HE staining.ResultsBBB score at DAO 8-56 was significantly higher inⅡgroup than that of other two groups（P＜0.05）.TTC staining showed that the proportion of decreased vitality area was signifi?cantly smaller inⅡgroup than that of other two groups（P＜0.01）.The result of gelatin ink perfusion showed that the blood vessel density at the injury site was significantly bigger inⅡgroup than that of other two groups（P＜0.01）.There were more survival transplanted cells inⅡgroup than those of III group（per visual field，7.51±1.00 vs 5.51±0.89，t=6.051，P＜0.01）. All the transplanted cells didn’t differentiate into neural cells.ConclusionHuman umbilical cord blood CD34+cells can promote the recovery of the lower limbs after spinal cord injury by repairing blood vessels to increase tissue vitality at the in?jury site in rats.

spinal cord injury；cord blood stem cell transplantation；human umbilical cord blood CD34+cells；tissue vitality；blood vessel density；neural differentiation

R681.5

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.013

天津市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科技計(jì)劃項(xiàng)目（08ZCKFSF03200）；教育部新世紀(jì)人才支持計(jì)劃（NCET-06-0251）

1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院（郵編300052）；2天津市海河醫(yī)院骨科

唐亮（1982），男，主治醫(yī)師，在職博士研究生在讀，主要從事脊柱脊髓損傷、脊柱退行性疾病、脊柱結(jié)核研究

△通訊作者E-mail:fengsq@hotmail.com