徐賓，張?zhí)煊怼?，譚寧，閆亓，徐伶俐，劉曉佳，高漓

蓮心堿促進膀胱癌5637細胞凋亡增強Caspase-7表達及活化

徐賓1，張?zhí)煊?△，譚寧2，閆亓1，徐伶俐3，劉曉佳4，高漓1

目的研究蓮心堿（Liensinine）對膀胱癌細胞株5637凋亡的影響，初步探討其作用機制。方法使用CCK-8法及克隆形成實驗檢測蓮心堿對5637細胞增殖的抑制作用；通過流式細胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI雙染法測定蓮心堿對5637細胞凋亡的影響；采用Western blot技術(shù)分析細胞凋亡相關(guān)基因Caspase-7表達狀況。結(jié)果CCK-8法及克隆形成實驗結(jié)果均表明蓮心堿對膀胱癌細胞5637增殖有明顯的抑制作用，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。流式細胞術(shù)結(jié)果提示蓮心堿可使膀胱癌5637細胞發(fā)生早期凋亡；Western blot檢測結(jié)果顯示蓮心堿增強5637細胞Caspase-7表達并促進其活化。結(jié)論蓮心堿可抑制5637細胞增殖，使其發(fā)生早期凋亡，其作用機制可能與促進Caspase-7表達及活化有關(guān)。

膀胱腫瘤；生物堿類；細胞增殖；細胞凋亡；半胱氨酸內(nèi)肽酶類；蓮心堿；Caspase-7

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，而非肌層浸潤性膀胱癌（NMIBC）約占膀胱癌的80%［1］，治療以經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)輔以術(shù)后灌注化療為主。但目前的化療藥物并不能很好地解決膀胱腫瘤術(shù)后易復發(fā)的問題。尋求療效更好、不良反應(yīng)少的灌注治療藥物，一直是泌尿外科的研究熱點。蓮心堿（Liensinine）是從蓮子的胚芽中提取出的一種雙芐基異喹啉類生物堿，具有降血壓、抗心律失常、抗脂質(zhì)過氧化，抗血小板凝集、抗血栓及保護心腦血管活性等作用［2］。此外，本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，蓮心堿具有抑制膀胱癌T24細胞增殖及細胞周期阻滯的作用［3］。為進一步了解蓮心堿對膀胱癌5637細胞凋亡的影響，筆者以人膀胱癌細胞株5637為實驗對象，對其作用機制進行初步探討，以期為膀胱癌術(shù)后臨床治療提供新的備選方案及理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料人膀胱癌5637細胞株購于中國科學院上海生科院細胞資源中心，蓮心堿（上海源葉有限公司，貨號為YY90562 CAS:#25.00086-96-1，蓮心堿溶于甲醇，制成20 g/L儲備液），DMEM高糖培養(yǎng)液（GIBCO公司，貨號：C11995500BT），胎牛血清FBS（Corille公司，貨號：C1015-05），CCK-8試劑（上海同仁化學研究所，貨號：CK04），Cas?pase-7單克隆抗體（CST公司，貨號：12827），β-actin（鼠源性，SANTA CRUZ公司），AnnexinV-FITC/PI試劑（東仁化學科技上海有限公司，貨號：AD10）。

1.2細胞培養(yǎng)人膀胱癌細胞5637培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中（含青鏈霉素），用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，選取對數(shù)生長期的腫瘤細胞進行實驗。

1.3細胞增殖實驗采用對數(shù)生長期膀胱癌5637細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液將細胞吹打為單細胞懸液，以1 000個/孔濃度接種于96孔板。24 h細胞貼壁后，加入蓮心堿使其終濃度為1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L，對照組加等體積甲醇，同一濃度設(shè)置3個復孔。檢測前，棄去培養(yǎng)基，在每孔加入100μL CCK-8檢測試劑，37℃孵育2 h后，置于連續(xù)波長酶標儀（infinite M200 PRO），讀取450 nm波長處吸光度（A）值，分別記錄加藥后2 h及第1、2、3、4天數(shù)值。然后計算出蓮心堿2、3、4 d的半數(shù)抑制濃度（IC50）值及各時間點的細胞抑制率。細胞抑制率（%）=（對照組A450值-干預加藥組A450值）/對照組A450值×100%。

1.4克隆形成實驗6孔培養(yǎng)板接種1 200個處于對數(shù)生長期的人膀胱癌5637細胞。37℃、5%CO2孵育24 h后，加入藥液使蓮心堿終濃度為1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L，待藥物作用5637細胞達7 d后。棄去上清液，PBS溶液浸洗2次，加入4%多聚甲醛固定15 min，棄固定液，加入結(jié)晶紫染液染色15 min，洗去染液，空氣中干燥，掃描圖像。然后加入10%冰醋酸溶液2 mL，靜置30 min，結(jié)晶紫溶解后，取100μL加入96孔板中，使用連續(xù)波長酶標儀（infinite M200 PRO），讀取各孔560 nm波長處A值并計算克隆抑制率?？寺∫种坡剩?）=（對照組A560值-干預加藥組A560值）/對照組A560值×100%。

1.5細胞凋亡檢測用10 cm培養(yǎng)皿接種2×105個處于對數(shù)生長期的5637細胞，37℃、5%CO2孵育24 h，待貼壁后，加入蓮心堿使其濃度為1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L。待藥物作用于5637細胞48 h后，收集細胞并離心、棄上清液，PBS洗滌2次，離心，棄上清液，1×結(jié)合緩沖液重懸細胞，并吹打混勻，加入5μL AnnexinV/FITC和10μL PI染色液（20 mg/L），避光30 min。篩網(wǎng)過濾，使用流式細胞儀（BD FACS AriaⅢ）測定采集數(shù)據(jù)。

1.6Western blot檢測收集培養(yǎng)細胞，用細胞裂解液提取細胞總蛋白，用蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠（12%分離膠＋6%濃縮膠）電泳后轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌，二抗37℃孵育2 h，TBST洗滌，與免疫印跡化學發(fā)光試劑（ECL）反應(yīng)，X線片曝光，顯影，定影。

1.7統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，以上實驗均重復3次。計量資料以均數(shù)±標準差表示，多個樣本間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni-t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1蓮心堿具有抑制5637細胞增殖的作用蓮心堿作用2 h后各濃度加藥組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（F=2.778，P＞0.05）。蓮心堿作用1 d后（F=58.86，P＜0.05），1.562、3.125、6.250 mg/L各濃度組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），12.500、25.000 mg/L蓮心堿組與其他組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。蓮心堿作用2、3、4 d后，各濃度組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（F值分別為151.217、170.535、195.366，P＜0.05），見圖1。分別用1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L蓮心堿作用2 d后，5637細胞增殖抑制率分別為（11.51±0.07）%、（21.31±0.04）%、（29.97±0.43）%、（49.98±0.05）%、（60.38±0.03）%，差異有統(tǒng)計學意義（F=51.786，P＜0.05）。藥物作用2、3、4 d后，CCK-8法求得5637細胞IC50值分別為22.36、7.37、6.40 mg/L。

Fig.1Liensinine inhibited the proliferation of 5637 cells in dosedependent manner圖1 蓮心堿以劑量依賴的方式抑制5637細胞增殖

2.2蓮心堿對克隆形成的抑制作用（1）蓮心堿各加藥組與對照組克隆形成抑制率比較差異有統(tǒng)計學意義（F=120.628，P＜0.05）。（2）1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L蓮心堿作用7 d后，克隆抑制率分別為（35.04±0.04）%、（50.32±0.01）%、（68.10± 0.02）%、（84.39±0.01）%、（92.74±0.01）%，差異有統(tǒng)計學意義（F=386.879，P＜0.05），見圖2。

2.3蓮心堿促進膀胱癌5637細胞凋亡見圖3。5637細胞在不同濃度蓮心堿干預后，與對照組相比，細胞早期凋亡比例明顯增加，對照組及1.562、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/L加藥組早期凋亡細胞所占比例分別為（2.77±0.09）%、（3.40±0.10）%、（3.57±0.09）%、（4.50±0.15）%、（5.07±0.15）%、（9.63± 0.12）%，差異有統(tǒng)計學意義（F=442.442，P＜0.05）。加藥組對5637細胞凋亡具有促進作用。

2.4蓮心堿上調(diào)膀胱癌5637細胞Caspase-7表達水平蓮心堿組與對照組相比，Caspase-7表達及其活化水平在蓮心堿干預后出現(xiàn)明顯上調(diào)，見圖4。

Fig.2Liensinine inhibited colony formation of 5637 cells圖2 蓮心堿抑制5637的細胞克隆形成

Fig.3Liensinine promoted the apoptosis of bladder cancer 5637 cells圖3 蓮心堿促進膀胱癌5637細胞凋亡

Fig.4Liensinine up-regulated the expression of Caspase-7 and promoted its activation圖4 蓮心堿上調(diào)5637細胞Caspase-7蛋白表達及其活化水平

3 討論

膀胱癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增長趨勢，2008年以來，60歲以上的中國人膀胱癌發(fā)病率已超過腎腫瘤，居泌尿系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率第1位［4］。當前，膀胱癌的防治形勢更加嚴峻，鑒于其術(shù)后復發(fā)率高，目前臨床一線用藥如吡柔比星、卡介苗等并不能有效控制復發(fā)，尋求術(shù)后有效治療藥物十分必要。有關(guān)蓮心堿的研究表明其具有保護心腦血管活性的作用［5］，但是其在膀胱癌治療方面的研究少有報道。

本研究采用了CCK-8法及克隆形成實驗檢測蓮心堿對5637細胞增殖的抑制作用。CCK-8法結(jié)果表明蓮心堿對膀胱癌5637細胞增殖有明顯的抑制作用，隨藥物濃度的增加，抑制作用更加明顯。克隆形成實驗表明隨藥物濃度的增加，克隆抑制率呈現(xiàn)明顯的升高趨勢，藥物作用7 d后，3.125 mg/L抑制率即可達到50%，上述結(jié)果均表明蓮心堿對膀胱癌5637細胞增殖的抑制作用明顯，體現(xiàn)了蓮心堿良好的體外抗腫瘤效應(yīng)。

細胞凋亡與細胞增殖的平衡狀態(tài)可保證細胞數(shù)目的穩(wěn)定，而細胞凋亡的抑制則可能引起腫瘤的產(chǎn)生［6-7］。誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的作用靶點之一，許多抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的殺傷作用也是通過誘導細胞凋亡的機制來實現(xiàn)的［8］。細胞凋亡率是評價藥物抗癌效果的一項指標［9］。本研究通過不同濃度蓮心堿作用于膀胱癌5637細胞發(fā)現(xiàn)，隨蓮心堿濃度的增加，5637細胞早期凋亡率逐漸上升，這表明蓮心堿可以促進膀胱癌5637細胞的凋亡，且該促進作用主要發(fā)生在細胞凋亡的早期階段。

Caspase是一類在細胞凋亡過程中起到核心作用的蛋白酶，是細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑的關(guān)鍵效應(yīng)分子，也是多種細胞凋亡途徑中的共同作用因子，細胞凋亡程度與其表達水平的高低有關(guān)［10］。Caspase已經(jīng)在多種細胞系中被證實可在凋亡的起始和執(zhí)行階段被激活［11］。Caspase-7是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，它和Caspase-3共同被認為是凋亡的最終執(zhí)行者。有研究發(fā)現(xiàn)Caspase-7的變異與中國東部地區(qū)胃癌易感性相關(guān)［12］。人體的多種腫瘤如胃癌、結(jié)腸癌及肺癌［13-14］等都有Caspase-7的低表達或變異。本研究結(jié)果表明，蓮心堿可以通過促進Caspase-7的表達和活化來誘導膀胱癌5637細胞的凋亡。

綜上所述，蓮心堿可能通過上調(diào)Caspase-7的表達及活化，促進膀胱癌5637細胞發(fā)生早期凋亡，從而抑制膀胱癌細胞的增殖。蓮心堿的體外抗腫瘤作用為膀胱癌的治療提供了新思路，具有成為膀胱癌治療藥物的潛力。但本研究為體外實驗，不能完全模擬復雜的體內(nèi)環(huán)境。因此，蓮心堿對膀胱癌的治療作用需要進一步的動物實驗及相關(guān)臨床試驗的證實。

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（2015-01-15收稿 2015-04-23修回）

（本文編輯 魏杰）

Liensinine promotes apoptosis of bladder cancer 5637 cells and enhances Caspase-7 expression and activation

XU Bin1，ZHANG Tianyu1△，TAN Ning2，YAN Qi1，XU Lingli3，LIU Xiaojia4，GAO Li1
1 Department of Urology，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541004，China；2 Center of Science Research，Guilin Medical University；3 Department of Gastroenterology，4 Department of Pathology，Affiliated Hospital of Guilin Medical University△

ObjectiveTo study the effects of Liensinine on apoptosis of 5637 cells，and its mechanism thereof.Meth?odsCCK-8 method and the colony formation test were used to detect cell viabilities，and then inhibition rates were calcu?lated.Flow cytometry was used to detect the effects of Liensinine on apoptosis of 5637 cells.Western blot assay was used to detect Caspase-7 protein expression.ResultsCCK-8 assay and colony formation test indicated that Liensinine inhibited the cell proliferation significantly.Results of flow cytometry indicated that Liensinine induced early apoptosis of 5637 cells. Western blot assay showed that Liensinine improved the expression of Caspase-7 and enhanced the activation of Caspase-7 in 5637 cells.ConclusionLiensinine could inhibit the proliferation of 5637 cells，induce early apoptosis，which may be re?lated with the enhanced expression of Caspase-7 and its activation.

urinary bladder neoplasms；alkaloids；cell proliferation；apoptosis；cysteine endopeptidases；liensinine；Caspase-7

R737.14

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.006

國家自然科學基金資助項目（81360377）；廣西自然科學基金項目（2010GXNSFA183013）；桂林市科學研究與技術(shù)開發(fā)項目（20080408）

1桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科（郵編541004）；2桂林醫(yī)學院科學實驗中心；3桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；4桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科

徐賓（1986），男，碩士研究生，主要從事泌尿系腫瘤研究

△通訊作者E-mail：zhangtianyu64@qq.com