唐亮，馮世慶，高瑞霄

不同時期移植人臍血CD34+細胞對大鼠脊髓損傷修復的對比研究

唐亮1，2，馮世慶1△，高瑞霄2

目的研究不同時期移植人臍血CD34+細胞修復大鼠脊髓損傷的效果和機制。方法免疫磁珠法從人新鮮臍血中分離得到CD34+細胞。雌性Wistar大鼠96只，以IMPACTOR MODEL-Ⅱ脊髓損傷打擊器建立T10脊髓損傷模型，隨機均分為免疫抑制劑應用組、損傷后急性期移植組和損傷后亞急性期移植組，對各組后肢功能恢復情況進行BBB評分，損傷中心行雙重免疫熒光染色、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色和血管明膠墨汁灌注觀察。結果損傷后第8～56天，細胞急性期移植組的BBB評分高于其余2組（P＜0.05）；TTC染色示組織活力降低區(qū)域比例小于其余2組（P＜0.01）；明膠墨汁灌注示脊髓損傷中心血管密度大于其余2組（P＜0.01）；亞急性期移植組的細胞存活密度大于急性期移植組（個/視野：7.51±1.00 vs 5.51±0.89，t=6.051，P＜0.01），2組均未觀察到移植細胞的神經分化。結論人臍血CD34+細胞急性期移植可通過提高脊髓損傷中心血管密度促進微循環(huán)恢復，增加組織活力，促進大鼠脊髓損傷后肢體功能恢復。

脊髓損傷；臍血干細胞移植；人臍血CD34+細胞；組織活力；血管密度；神經分化

產業(yè)化、規(guī)?；藴驶a的人臍血造血干細胞已于實驗研究中證明對脊髓損傷（spinal cord inju?ry，SCI）有修復功能［1-2］。分離、純化人臍血得到的CD34+細胞即人臍血造血干細胞，其免疫原性較低，急慢性移植抗宿主反應概率和程度均較骨髓移植低，并且較骨髓增殖、分化能力強［3］，長年凍存影響不大［4］，成瘤性較胚胎干細胞低，倫理學爭議少，但是人臍血CD34+細胞移植修復SCI的時機、途徑和其修復SCI的機制尚未得到深入研究。本實驗擬將人臍血CD34+細胞分別在SCI后急性期和亞急性期局部移植入大鼠脊髓T10損傷中心，通過比較不同時期BBB（Basso，Beattie and Bresnahan）評分及病理改變情況，研究人臍血CD34+細胞移植修復SCI的機制及其在損傷局部的存活和神經分化情況。

1 材料與方法

1.1主要試劑小鼠抗人細胞核單克隆抗體（MAB1281，CHEMICON，USA），兔抗人神經元特異性烯醇化酶（NSE）多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），兔抗人髓鞘堿性蛋白（MBP）多克隆抗體、兔抗人膠質纖維酸性蛋白（GFAP）多克隆抗體、TRITC-山羊抗小鼠IgG和FITC-山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司），DAPI（北京泛博生物化學公司），環(huán)孢霉素A（CsA，杭州中美華東制藥有限公司），地塞米松（Dex，天津金耀氨基酸有限公司），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，北京索萊寶科技有限公司）。

1.2動物分組和模型制備雌性Wistar大鼠96只（軍事醫(yī)學科學院四所），10周齡，體質量（250±20）g，用隨機數(shù)字表法均分成3組：Ⅰ組（免疫抑制劑應用組），CsA+Dex治療；Ⅱ組（損傷后急性期移植組），損傷后第1天細胞局部移植+CsA+ Dex治療；Ⅲ組（損傷后亞急性期移植組），損傷后第6天細胞局部移植+CsA+Dex治療。模型制備：大鼠麻醉后，以脊柱T10節(jié)段為中心，切開暴露T9～T11節(jié)段，咬除棘突、椎板，顯露硬膜，置于IMPACTOR MODEL-Ⅱ脊髓損傷打擊器下，參數(shù)10 g×25 mm打擊T10節(jié)段，雙后肢抽動、甩尾，隨后完全松弛，關閉切口。

1.3細胞移植免疫磁珠分選法從人新鮮臍血中分選CD34+細胞（純度達90%以上），離心后用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，計數(shù)大于1×105/μL。按1.2中的方法暴露Ⅱ組和Ⅲ組大鼠脊髓，于損傷中心頭、尾側間隔4～5 mm取2點，用微量注射器傾斜45°向損傷中心注入2.5 μL細胞懸液，止血關閉切口。

1.4免疫抑制劑使用Ⅰ組和Ⅱ組于損傷當天、損傷后第1、3、5天，Ⅲ組于損傷后第6、7、9、11天灌胃，分別給予CsA 2.5、5.0、5.0、10.0 mg；Ⅰ組和Ⅱ組于損傷后第1、3、5天，Ⅲ組于損傷后第7、9、11天尾靜脈注入Dex 0.125 mg。

1.5BBB評分損傷當天、損傷后第8、14、21、28、35、42、49、56天，由未知分組的經過訓練的2名人員對3組的各8只大鼠后肢功能恢復情況進行BBB評分。

1.6損傷中心雙重免疫熒光染色每組選8只大鼠，于損傷后第21天麻醉后開胸，游離心臟，灌注針頭刺入左心室至主動脈，剪開右心耳，PBS、4%多聚甲醛依次灌注后取出脊髓，4%多聚甲醛4℃保存。損傷中心間隔50 μm做5 μm厚冰凍橫切片6張。一抗MAB1281（1∶20）和兔抗人NSE（1∶400）［或兔抗人MBP（1∶200）或兔抗人GFAP（1∶200）］混合染色（每種染色組合2張片子），4℃濕盒過夜；二抗TRITC-山羊抗小鼠IgG（1∶1 600）和FITC-山羊抗兔IgG（1∶800）混合染色，37℃孵育1 h后DAPI染色，封片。另行人臍血CD34+細胞懸液染色和PBS替代一抗的損傷中心橫切片染色。倒置熒光顯微鏡下分別以550、490和360 nm波長的激發(fā)光觀察TRITC、FITC和DAPI染色，每張切片近中心位置讀取任意3個400倍視野，數(shù)碼照相記錄后計數(shù)各組大鼠染色陽性的細胞數(shù)。

1.7損傷中心TTC染色Ⅰ組和Ⅱ組于損傷后第3天，Ⅲ組于損傷后第9天，每組選8只大鼠行心臟穿刺同前，4℃PBS灌注后距脊髓損傷中心上、下各約2 cm處迅速離斷取出脊髓，橫斷損傷中心，2%TTC中37℃避光孵育30 min，4%多聚甲醛4℃固定，手術顯微鏡（LEICA M501，德國）下觀察損傷中心橫斷面，數(shù)碼照相記錄后計算組織活力降低區(qū)域占整個橫斷面的比例。

1.8血管明膠墨汁灌注損傷后第14天，每組選8只大鼠行心臟穿刺同前，60℃條件下PBS、4%多聚甲醛、明膠墨汁（明膠，New Industry，Canada；墨汁，北京一得閣墨汁）依次灌注后迅速將大鼠置入冰水混合物中，距損傷中心上、下各約2 cm處離斷取出脊髓，4%多聚甲醛4℃固定。損傷中心間隔50 μm做5 μm厚冰凍橫切片3張，HE染色。顯微鏡下觀察，損傷區(qū)域腹側、背側各取3個200倍視野，數(shù)碼照相記錄后計算血管面積占整個視野面積的比例作為血管密度。

1.9統(tǒng)計學方法用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件采集圖像并分析；數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 11.5軟件，使用表示，各組BBB評分、TTC染色、脊髓血管明膠墨汁灌注所得數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，對損傷中心雙重免疫熒光染色所得數(shù)據(jù)比較采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1BBB評分術前動物毛色潔白有光澤，行動敏捷，對外界反應靈敏。手術前BBB評分雙后肢均為21分。損傷后當天，各組大鼠蘇醒后均出現(xiàn)雙側后肢癱瘓，BBB評分0分。損傷后第8～56天，各組大鼠BBB評分均呈上升趨勢，Ⅱ組評分明顯高于其余2組（P＜0.05），見表1。

2.2損傷中心雙重免疫熒光染色結果各組中均未見到TRITC、FITC和DAPI三陽性細胞，Ⅱ組和Ⅲ組可見到TRITC和DAPI雙陽性細胞（存活移植細胞），見圖1。Ⅲ組存活移植細胞密度明顯大于Ⅱ組（個/視野：7.51±1.00 vs 5.51±0.89，t=6.051，P＜0.01）。

Tab.1Comparison of BBB locomotor score after spinal injury between three groups表1 脊髓損傷后各組BBB評分比較（n=8）

Tab.1Comparison of BBB locomotor score after spinal injury between three groups表1 脊髓損傷后各組BBB評分比較（n=8）

＊＊P＜0.01；a與Ⅱ組比較，P＜0.05

組別Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組F 56 d 11.13±0.35a 12.13±0.44 11.69±0.37a 13.117＊＊8 d 4.13±0.35a 5.75±0.46 4.44±0.32a 40.374＊＊14 d 8.25±0.53a 9.38±0.64 8.38±0.35a 11.109＊＊21 d 9.00±0.38a 10.44±0.42 9.81±0.46a 23.669＊＊28 d 10.19±0.37a 11.13±0.52 10.38±0.44a 9.800＊＊35 d 10.69±0.26a 11.75±0.27 10.75±0.27a 40.660＊＊42 d 10.94±0.32a 12.19±0.37 11.13±0.35a 29.793＊＊49 d 11.06±0.42a 12.13±0.44 11.56±0.42a 12.451＊＊

2.3損傷中心TTC染色結果脊髓橫斷面組織活力正常部分色紅潤、表面平整，灰質色較深，活力降低部分色灰暗，組織水腫表面微凸起，見圖2。Ⅱ組組織活力降低區(qū)域比例明顯小于其余2組（P＜0.01），見表2。

Tab.2The proportion of decreased vitality area and the blood vessel density in three groups表2 各組組織活力降低區(qū)域比例和損傷中心血管密度（n=8

Tab.2The proportion of decreased vitality area and the blood vessel density in three groups表2 各組組織活力降低區(qū)域比例和損傷中心血管密度（n=8

＊＊P＜0.01；a與Ⅱ組比較，P＜0.01

組別Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組F脊髓損傷中心血管密度（×10-3）7.283±0.524a 10.995±0.663 8.470±0.692a 72.279＊＊組織活力降低區(qū)域比例0.50±0.04a 0.31±0.03 0.45±0.04a 54.665＊＊

2.4脊髓血管明膠墨汁灌注正常脊髓T10節(jié)段多顯示血管橫截面，灰質較白質密集；損傷脊髓T10節(jié)段顯示損傷中心血管，見圖3。Ⅱ組脊髓損傷中心血管密度明顯大于其余2組（P＜0.01），見表2。

3 討論

3.1修復機制細胞移植治療SCI的機制包括代替壞死或凋亡的神經細胞和改善損傷局部微環(huán)境促進軸突再生或保護神經。本實驗中未觀察到移植后人臍血CD34+細胞的神經分化，結果與Nishio等［2］和Taguchi等［5］的研究結果一致，這3個實驗中CD34+細胞的純度都達到了90%以上，可以減少CD34-細胞中具有神經細胞分化潛力的細胞，如臍血間充質干細胞［6］的干擾。但是，Sigurjonsson等［7］研究發(fā)現(xiàn)人骨髓來源的CD34+細胞在雞胚脊髓環(huán)境中可表達神經元特異性抗原微管相關蛋白2和神經元特異性核抗原，提示移植細胞向神經元的分化；Reali等［8］在少突膠質細胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的人骨髓CD34+細胞中也發(fā)現(xiàn)神經分化，且向各種神經細胞分化的比例受接觸界面的影響，可見，CD34+細胞的神經分化受其來源和培養(yǎng)環(huán)境的影響。CD34是造血干細胞分化成熟到一定時期共有的抗原標志，又以CD38、 HLA-DR等抗原標志分成具有不同增殖分化能力的細胞亞群，提示以CD34為單一抗原標志分選造血干細胞，不能有效分離不同特性的細胞。對人臍血CD34+細胞的神經分化還需進一步研究，本實驗尚不能排除神經替代機制。

TTC可和活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶反應，生成紅色的甲臜，用來表示細胞活力，反映組織血運供氧情況。Kao等［1］制作SD大鼠脊髓T8或T9的壓迫損傷模型后立即尾靜脈注入人臍血CD34+細胞，損傷中心TTC染色結果顯示人臍血CD34+細胞移植組的組織活力降低區(qū)域隨時間變化顯著減小，且明顯小于人臍血CD34-細胞移植組、單純椎板打開組和生理鹽水注射組。本實驗TTC染色表明人臍血CD34+細胞在SCI后急性期和亞急性期移植均可顯著促進損傷中心組織活力恢復，且急性期較亞急性期移植效果明顯。

血管明膠墨汁灌注可以對血管進行有效鑄型，血管形態(tài)保持較好［9］。本實驗中應用濃度為10%的明膠不僅灌注充分，而且明膠韌性較好，不易斷裂，血管鑄型完整。實驗結果顯示人臍血CD34+細胞移植可以顯著提高損傷中心血管密度，且急性期移植較亞急性期移植效果明顯。

SCI機制中，原發(fā)、繼發(fā)損傷都會影響組織活力，本實驗中，組織活力的恢復、損傷中心血管密度的增大和后肢功能的改善具有一致性，支持人臍血CD34+細胞移植修復SCI的血管修復機制。大量研究表明人臍血CD34+細胞移植修復SCI可能主要通過增強損傷中心血管內皮生長因子（VEGF）的表達從而提高損傷中心血管密度，促進微循環(huán)恢復及內源性神經干/祖細胞（NSC/NPCs）的增生、遷移和神經元分化［10-11］。另外，人臍血CD34+細胞還可能通過分泌肝細胞生長因子（HGF）、胰島素樣生長因子（IGF）-1等促進新生血管形成［11］。臍血CD34+細胞含有內皮祖細胞CD34+/Flk-1+細胞［5］，在缺氧條件下VEGF表達可誘導其向內皮細胞分化和增生，結構性參與生成缺血組織的新生血管，從而促進微循環(huán)恢復。

3.2移植時機SCI后的血液動力學變化在24 h內即可基本恢復正常［12］，急性炎癥反應在72 h內達到高峰，此后逐漸緩解，慢性炎癥反應開始成為損傷后炎癥反應的主要特征，這些變化特點影響移植細胞的成活分化。橫斷的脊髓由于損傷的溶酶體、組織水腫和一些毒性物質的釋放可引起脊髓殘端變性、壞死和空洞形成，這一過程要維持1周左右。在損傷后1周內移植物可能出現(xiàn)退變甚至壞死，損傷后較長時間移植，神經纖維很難再生通過膠質瘢痕，而在損傷后1周左右移植可以阻止膠質瘢痕生成，利于移植物的生長［13］。研究發(fā)現(xiàn)大腦缺血損傷后第3天損傷中心血管內皮增生最明顯，第7天已經減弱，2周時接近損傷前水平［5］。毛星剛等［14］通過單寧酸-氯化鐵灌注結合形態(tài)學和免疫組織化學法觀察大鼠正常脊髓和脊髓擠壓損傷后不同時間的血管形態(tài)變化及其與星形膠質細胞的關系，認為星形膠質細胞一方面可形成膠質瘢痕而成為神經纖維再生的障礙，同時對損傷后血管結構的恢復起到重要作用，而星形膠質細胞與血管廣泛關聯(lián)的建立也預示著血脊髓屏障功能的逐漸恢復，SCI后72 h內可能是治療SCI后損傷區(qū)組織缺血的時間窗。Patel等［15］應用動態(tài)對比度增強磁共振成像觀察到大鼠SCI后，損傷局部VEGF緩釋法對血脊髓屏障通透性的提高及對后肢功能的改善，且Ritz等［16］利用定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)VEGF在大鼠SCI后局部的持續(xù)低表達，尤以SCI后第3天明顯；Taguchi等［5］實驗證明損傷后48 h內移植人臍血CD34+細胞可促進缺血區(qū)域血管新生，保護殘留組織，獲得功能恢復。以上實驗均提示急性期臍血CD34+細胞移植治療SCI的潛力。

3.3問題與展望本實驗表明SCI后急性期人臍血CD34+細胞局部移植可通過提高脊髓損傷中心血管密度促進微循環(huán)恢復，增強組織活力，促進大鼠SCI后肢體功能恢復，但缺少對人臍血CD34+細胞移植后促進血管新生的相關因素、因子的深入研究?？傊?，對已用于臨床治療并且其獲取、儲存已經產業(yè)化、規(guī)?；?、標準化的人臍血CD34+細胞進行實驗性修復脊髓損傷的研究，支持其急性期移植的有效性，具有深入研究的價值和很好的臨床應用前景。

（圖1～3見插頁）

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（2014-12-12收稿 2015-02-12修回）

（本文編輯 閆娟）

Experimental study on repairing spinal cord injury by human umbilical cord blood CD34+cell transplantation at different time points

TANG Liang1，2，F(xiàn)ENG Shiqing1△，GAO Ruixiao2
1 Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China；2 Department of Orthopaedics，Tianjin Haihe Hospital△

ObjectiveTo investigate the effect of transplantation of human umbilical cord blood CD34+cells on spinal cord injury.MethodsCD34+cells were separated from fresh human umbilical cord blood by magnetic cell sorting.Ninetysix female Wistar rats were injured at T10 by IMPACTOR MODEL-Ⅱ，and then randomly assigned to three groups:Cyclo?sporin A（CsA）+Dexamethasone（Dex）treated group（Ⅰ，n=32），local transplantation of cells+CsA+Dex treated group（Ⅱ）at the first day after operation（DAO 1，n=32），local transplantation of cells+CsA+Dex treated group（Ⅲ）at DAO 6（n=32）. BBB locomotor scoring system was used to assess the recovery of the lower limbs.The survival and neural differentiation of transplanted cells at the injury site were observed by double immunofluorescence.The tissue vitality at the injury site was ob?served by 2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride（TTC）staining，and the blood vessel density was observed by infusing mixture of Chinese ink and glutin followed by HE staining.ResultsBBB score at DAO 8-56 was significantly higher inⅡgroup than that of other two groups（P＜0.05）.TTC staining showed that the proportion of decreased vitality area was signifi?cantly smaller inⅡgroup than that of other two groups（P＜0.01）.The result of gelatin ink perfusion showed that the blood vessel density at the injury site was significantly bigger inⅡgroup than that of other two groups（P＜0.01）.There were more survival transplanted cells inⅡgroup than those of III group（per visual field，7.51±1.00 vs 5.51±0.89，t=6.051，P＜0.01）. All the transplanted cells didn’t differentiate into neural cells.ConclusionHuman umbilical cord blood CD34+cells can promote the recovery of the lower limbs after spinal cord injury by repairing blood vessels to increase tissue vitality at the in?jury site in rats.

spinal cord injury；cord blood stem cell transplantation；human umbilical cord blood CD34+cells；tissue vitality；blood vessel density；neural differentiation

R681.5

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.013

天津市科學技術委員會科技計劃項目（08ZCKFSF03200）；教育部新世紀人才支持計劃（NCET-06-0251）

1天津醫(yī)科大學總醫(yī)院（郵編300052）；2天津市海河醫(yī)院骨科

唐亮（1982），男，主治醫(yī)師，在職博士研究生在讀，主要從事脊柱脊髓損傷、脊柱退行性疾病、脊柱結核研究

△通訊作者E-mail:fengsq@hotmail.com