潘麗莉，鄭璐，張俊，于洋，姚霜，喻妙梅，馮悅?cè)A，羅光華

雙重?zé)晒鈱?shí)時(shí)PCR法鑒定SRBⅠ基因敲除小鼠

潘麗莉，鄭璐，張俊，于洋，姚霜，喻妙梅，馮悅?cè)A，羅光華△

目的建立一種雙重?zé)晒鈱?shí)時(shí)PCR鑒定B族Ⅰ型清道夫受體（SRBⅠ）基因敲除小鼠的方法。方法提取小鼠尾尖DNA，應(yīng)用自行設(shè)計(jì)的鑒定野生型和敲除型SRBⅠ基因的引物和探針，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，在FAM通道及CY5通道判斷小鼠基因型。同時(shí)應(yīng)用基因測(cè)序技術(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分析該方法的靈敏度和重復(fù)性。結(jié)果僅在FAM通道出現(xiàn)典型S型擴(kuò)增曲線的為SRBⅠ基因野生型小鼠，僅在CY5通道出現(xiàn)典型S型擴(kuò)增曲線的為SRBⅠ基因敲除型小鼠，在兩個(gè)通道都出現(xiàn)典型S型擴(kuò)增曲線的為SRBⅠ基因雜合型小鼠。結(jié)果與DNA測(cè)序法吻合，檢測(cè)野生型和突變型的靈敏度均達(dá)4×101拷貝/μL。結(jié)論新方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，適用于分型SRBⅠ基因敲除小鼠。

抗原，CD36；清道夫受體BⅠ；雙重?zé)晒鈱?shí)時(shí)PCR；基因敲除

B族Ⅰ型清道夫受體（scavenger receptors class B type I，SRBⅠ）最早是在以乙?；兔芏戎鞍祝ˋcLDL）為配體克隆的清道夫受體家族（scavenger receptors，SR）中發(fā)現(xiàn)的［1］，是第一個(gè)在分子水平上得到證實(shí)的高密度脂蛋白（HDL）受體，屬于B亞族Ⅰ型。最近研究發(fā)現(xiàn)，它不僅參與膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)，有益于心血管系統(tǒng)，而且參與糖代謝、骨代謝、雌激素等的調(diào)節(jié)［2］，在這些疾病研究中常用SRBⅠ基因敲除小鼠作為動(dòng)物模型［3］，而該基因敲除動(dòng)物在用于研究前必須進(jìn)行基因型鑒定，傳統(tǒng)PCR-瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)且易污染，單重?zé)晒舛縋CR需要多管反應(yīng)體系，較為麻煩，因此建立一種簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確的新方法尤為必要。本研究通過(guò)應(yīng)用雙重?zé)晒釶CR技術(shù)建立一種新的同時(shí)鑒定SRBⅠ基因野生型和敲除型小鼠的方法，效果很好，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料SRBⅠ基因敲除小鼠由南京醫(yī)科大學(xué)饋贈(zèng)，品系為C57BL/6。Ezup柱式動(dòng)物基因組抽提試劑盒購(gòu)自上海生工公司，Taq熱啟動(dòng)酶、dNTP混合液、10×PCR緩沖液等購(gòu)自TaKaRa公司，Light Cycler熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche公司。

1.2DNA提取用溫水孵育小鼠尾巴2～3 min，采集尾尖5 mm，按Ezup柱式動(dòng)物基因組抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取基因組DNA，置于4℃保存。

1.3引物及探針的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中小鼠SRBⅠ基因序列及文獻(xiàn)［4］報(bào)道的SRBⅠ基因敲除和插入序列，用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)正、反義引物和探針，引物和探針均由上海生工公司合成和修飾，見(jiàn)表1。

Tab.1Primers and probes for wild and knockout SRBⅠgene mice表1 檢測(cè)SRBⅠ基因野生型和敲除型小鼠的引物和探針

1.4實(shí)時(shí)熒光PCR總反應(yīng)體系為25 μL，包括DNA模板2 μL，25 mmol/L的MgCl21 μL，5 U/μL Taq熱啟動(dòng)酶0.25 μL，100 μmol/L野生型及敲除型正、反義引物和探針均為0.1 μL，2.5 mmol/L dNTP混合物2 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性3 min； 98℃10 s，58℃10 s（溫度轉(zhuǎn)換率為4.4℃/s），共40個(gè)循環(huán)；40℃持續(xù)收集熒光數(shù)據(jù)。反應(yīng)在Light Cycler 480Ⅱ型熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

1.5質(zhì)粒載體構(gòu)建根據(jù)不同的基因型分別構(gòu)建野生型和敲除型的載體。擴(kuò)增產(chǎn)物片段送上海生工公司克隆并測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1結(jié)果判斷野生型小鼠在FAM通道出現(xiàn)明顯“S”型擴(kuò)增曲線，在CY5通道無(wú)擴(kuò)增；敲除型小鼠在CY5通道出現(xiàn)明顯“S”型擴(kuò)增曲線，在FAM通道無(wú)擴(kuò)增；在2個(gè)通道都出現(xiàn)典型S型擴(kuò)增曲線的為SRBⅠ基因雜合型小鼠，見(jiàn)圖1。

Fig.1The analysis of amplification curves圖1 擴(kuò)增曲線分析圖

2.2靈敏度分析分別選取野生型和敲除型載體作為模板，經(jīng)10倍連續(xù)稀釋（4×101～4×105），按上述條件進(jìn)行熒光定量RT-PCR。結(jié)果表明，該法對(duì)檢測(cè)SRBⅠ基因野生型和敲除型小鼠的靈敏度均為4×101拷貝/μL，見(jiàn)圖2。

Fig.2The analysis of sensitivity圖2 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

2.3準(zhǔn)確性分析選取野生型和敲除型樣本各1份進(jìn)行測(cè)序，并用BLAST比對(duì)，RT-PCR結(jié)果均與測(cè)序結(jié)果一致。野生型和敲除型的部分測(cè)序序列見(jiàn)圖3。

Fig.3The PCR product sequence of the wild and SRBⅠknockout mice圖3 SRBⅠ基因野生型和敲除型小鼠PCR產(chǎn)物測(cè)序圖

3 討論

隨著基因敲除技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用，已經(jīng)證實(shí)SRBⅠ不但在脂蛋白代謝和膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要作用，而且在一氧化氮代謝、丙肝病毒感染、正常紅細(xì)胞成熟和雌性生育等方面也顯示出較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用［5-6］。本研究旨在建立一種快速準(zhǔn)確的檢測(cè)野生型和SRBⅠ基因敲除型小鼠的方法，引物設(shè)計(jì)是整個(gè)方法建立的關(guān)鍵，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)出針對(duì)野生型和SRBⅠ基因敲除型高度特異的引物和探針，在以同一濃度陽(yáng)性核酸作為模板的反應(yīng)體系中，優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，根據(jù)最低Ct值選擇最佳引物和探針濃度，建立最優(yōu)化的反應(yīng)體系。本研究所用的2條探針，分別標(biāo)記的是FAM和CY5熒光基團(tuán)，在用LightCycler480Ⅱ型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可分別選擇FAM或CY5通道作為觀察結(jié)果的參數(shù)，即有較典型的“S”型擴(kuò)增曲線。該法靈敏度試驗(yàn)表明檢出限可達(dá)到4×101拷貝/μL，特異性也較高，無(wú)任何交叉反應(yīng)，與測(cè)序結(jié)果一致。

在進(jìn)行基因型鑒定時(shí)，單重?zé)晒舛縋CR需要多管反應(yīng)體系，較為麻煩。而PCR-凝膠電泳法耗時(shí)長(zhǎng)，易發(fā)生污染，且靈敏度和特異性較低，均較少使用［7-8］。本研究實(shí)現(xiàn)了單管同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分野生型和SRBⅠ基因敲除型小鼠，比普通PCR和單重?zé)晒釶CR更簡(jiǎn)便、快速，證明雙重?zé)晒釶CR引物擴(kuò)增互不干擾且有很高的擴(kuò)增效率。綜上所述，本研究成功建立了雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)SRBⅠ基因野生型和敲除型小鼠的方法，可以推廣使用。

［1］Fukasawa M，Adachi H，Hirota K，et al.SRB1，a class B scavenger receptor，recognizes both negatively charged liposomes and apoptot?ic cells［J］.Exp Cell Res，1996，222（1）:246-250.

［2］Martineau C，Kevorkova O，Brissette L，et al.Scavenger receptor class B，type I（Scarb1）deficiency promotes osteoblastogenesis but stunts terminal osteocyte differentiation［J］.Physiol Rep，2014，2（10）.pii:e12117.doi:10.14814/phy2.12117.

［3］Fuller M，Dadoo O，Serkis V，et al.The effects of diet on occlusive coronary artery atherosclerosis and myocardial infarction in scaven?ger receptor class B，type 1/low-density lipoprotein receptor double knockout mice［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2014，34（11）: 2394-2403.

［4］Rigotti A，Trigatti BL，Penman M，et al.A targeted mutation in the murine gene encoding the high density lipoprotein（HDL）receptor scavenger receptor class B type I reveals its key role in HDL metab?olism［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（23）:12610-12615.

［5］Danilo C，Gutierrez-Pajares JL，Mainieri MA，et al.Scavenger re?ceptor class B type I regulates cellular cholesterol metabolism and cell signaling associated with breast cancer development［J］.Breast Cancer Res，2013，15（5）:R87.

［6］Vercauteren K，Van Den Eede N，Mesalam AA，et al.Successful an?ti-scavenger receptor class B type I（SR-BI）monoclonal antibody therapy in humanized mice after challenge with HCV variants with in vitro resistance to SR-BI-targeting agents［J］.Hepatology，2014，60（5）:1508-1518.

［7］Cifuente JO，F(xiàn)errer MF，Jaquenod de Giusti C，et al.Molecular de?terminants of disease in coxsackievirus B1 murine infection［J］.J Med Virol，2011，83（9）:1571-1581.

［8］Nijhuis M，van Maarseveen N，Schuurman R，et al.Rapid and sensi?tive routine detection of all members of the genus enterovirus in dif?ferent clinical specimens by real-time PCR［J］.J Clin Microbiol，2002，40（10）:3666-3670.

（2015-02-02收稿 2015-02-26修回）

（本文編輯 閆娟）

Development of a duplex fluorescence RT-PCR assay for identifying SRBⅠgene knockout mice

PAN Lili，ZHENG Lu，ZHANG Jun，YU Yang，YAO Shuang，YU Miaomei，F(xiàn)ENG Yuehua，LUO Guanghua△
Comprehensive Laboratory，The Third Affiliated Hospital of Soochow University，Changzhou Key Lab of Individualized Diagnosis and Treatment Associated with High Technology Research，Changzhou 213003，China△

ObjectiveTo develop a duplex fluorescence RT-PCR assay for detection of scavenger receptor class B，typeⅠ（SRBⅠ）knockout mice.MethodsPrimers and probes were designed according to knockout region of SRBⅠgene and related substituted sequence.DNA samples were extracted from tails of mice and performed amplification using realtime PCR.SRBⅠgenotypes of mice were analyzed according to amplification curves of FAM and CY5 channels.Finally，the sensitivity of the method was detected and the accuracy was verified by the direct sequencing.ResultsThe homozygous SRBⅠwild genotype showed an amplification curve only in FAM channel.When the homozygous SRBⅠknockout genotype was present，the typical S amplification curve appeared only in the CY5 channel.Heterozygous genotype showed two typical S amplification curves in both FAM and CY5 channels，respectively.The results showed that the sensitivity reached 4×101copies/μL，and there was complete concordance between this method and direct DNA sequencing.ConclusionThe new method is simple，rapid and accurate，which is suitable for genotyping SRBⅠknockout mice.

antigens，CD36；scavenger receptors-BⅠ；dual fluorescence real-time PCR；gene knockout

R349.82

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.008

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81201352）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK2012154）

蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院綜合實(shí)驗(yàn)室，常州市個(gè)性化診療高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編213003）

潘麗莉（1986），女，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主要從事疾病分子生物學(xué)診斷的研究

△通訊作者E-mail:shineroar@163.com