趙興福，江山，黃曉晶△，閆福華

細(xì)胞與分子生物學(xué)

酸性條件下變異鏈球菌臨床株表面相關(guān)蛋白表達(dá)差異分析

趙興福1，江山2，黃曉晶2△，閆福華3

目的探討變異鏈球菌臨床株在pH7.0和pH5.0條件下的表面相關(guān)蛋白表達(dá)差異，進(jìn)一步了解齲病發(fā)生和發(fā)展過程。方法采用Homer法提取593和18號（593號菌株分離于高發(fā)齲患者，18號菌株分離自無齲健康人）臨床分離株在pH7.0和pH5.0條件下的表面相關(guān)蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳和二維電泳確定蛋白表達(dá)的差異條帶及位點(diǎn)，差異位點(diǎn)由基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜分析，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索和鑒定蛋白質(zhì)。結(jié)果經(jīng)過對電泳圖譜的分析發(fā)現(xiàn)，兩菌株在pH7.0條件下存在4個高表達(dá)位點(diǎn)和2個特異位點(diǎn)；在pH5.0條件下存在2個高表達(dá)位點(diǎn)和2個特異位點(diǎn)。593號菌株蛋白表達(dá)又發(fā)生了特殊的變化，即在pH5.0條件下，存在3個高表達(dá)位點(diǎn)和6個特異位點(diǎn)，其中雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)組氨酸激酶Lyts和3-磷酸甘油醛脫氫酶高表達(dá)，NADH氧化酶特異表達(dá)。結(jié)論兩菌株在酸性變化下均出現(xiàn)了某些蛋白的高表達(dá)和特異表達(dá)，可能兩菌株耐酸反應(yīng)中存在相似之處；兩菌株間蛋白表達(dá)差異可能是耐酸性存在差異的原因。

鏈球菌，變異；蛋白質(zhì)組學(xué)；臨床分離株；表面相關(guān)蛋白；耐酸性

齲病是危害人類口腔健康的主要疾病之一，血清C型變異鏈球菌（Streptococcus rnutans，簡稱S. mutans，變鏈菌）是主要的致齲菌之一，該菌株臨床分離株間致齲能力存在明顯差異［1-2］。本課題組在前期研究中成功分離高齲患者和無齲健康人血清C型變鏈菌臨床分離株，并證明菌株間與致齲能力密切相關(guān)的耐酸能力、胞外多糖合成能力、黏附能力以及產(chǎn)酸能力均存在明顯差異［3］。其中，耐酸能力差異是菌株間致齲能力存在差異的重要原因之一［4］。因此，本研究挑選了來自高齲患者和無齲健康人血清C型變鏈菌臨床分離株593號和18號菌株，分析了兩菌株分別在pH7.0和pH5.0條件下的表面相關(guān)蛋白表達(dá)差異，探討菌株間耐酸能力存在差異的原因。

1 材料與方法

1.1材料與設(shè)備

1.1.1主要試劑兩性洗滌劑Zwittergent 3-12（Sigma，USA），胰蛋白胨-多價(jià)蛋白-酵母提取物培養(yǎng)基（tryptonepdypeptone-yeast extract，TPY），銀染試劑盒、低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、pH固相梯度膠條、pH固相梯度干膠條覆蓋液和pH3～10NL IPG緩沖液（Amsheram Pharmacia，USA），PMSF（深圳賽泰克生物科技股份有限公司，中國），二硫素糖醇、碘乙酰胺（Promega，USA），蛋白Marker（廈門泰京生物科技股份有限公司，中國），BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，中國），透析袋Mr cut-off of 3.5 ku Snakeskin（Pierce，USA），0.22 μm過濾膜（Acrodisc，Germany）。

1.1.2主要設(shè)備YQX-Ⅱ型厭氧培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器制造有限公司，中國），320-S型pH計(jì)（Mettlertoledo，Switzer?land），ND-1000 spectrophoto meter（DanoDrop，Wilmington），酶聯(lián)免疫測定儀（Human，Germany）；等電聚焦儀、垂直板電泳儀、凝膠成像儀和圖像分析軟件（Amsheram Pharmacia，USA），DYY-6C電泳儀（北京市六一儀器廠，中國），GE50 ul?trasonic processor（Deer field，USA）。

1.2方法

1.2.1菌株本課題組在前期研究中已經(jīng)在四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院齲病研究室分離變鏈菌臨床分離株593號菌株和18號菌株（593號菌株分離于高發(fā)齲患者，18號菌株分離自無齲健康人），并鑒定以及保存。

1.2.2測定生長曲線在TPY固體培養(yǎng)基上將-70℃保存的凍干粉菌株在37℃厭氧（80%N2、10%H2、10%CO2）條件下復(fù)蘇，24 h后傳二代，將平板菌落分別收集于相應(yīng)pH7.0和pH5.0的TPY培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)菌濃度A630下光密度（OD）值均為1.0，分別以體積分?jǐn)?shù)5%加入相應(yīng)pH7.0和pH5.0的TPY液體培養(yǎng)液中，混勻后分裝于100支小試管中，在37℃厭氧條件下培養(yǎng)，每小時兩種pH值各取出2支小試管，各測OD值3次，取平均值，列圖表，繪生長曲線，確定生長對數(shù)期。

1.2.3Homer法提取表面相關(guān)蛋白菌株復(fù)蘇培養(yǎng)同上，調(diào)節(jié)菌濃度A630下OD值均為1.0，分別以體積分?jǐn)?shù)5%加入相應(yīng)pH7.0和pH5.0 TPY液體培養(yǎng)液中，混勻后在37℃厭氧條件下培養(yǎng)，對數(shù)生長期時停止。取菌液4 000 r/min離心5 min，去上清，加PBS液，輕輕吹打混勻，4 000 r/min離心5 min，再去上清，加PBS液，輕輕吹打混勻后收集，調(diào)整菌濃度A630下OD值均為0.9，取菌液4 000 r/min離心5 min，去上清，加1∶5 PBS液，含0.2%（w/v）Zwittergent 3-12，輕輕吹打混勻，于Ep管中分裝，在25℃50 r/min條件下孵育1 h，13 000 r/ min離心10 min，收集上清液，加入4倍體積pH 7.5的50 mmol/LTris-HCl，混勻后0.22 μm濾器過濾，分裝于Mr cut-off of 3.5 ku Snakeskin中，在4℃磁力慢速攪拌條件下于新鮮配制pH7.5的50 mmol/L Tris-HCl中透析過夜。4倍體積-70℃預(yù)冷的丙酮加入透析液中，-20℃條件下過夜，4℃12 000 r/min離心20 min，干燥，重懸于pH7.5的50 mmol/L Tris-HCl，4倍體積-70℃預(yù)冷的丙酮加入重懸液，-20℃條件下過夜，4℃12 000 r/min離心20 min，干燥，保存于-70℃。

1.2.4BCA法蛋白樣品定量及SDS-PAGE電泳分析將蛋白樣品溶解，用CurveExpert 1.3軟件計(jì)算蛋白濃度，并調(diào)節(jié)蛋白樣本濃度使其一致，取蛋白樣品適量，混勻于1/4體積5×Loading buffer，100℃沸水浴10 min，12 000 r/min離心10 min。配置7 cm×7 cm 12%分離膠和5%積層膠，上等量蛋白樣品，在冰浴30 mA條件下采取垂直不連續(xù)板狀法進(jìn)行SDS-PAGE電泳約4 h。考馬斯亮藍(lán)溶液中染色，10%乙酸-5%乙醇脫色液中脫色，觀察電泳結(jié)果并照相。

1.2.5Bradford法蛋白樣品定量及二維電泳分析將蛋白樣品溶解，用Chart Wizard軟件計(jì)算樣品蛋白含量。根據(jù)樣品具體情況、pH梯度范圍和strip長度確定樣品量和樣品體積，根據(jù)pH范圍和strip的長度確定電泳的電壓和時間，并在電泳中要保證達(dá)到要求，結(jié)束電泳后取出strip進(jìn)行平衡，后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束取出凝膠，銀染，染色后置于1%冰醋酸中，在4℃條件下保存。將染色好的膠圖照相并對膠圖蛋白表達(dá)量差異點(diǎn)用軟件Image Master 2D Platinum 5.0進(jìn)行分析。

1.2.6差異蛋白位點(diǎn)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF）分析選特殊差異蛋白位點(diǎn)，切取并用胰蛋白酶消化，MALDI-TOF法得到各蛋白位點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋譜（peptide mass finger printing，PMF），在NCB Inr數(shù)據(jù)庫中用Mascot（http://www.matrixscience.cn）軟件檢索相匹配的蛋白。

2 結(jié)果

2.1在pH5.0條件下兩菌株TPY液體培養(yǎng)基中的生長曲線兩菌株在pH5.0 TPY液體培養(yǎng)基中初期接種均無停滯期，而后生長速度緩慢，兩菌株均在20 h左右到達(dá)生長對數(shù)期，但593號菌株稍快于18號菌株。而后593號菌株到22 h左右出現(xiàn)菌間黏附沉積，18號菌株到26 h左右時才出現(xiàn)，見圖1。

圖1 在pH5.0條件下593號和18號菌株TPY液體培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1The growth curve of Sm 593 and Sm18 at pH5.0 in TPY fluid medium

2.2 在pH7.0條件下兩菌株TPY液體培養(yǎng)基中的生長曲線兩菌株在pH7.0 TPY液體培養(yǎng)基中初期接種均無停滯期，而后生長迅速，兩菌株均在4 h左右到達(dá)生長對數(shù)期，但593號菌株稍快于18號菌株，同時比18號菌株早0.5 h左右出現(xiàn)黏附沉積。

2.3兩菌株表面相關(guān)蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果SDS-PAGE電泳圖發(fā)現(xiàn)兩菌株在pH7.0條件下均在22、24、25 ku左右出現(xiàn)特異蛋白條帶，在pH5.0條件下均在100 ku左右出現(xiàn)特異蛋白條帶。兩菌株在pH7.0到pH5.0條件變化中蛋白表達(dá)量均在26、34、40和55 ku左右出現(xiàn)下降，均在95和115 ku左右出現(xiàn)增加。但593號菌株蛋白表達(dá)又發(fā)生了特異變化。該菌株在pH7.0條件下110 ku左右出現(xiàn)特異蛋白條帶，在pH5.0條件下68 ku左右出現(xiàn)特異蛋白條帶，在pH7.0到pH5.0條件變化中蛋白表達(dá)量在58 ku左右比18號菌株低，在95 ku左右比18號菌株高，見圖2。

Fig.2The electrophoresis of clinical-isolated stains of surfaceassociated protein Sm593 and Sm18 at pH7.0 and pH5.0 by SDS-PAGE圖2 在pH7.0和pH5.0條件下593和18號菌株表面相關(guān)蛋白的SDS-PAGE電泳圖

2.4兩菌株表面相關(guān)蛋白二維電泳結(jié)果兩菌株在pH7.0條件下均出現(xiàn)4個高表達(dá)位點(diǎn)和2個特異位點(diǎn)。在22、24、25 ku左右出現(xiàn)1545、1552等高表達(dá)位點(diǎn)和1201等特異位點(diǎn)，在26、34、40、55 ku左右出現(xiàn)1526、1399等高表達(dá)位點(diǎn)和996等特異位點(diǎn)。兩菌株在pH5.0條件下均出現(xiàn)2個高表達(dá)位點(diǎn)和2個特異位點(diǎn)，在40 ku左右出現(xiàn)1356等高表達(dá)位點(diǎn)，在45 ku左右出現(xiàn)1228等特異位點(diǎn)。593號菌株蛋白表達(dá)變化特殊，即在pH5.0條件下該菌株出現(xiàn)特有的5個高表達(dá)位點(diǎn)和6個特異位點(diǎn)，95 ku左右出現(xiàn)843、833、832等特異位點(diǎn)，31、54和68 ku左右分別出現(xiàn)964、1220和1441等特異位點(diǎn)，36、38和39 ku左右分別出現(xiàn)1339、1440和1278等高表達(dá)位點(diǎn)，以及49和58 ku左右分別出現(xiàn)1144和1045高表達(dá)位點(diǎn)，見圖3、4。

2.5593號菌株在pH 5.0條件下部分特有蛋白位點(diǎn)質(zhì)譜分析結(jié)果對1144、1287高表達(dá)位點(diǎn)和833特異位點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析后得到肽質(zhì)量指紋譜（peptide mass finger-printing，PMF），根據(jù)所得到的PMF在NCB Inr數(shù)據(jù)庫中用Mascot軟件檢索到相匹配的蛋白，見表1。

Tab.1The identification result of the surface-associated protein of 593 stain at pH5.0表1 593號菌株在pH5.0條件下部分表面相關(guān)蛋白鑒定結(jié)果

3 討論

血清C型變鏈菌是世界公認(rèn)的主要致齲菌之一。pH值作為細(xì)菌生長和代謝活動的重要影響因素，其降低會對該菌有明顯影響。即生長環(huán)境酸化會降低該菌細(xì)胞內(nèi)的pH值，胞漿酸化會影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA分子活性，糖酵解途徑的酶對酸也敏感，但該菌可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的酸適應(yīng)反應(yīng)而繼續(xù)生長代謝［4］?？梢娔退崮芰ψ鳛樵摼慢x毒力因子中關(guān)鍵因素之一，對齲病的發(fā)生和發(fā)展起很重要的作用［5］。對耐酸能力的研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的pH值隨細(xì)菌的生長代謝是不恒定的，都在降低。盡管如此，有研究表明初始pH值決定了變鏈菌對葡萄糖利用率以及酸性終產(chǎn)物的形成。牙齒硬組織在臨界值pH5.2以下才開始脫礦分解。可見，比較該菌株在pH7.0和pH5.0兩種情況下的代謝狀況對研究耐酸能力有重要意義。

與耐酸能力密切相關(guān)的蛋白大多數(shù)存在于革蘭陽性菌的膜表面［6］，于是國內(nèi)外學(xué)者對表面相關(guān)蛋白的提取方法進(jìn)行了探索。Homer法是比較成熟的方法，該法提取的膜表面相關(guān)蛋白相對完整，且該法選取的是生長對數(shù)期的變鏈菌，由于該期代謝能力強(qiáng)，死菌含量低，因此純度不會受細(xì)菌裂解的影響［6］。

國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)該菌菌株間致齲能力存在差異，耐酸能力同樣也存在差異［4，6］。因此本研究選取了本課題組前期從高齲患者口內(nèi)分離的593號菌株和從無齲健康人口內(nèi)分離的18號菌株，并提取和分析了兩菌株在pH7.0和pH5.0兩種情況下的表面相關(guān)蛋白。結(jié)果表明，從pH7.0到pH5.0條件變化中，兩菌株均存在相同特異條帶，且在某些相同蛋白條帶區(qū)域蛋白表達(dá)量均發(fā)生了相似的變化，同時發(fā)現(xiàn)在這些區(qū)域均出現(xiàn)了高表達(dá)位點(diǎn)和特異位點(diǎn)，提示兩菌株在耐酸反應(yīng)中存在相似的過程。但593號菌株又出現(xiàn)了特殊的蛋白表達(dá)，即該菌株在pH7.0條件和pH5.0條件下均存在特有的特異條帶，且在某些特殊條帶蛋白表達(dá)發(fā)生了特有的量變化，同時在相應(yīng)區(qū)域出現(xiàn)了特有的高表達(dá)位點(diǎn)和特異位點(diǎn)。其中，在pH5.0條件下，3-磷酸甘油醛脫氫酶表達(dá)量增加了40多倍，該酶為變鏈菌進(jìn)行糖酵解反應(yīng)的關(guān)鍵酶，且在乙酸合成中具有重要作用［7］，可見在酸性條件下593號菌株的糖代謝能力和產(chǎn)酸能力遠(yuǎn)強(qiáng)于18號菌株。同時值得關(guān)注的是雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)組氨酸激酶Lyts在酸性條件下表達(dá)量增加了3倍多。有研究發(fā)現(xiàn)雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)通常由二聚體化跨膜感受器，即感受信號輸入的組氨酸蛋白激酶（histidine kinase，HK）和調(diào)節(jié)信號輸出的反應(yīng)調(diào)控因子（response regulator，RR）組成。HK定位于質(zhì)膜，能感應(yīng)特異性的環(huán)境刺激；RR定位于細(xì)胞質(zhì)，可通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)對環(huán)境刺激作出反應(yīng)。該系統(tǒng)涉及許多原核生物以及細(xì)菌的多種代謝過程、細(xì)菌細(xì)胞的周期、細(xì)菌間的信號交流和細(xì)菌毒力因子的表達(dá)［8-10］，且研究發(fā)現(xiàn)它們在變鏈菌的酸耐受能力、生物膜形成能力、感受態(tài)發(fā)育能力、應(yīng)激耐受能力等致病機(jī)制中起著重要的作用［11-12］。Kawada-Matsuo等［13］通過構(gòu)建雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)組氨酸激酶缺陷株并在酸性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)其與變鏈菌的酸耐受性密切相關(guān)。因此，筆者推測593號菌株在酸性條件下的信號傳導(dǎo)能力可能強(qiáng)于18號菌株，其原因可能與雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)組氨酸激酶Lyts的高表達(dá)相關(guān)。另外，NADH氧化酶在酸性條件下特異表達(dá)，有研究表明該酶的催化反應(yīng)作用可能是變鏈菌產(chǎn)生活性氧的主要來源［14-15］，因此該蛋白的特異表達(dá)可能導(dǎo)致該菌株氧利用能力強(qiáng)于18號菌株。

由此可見，593號菌株這些高表達(dá)和特異表達(dá)的蛋白與該菌強(qiáng)耐酸性、強(qiáng)致齲性密切相關(guān)。本研究中僅分析了幾個特殊蛋白，對于其他更多蛋白情況還有待深入，這樣有利于全面系統(tǒng)了解該菌株致齲機(jī)制，對齲病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)防治療提供依據(jù)。

（圖3、4見插頁）

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（2014-12-16收稿 2015-03-08修回）

（本文編輯 魏杰）

Differential expressions of surface-associated proteins of streptococcus mutans strains isolated from clinical samples under acid condition

ZAHO Xingfu1，JIANG Shan2，HUANG Xiaojing2△，YAN Fuhua3
1 Department of Endodontology，Tianjin Stomatological Hospital of Nankai University，Tianjin 300041，China；2 Department of Endodontics and Operative Dentistry，School and Hospital of Stomatology，F(xiàn)ujian Medical University；3 Institute and Hospital of Stomatology，Nanjing University Medical School△

ObjectiveTo investigate the changes in the surface-associated protein expression of streptococcus rnutans（Sm）isolated from clinical samples at pH7.0 and pH5.0.MethodsThe proteins were extracted from cells at pH7.0 and pH5.0 by Homer method.The proteins were separated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis（SDSPAGE）and two-dimensional gel electrophoresis followed by image analysis.Proteins were identified by matrix-assisted la?ser desorption ionization time of flight mass spectrometry and computer-assisted protein sequence analysis.ResultsImage analysis revealed that four high expression levels of protein loci and two specific protein loci were existed in two strains at pH7.0.Two high expression levels of protein loci and two specific protein loci were existed in two strains at pH5.0.Three high expression levels of protein loci and six specific protein loci were existed in Sm593 at pH5.0.Two-component system histidine kinases Lyts and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase were highly modulated，and NADH oxidase were modulated specifically.ConclusionThe two clinical isolations in acid have high expression of some special proteins，which are presumed to be the resemblance of acid reaction．The difference of protein expression of two clinical isolations in acid may represent their distinct acid resistance．

streptococcus mutans；proteomics；the clinical isolationns；the surface-associated proteins；acid resistance

R781.1

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.001

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30500564）

1天津市口腔醫(yī)院牙體牙髓二科（郵編300041）；2福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科；3南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院

趙興福（1981），男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事齲病病因?qū)W研究

△通訊作者E-mail:hxiaoj@163.com