蔣少云,陶玉飛,李陽(yáng),宋立婷,朱東望,鄧嘉胤
體外誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞多向分化潛能的實(shí)驗(yàn)研究
蔣少云,陶玉飛,李陽(yáng),宋立婷,朱東望,鄧嘉胤△
目的探索人牙齦成纖維細(xì)胞(hGFs)是否具有多向分化潛能,為組織工程學(xué)提供新的細(xì)胞來(lái)源。方法經(jīng)志愿者知情同意后收集健康牙齦組織,組織塊法培養(yǎng)hGFs。取第3代hGFs進(jìn)行成骨、成軟骨和成脂誘導(dǎo),未分化誘導(dǎo)的細(xì)胞為對(duì)照組。分別用堿性磷酸酶(ALP)染色和茜素紅染色、阿利新藍(lán)染色、油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞成骨、成軟骨和成脂能力。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)細(xì)胞中成骨分化標(biāo)志基因ALP、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、成軟骨分化標(biāo)志基因聚集蛋白聚糖(AGR)和成脂分化標(biāo)志基因過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ2(PPARγ2)的表達(dá)。結(jié)果成骨誘導(dǎo)組培養(yǎng)至7 d時(shí)ALP染色可見(jiàn)大量的藍(lán)紫色沉淀,28 d時(shí)細(xì)胞周?chē)写罅考t染的鈣結(jié)節(jié)沉積,而對(duì)照組無(wú)鈣結(jié)節(jié),培養(yǎng)至14 d細(xì)胞中ALP和Runx2表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。14 d時(shí)成軟骨誘導(dǎo)組阿利新藍(lán)陽(yáng)性,成脂誘導(dǎo)組可見(jiàn)紅色的脂肪滴,而對(duì)照組2種染色為陰性,AGR、PPARγ2表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論hGFs具有成骨、成軟骨和成脂分化的多向分化潛能。
牙齦;成纖維細(xì)胞;成脂分化;細(xì)胞分化;人牙齦成纖維細(xì)胞;成骨分化;成軟骨分化
牙周炎的重要病理變化之一是牙槽骨的吸收,如何促進(jìn)牙周骨缺損再生是牙周治療的難題,采用組織工程學(xué)獲得牙周骨再生是研究的熱點(diǎn)。目前研究較多的口腔來(lái)源細(xì)胞包括牙周膜細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞和牙囊細(xì)胞等[1-3],但是由于這些細(xì)胞取材困難,增殖分化數(shù)量少等,臨床應(yīng)用的可能性相對(duì)較低。人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts,hGFs)是牙齦組織中的主要細(xì)胞成分。研究發(fā)現(xiàn)hGFs不但參與炎癥反應(yīng)[4],而且從人牙齦組織中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞或hGFs能夠在體外誘導(dǎo)下表達(dá)多種成骨相關(guān)基因[5-6]。但至今尚鮮見(jiàn)文獻(xiàn)直接證實(shí)hGFs具有多向分化的潛能。本研究旨在探索hGFs在體外培養(yǎng)條件下是否具有成骨、成軟骨和成脂分化的能力,為確定hGFs作為組織工程的種子細(xì)胞提供依據(jù)。
1.1材料DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(低糖)、胎牛血清(fetal bo?vine serum,F(xiàn)BS)、0.25%胰蛋白酶(Gibco,美國(guó));青/鏈霉素、抗壞血酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌、吲哚美辛、地塞米松、L-谷氨酰胺、茜素紅(Sigma,美國(guó));DispaseⅡ分散酶(Roche,德國(guó));胰島素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、Trizol總RNA提取試劑(Invitrogen,美國(guó));飽和油紅O染色液、阿利新藍(lán)(北京索萊寶公司,中國(guó));cDNA合成試劑盒、real-time PCR試劑盒(Promega,美國(guó))。5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/四唑硝基藍(lán)(BCIP/NBT)溶液(北京華興博創(chuàng)生物技術(shù)中心,中國(guó))。
1.2方法
1.2.1hGFs體外分離與培養(yǎng)選擇就診于天津醫(yī)科大學(xué)口腔頜面外科的志愿者,年齡18~25歲,無(wú)齲病、牙周病,經(jīng)志愿者知情同意后,于局麻下拔除埋伏阻生齒時(shí)獲得新鮮健康牙齦組織。組織塊經(jīng)加有雙抗的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗后,用2 U/mL無(wú)菌中性蛋白DispaseⅡ分散酶4℃浸泡,16~18 h后剝離牙齦上皮組織棄之,剪成體積約為0.5~1 mm3的碎塊,將組織塊均勻接種于100 mm培養(yǎng)皿中。待組織塊于培養(yǎng)皿適當(dāng)貼合以后,加入DMEM+15%FBS,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。待細(xì)胞從組織塊中爬出并鋪滿(mǎn)瓶底達(dá)80%融合時(shí)進(jìn)行傳代,用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),取生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
1.2.2細(xì)胞分化培養(yǎng)取生長(zhǎng)良好的第3代hGFs,以2×104/孔接種于6孔板,37℃溫箱孵育24 h,待細(xì)胞貼壁后,進(jìn)行細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng):DMEM培養(yǎng)基(低糖)、3%FBS、1×10-3mol/L β-甘油磷酸鈉、5 mg/L抗壞血酸、2×10-3mol/LL-谷氨酰胺以及1×10-7mol/L地塞米松。成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng):DMEM(低糖)、3%FBS、50mg/L抗壞血酸、6.25mg/L胰島素及10μg/LTGF-β1。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng):包括DMEM(低糖)、3%FBS、1×10-6mol/L地塞米松、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌及2×10-4mol/L吲哚美辛。對(duì)照組培養(yǎng):DMEM(低糖)+3%FBS。
1.2.3堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色按1.2.2所述方法接種細(xì)胞后,加入成骨分化培養(yǎng)基,37℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng),每周換2~3次液。培養(yǎng)至7 d的細(xì)胞,棄培養(yǎng)基,PBS漂洗,4%多聚甲醛固定30 min,PBS漂洗3次后,加入BCIP/NBT溶液,室溫避光染色30 min,PBS漂洗2次,于直視及倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。
1.2.4茜素紅染色按1.2.3所述方法培養(yǎng)細(xì)胞,培養(yǎng)至28 d收集細(xì)胞,棄培養(yǎng)基,PBS漂洗,4%多聚甲醛固定30 min,PBS漂洗3次,每次3 min,然后加入0.5%茜素紅染色液,室溫染色30 min,PBS漂洗2次后,于直視及倒置顯微鏡下觀察。
1.2.5阿利新藍(lán)染色如1.2.2所述方法接種細(xì)胞后,加入成軟骨分化培養(yǎng)基,37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng),每周換2~3次液。培養(yǎng)至14 d時(shí),棄培養(yǎng)基,PBS沖洗,4%多聚甲醛固定30 min,加入阿利新藍(lán)染色液,孵育過(guò)夜,3%醋酸漂洗3次,每次5 min,PBS漂洗,直視及顯微鏡下觀察結(jié)果。
1.2.6油紅O染色如1.2.2所述方法接種細(xì)胞后,加入成脂分化培養(yǎng)基,37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng),每周換2~3次液。培養(yǎng)至14 d時(shí),棄培養(yǎng)基,PBS漂洗,4%多聚甲醛固定30 min,加入油紅O染色液,室溫染色10 min,PBS漂洗3 min×2次,于倒置顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。
1.2.6實(shí)時(shí)定量PCR如1.2.2所述方法接種細(xì)胞,分別加入成骨、成軟骨和成脂培養(yǎng)基,37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng),每周換2~3次液。培養(yǎng)至14 d時(shí),棄培養(yǎng)基,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,在Applied Biosystems 9700 Thermo?cycler(Applied Bio-systems,USA)上用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞中ALP、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related tran?script factor 2,Runx2)、聚集蛋白聚糖(aggrecan,AGR)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ2(peroxisome proliferator-activat?ed receptor gamma 2,PPARγ2)的表達(dá),以GAPDH為內(nèi)參,所得的數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT法[6]進(jìn)行處理,與相同刺激時(shí)間的對(duì)照組進(jìn)行比較分析。引物序列:ALP上游5′-ACCATTCCCACGTC TTCACATTTG-3′,下游5′-AGACATTCTCTCGTTCACCGCC-3′;Runx2上游5′-TCTGGCCTTCCACTCTCAGT-3′,下游5′-GACTGGCGGGGTGTAAGTAA-3′;AGR上游5′-CGGCCTG?GACAAGTGCTAT-3′,下游5′-CCGAAGTGAGGCTGCATAC C-3′;PPARγ2上游5′-AGACAACCTGCTACA AGCCC-3′,下游5′-AGCGGGTGAAGACTCATGTC-3′;GAPDH上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游5′-ATGGTGGTGA AGACGCCAGT-3′。PCR反應(yīng)參數(shù):95℃2 min,1個(gè)循環(huán);95℃持續(xù)15 s;60℃持續(xù)60 s,40個(gè)循環(huán)。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SAS V8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用描述,進(jìn)行Student’s t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
Fig.1ALP staining in human gingival fibroblasts induced in osteogenic medium圖1 hGFs成骨誘導(dǎo)ALP染色
2.1ALP染色和茜素紅染色培養(yǎng)至7 d的細(xì)胞,對(duì)照組無(wú)明顯ALP染色,成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量藍(lán)紫色沉淀,見(jiàn)圖1。培養(yǎng)至28 d的細(xì)胞,對(duì)照組細(xì)胞周?chē)鸁o(wú)鈣結(jié)節(jié)形成,成骨誘導(dǎo)組可見(jiàn)細(xì)胞周?chē)写罅考t染的鈣結(jié)節(jié),見(jiàn)圖2。
Fig.2Alizarin red staining in human gingival fibroblasts induced in osteogenic medium圖2 hGFs成骨誘導(dǎo)茜素紅染色
2.2阿利新藍(lán)染色培養(yǎng)至14 d的細(xì)胞,對(duì)照組細(xì)胞阿利新藍(lán)染色陰性,成軟骨誘導(dǎo)組見(jiàn)大量胞質(zhì)呈藍(lán)染的細(xì)胞,見(jiàn)圖3。
Fig.3Alcian blue staining in human gingival fibroblasts induced in chondrogenic medium圖3 hGFs成軟骨誘導(dǎo)阿利新藍(lán)染色
2.3油紅O染色加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基以后,hGFs表現(xiàn)出細(xì)胞表型的變化包括體積變大,形態(tài)呈長(zhǎng)橢圓形或多角形。培養(yǎng)至14 d的細(xì)胞,成脂誘導(dǎo)組培養(yǎng)液中存在漂浮的脂肪顆粒。鏡下可見(jiàn):對(duì)照組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,油紅O染色陰性;成脂誘導(dǎo)組可見(jiàn)部分細(xì)胞體積增大,細(xì)胞呈類(lèi)圓形或長(zhǎng)橢圓形,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)大小不一的紅色球狀脂肪顆粒,見(jiàn)圖4。
2.4成骨、成軟骨和成脂標(biāo)志基因的表達(dá)成骨誘導(dǎo)14 d后細(xì)胞中ALP和Runx2的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01),成軟骨誘導(dǎo)14 d后細(xì)胞中AGR的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01),成脂誘導(dǎo)14 d后細(xì)胞中PPARγ2的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01),見(jiàn)表1。
Fig.4Oil red O staining in human gingival fibroblasts induced in adipogenic medium圖4 hGFs成脂誘導(dǎo)油紅O染色(×100)
Tab.1ALP,Runx2,AGR and PPARγ2 expressions in hGFs after being induced by differentiation medium表1 hGFs分化培養(yǎng)后ALP、Runx2、AGR和PPARγ2的表達(dá)
Tab.1ALP,Runx2,AGR and PPARγ2 expressions in hGFs after being induced by differentiation medium表1 hGFs分化培養(yǎng)后ALP、Runx2、AGR和PPARγ2的表達(dá)
**P<0.01
ALP 1.002±0.069 4.599±0.571組別對(duì)照組成骨組成軟骨組成脂組t Runx2 1.001±0.050 5.532±0.853 PPARγ2 1.007±0.146 ------10.84**9.19**AGR 1.023±0.251 -5.375±0.624 -11.21**7.224±0.727 14.53**
hGFs來(lái)源于人牙齦結(jié)締組織的間充質(zhì)細(xì)胞,具有活躍的自我更新能力,并且具有合成和降解膠原纖維的功能。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn):hGFs在體外在一定的條件下能被誘導(dǎo)向成骨、成軟骨和成脂分化,說(shuō)明hGFs可能是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞。
本研究采用ALP染色和茜素紅染色檢測(cè)hGFs的成骨分化能力。ALP在成骨的過(guò)程中可以水解磷酸酯,為羥磷灰石的沉積提供磷酸,可以反映細(xì)胞成骨分化趨勢(shì),也是檢測(cè)細(xì)胞成骨分化的早期標(biāo)志之一。本研究顯示,在成骨分化誘導(dǎo)7 d后hGFs細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)大量藍(lán)紫色沉淀,而且通過(guò)檢測(cè)ALP mRNA水平,發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組,與染色結(jié)果一致,說(shuō)明在成骨誘導(dǎo)的早期,hGFs表現(xiàn)出明顯的成骨分化趨勢(shì)。同時(shí)Runx2是細(xì)胞成骨分化過(guò)程中重要且標(biāo)志性的因子,在成骨分化培養(yǎng)后hGFs細(xì)胞內(nèi)Runx2 mRNA的水平明顯升高,說(shuō)明hGFs已向成骨分化。進(jìn)一步用茜素紅染色進(jìn)行驗(yàn)證,細(xì)胞成骨誘導(dǎo)28 d時(shí)茜素紅染色顯示細(xì)胞周?chē)写罅康拟}結(jié)節(jié)形成,證明了hGFs具有成骨分化能力,與Mostafa等[5-7]的研究結(jié)果一致。但是,有些研究顯示:hGFs無(wú)明顯成骨分化能力[8-9]。通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn):成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分不同可能是導(dǎo)致成骨分化誘導(dǎo)結(jié)果存在差異性的主要原因。在Martinez等[8]的研究中成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分中除基礎(chǔ)培養(yǎng)基外僅含有β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸,而在筆者此前研究中發(fā)現(xiàn)hGFs在含β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基有較弱的成骨分化能力,但是在培養(yǎng)基中加入適量的地塞米松后,hGFs的成骨分化能力明顯增強(qiáng)[10];筆者的研究與Choi等[9]的研究進(jìn)行比較,成骨分化培養(yǎng)基成分基本相同,但是某些成分的含量有差異,如胎牛血清、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸,有可能導(dǎo)致研究結(jié)果的不一致。
阿利新藍(lán)是細(xì)胞成軟骨分化的一個(gè)重要標(biāo)志。本研究hGFs經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后阿利新藍(lán)染色陽(yáng)性,說(shuō)明hGFs能向成軟骨分化,而且成軟骨分化標(biāo)志基因AGR mRNA水平在成軟骨誘導(dǎo)組細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高,說(shuō)明在成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)的成軟骨基因表達(dá)增強(qiáng),決定了細(xì)胞向成軟骨方向分化,與阿利新藍(lán)染色結(jié)果一致。
本研究在成脂培養(yǎng)基中hGFs發(fā)生了細(xì)胞形態(tài)的變化,而且在14 d時(shí)油紅O被細(xì)胞內(nèi)的脂肪滴溶解,出現(xiàn)橘紅色油紅O染色,而且在成脂分化培養(yǎng)基中細(xì)胞內(nèi)成脂分化標(biāo)志基因的表達(dá)升高,決定了hGFs向成脂分化的方向,從而出現(xiàn)油紅O染色陽(yáng)性的結(jié)果,以上均證實(shí)了hGFs的成脂分化潛能。
綜上,hGFs在不同的分化誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)志性基因發(fā)生了相應(yīng)的變化,驅(qū)使細(xì)胞向成骨、成軟骨或成脂方向分化,而且與其他自體來(lái)源的細(xì)胞相比,hGFs來(lái)源廣泛、取材方便、體外培養(yǎng)容易,因此hGFs可能會(huì)成為一種新的種子細(xì)胞,在組織工程學(xué)中具有良好的研究和應(yīng)用前景。
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(2015-02-27收稿 2015-04-02修回)
(本文編輯 李國(guó)琪)
Study on differentiation pluripotency of human gingival fibroblasts induced in vitro
JIANG Shaoyun,TAO Yufei,LI Yang,SONG Liting,ZHU Dongwang,DENG Jiayin△
Department of Periodontics,Hospital of Stomatology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China△
ObjectiveTo investigate the pluripotency of human gingival fibroblasts(hGFs),and provide a novel cell source for tissue engineering.MethodsWith informed consent from volunteers,fresh and healthy gingiva were collected. The hGFs were obtained from the gingiva by tissue culture.The third passage of hGFs was cultured in osteogenic medium,chondrogenic medium and adipogenic medium.Cells without differentiation were taken as control.Cells were examined by al?kaline phosphatase(ALP)staining,Alizarin red staining,Alcian blue staining and oil red O staining for detecting of the abili?ty of differentiation pluripotency.Real-time polymerase chain reaction was applied to examine the expression of osteogenic marker genes ALP,runt-related transcript factor 2(Runx2),chondrogenic marker aggrecan(AGR)and adipogenic marker peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2(PPARγ2).ResultsThe hGFs cultured in osteogenic medium showed massive violet deposit at day 7 and calcium nodulus at day 28,meanwhile,the expressions of ALP and Runx2 were higher than those of control(P<0.01).In chondrogenic group cells were found blue deposit at day 14.In adipogenic group lipidfilled droplets stained with oil red O were found in cells at day 14.However,hGFs in control group had no any positive stain?ing.Furthermore,expressions of AGR and PPARγ2 were significantly higher than those of control(P<0.01).Conclusion Human gingival fibroblasts have the pluripotency of osteogenic,adipogenic and chondrogenic differentiation.
gingiva;fibroblasts;adipogenesis;cell differentiation;human gingival fibroblasts;osteogenic differentia?tion;chondrogenic differentiation
R781
A
10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.003
天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃-自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(12JCZDJC22700)
天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科(郵編300070)
蔣少云(1972),女,副教授,博士,主要從事牙周病發(fā)病機(jī)制及牙周組織工程學(xué)的研究
△通訊作者E-mail:yazhou2991@126.com