左增艷 于 濱 耿雅娜 孔維佳

中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所，北京100050

天麻粉水浸出物抑制油酸誘導的HL-7702細胞三酰甘油蓄積的實驗研究

左增艷 于 濱 耿雅娜 孔維佳▲

中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所，北京100050

目的研究天麻粉水浸出物抑制油酸（OA）誘導的HL-7702細胞三酰甘油（TG）蓄積的作用及相關細胞信號通路。方法以1 mmol/L的OA誘導細胞脂肪變性，同時加入不同濃度的天麻粉水浸出物共同孵育24 h后測定細胞內(nèi)TG含量。在Western blot實驗中，細胞以天麻粉水浸出物做相應處理后檢測AMP活化蛋白激酶α（AMPKα）和乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的磷酸化水平。在使用compound C的實驗中，細胞以10 μmol/L的compound C預處理30 min，然后加入天麻粉水浸出物，共同孵育8 h后進行Western blot實驗；或加入OA+天麻粉水浸出物，共同孵育24 h后測定細胞內(nèi)TG含量。結(jié)果OA孵育24 h后，HL-7702細胞內(nèi)TG含量較對照細胞升高約（4.0±0.5）倍（P＜0.01），天麻粉水浸出物使細胞內(nèi)TG呈劑量依賴性降低。天麻粉水浸出物處理后能劑量和時間依賴性地激活HL-7702細胞的AMPK信號通路，表現(xiàn)為磷酸化AMPKα（p-AMPKα）和磷酸化ACC（p-ACC）的水平顯著增加。compound C預處理并與天麻粉水浸出物共同孵育后能完全阻斷后者對AMPK通路的激活作用以及減少細胞內(nèi)TG的藥效。結(jié)論天麻粉水浸出物能顯著抑制OA誘導的HL-7702細胞三酰甘油蓄積，此作用依賴于細胞內(nèi)AMPK通路的激活。

天麻粉；水浸出物；HL-7702細胞；油酸；三酰甘油；AMP活化蛋白激酶

天麻（Gastrodia elata）又名“赤箭”，為蘭科植物，在我國有悠久的藥用歷史。其味甘，入肝經(jīng)，目前臨床上主要用于治療癲癇、眩暈等神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］。天麻及其主要有效成分天麻素對代謝性疾病有一定療效，如有報道天麻粉和天麻素在高血脂金黃地鼠、大鼠和小鼠等模型中具有明顯的降脂和減肥作用［2-5］；天麻粉還能顯著減輕大鼠肝臟脂肪蓄積并改善其肝功能［6］；在臨床研究中，天麻細粉片具有一定輔助降血脂作用，并且無不良反應［7］。筆者實驗室最近的研究工作表明，天麻素減少肝細胞脂肪蓄積的機制與AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路的激活有關［8］。AMPK是細胞和組織中的能量感受分子，參與調(diào)控能量和物質(zhì)代謝［9］。天麻粉抑制肝臟脂肪蓄積的機制尚不明確，本研究利用油酸（oleic acid，OA）誘導的方法建立了體外肝細胞脂肪變性模型，并研究天麻粉水浸出物減少三酰甘油（triglyceride，TG）蓄積的藥效和對AMPK的激活作用。

1 材料與方法

1.1 材料

天麻粉由全天麻烘干超微粉碎而制成，由陜西漢王略陽中藥科技有限公司提供，批號為T01-110714。HL-7702細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所并在本研究室冷凍保存。細胞培養(yǎng)試劑如DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清（FBS）購自Invitrogen公司，OA和compound C購自Sigma-Aldrich公司。TG測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所。單克隆抗體包括β-actin、AMPKα、磷酸化AMPKα（p-AMPKα）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）和磷酸化ACC（p-ACC）均購自Santa Cruz公司，Mammalian Protein Extraction Reagent購自Thermo Fisher公司，PVDF膜和ECL試劑盒購自Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 天麻粉水浸出物的制備［10］稱取天麻粉5 g，加入去離子水100 ml（重量體積比為50 mg/ml），于室溫攪拌浸提24 h。粗濾后以0.22 μm的針頭濾器（Millipore公司）過濾除菌備用。

1.2.2 細胞培養(yǎng)HL-7702細胞培養(yǎng)于含10％FBS和適當抗生素的DMEM培養(yǎng)液中。每次實驗前待細胞生長至約70％融合，棄去原培養(yǎng)液，將細胞置于含0.5％FBS的培養(yǎng)液中，饑餓24 h后進行處理。

1.2.3 細胞處理在TG測定實驗中，細胞以濃度為1 mmol/L的OA［8］處理24 h誘導脂肪變性，同時加入濃度為0、100、200、500、1000 μg/ml的天麻粉水浸出物共同孵育。在免疫印跡（Western blot）實驗中，細胞血清饑餓后以濃度為0～1000 μg/ml的天麻粉水浸出物處理8 h或以500 μg/ml的天麻粉水浸出物處理0～12 h。在使用compound C的實驗中，細胞不予處理或以10 μmol/L的compound C［8］預處理30 min，其后繼續(xù)不予處理或加入濃度為500 μg/ml的天麻粉水浸出物，共同孵育8 h后進行Western blot實驗。在另一組實驗中，細胞以或不以compound C預處理后，除對照組外，所有細胞均加入1 mmol/L的OA，同時加入或不加入500 μg/ml的天麻粉水浸出物，共同孵育24h后測定細胞內(nèi)TG含量。以上所有實驗均重復3次。

1.2.4 細胞內(nèi)TG含量測定［8］細胞處理后收集細胞，以凍融法裂解后收集上清測定TG濃度，細胞內(nèi)TG含量以μmol/g蛋白表示。

1.2.5 Western blot實驗［8］細胞處理后浸出總蛋白，以8％分離膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜并封閉后依次與β-actin、p-AMPKα和p-ACC等抗體孵育，洗膜后與二抗孵育并顯色。然后利用Stripping buffer（Santa Cruz公司）將膜上結(jié)合的抗體洗脫后重新與AMPKα和ACC抗體進行孵育檢測其總表達。以Gel-PRO ANALYZER凝膠分析軟件（Media Cybernetics公司）定量分析蛋白條帶并計算p-AMPKα/ AMPKα和p-ACC/ACC的比值，以百分數(shù)表示。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 天麻粉水浸出物對OA孵育的HL-7702細胞內(nèi)TG含量的影響

如圖1所示，OA孵育24 h后，HL-7702細胞內(nèi)TG含量較對照細胞升高約（4.0±0.5）倍（P＜0.01）；天麻粉水浸出物與OA共同孵育使細胞內(nèi)TG呈劑量依賴性降低。濃度為100 μg/ml的天麻粉水浸出物處理24 h可使細胞內(nèi)TG降低，平均下降（18.5±2.4）％，與單加OA細胞比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；1000 μg/ml的天麻粉水浸出物可使細胞內(nèi)TG平均降低（39.2±5.1）％，與單加OA細胞比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖1 天麻粉水浸出物對OA孵育的HL-7702細胞內(nèi)TG含量的影響與對照細胞比較，***P＜0.01；與單加OA細胞比較，#P＜0.05、##P＜0.01

2.2 天麻粉水浸出物激活HL-7702細胞的AMPK信號通路

如圖2所示，天麻粉水浸出物處理HL-7702細胞后能激活其AMPK信號通路，表現(xiàn)為p-AMPKα及其下游分子p-ACC的水平顯著增加。天麻粉水浸出物對AMPK通路的作用具有劑量依賴性（圖2A），濃度為100 μg/ml的天麻粉水浸出物處理8 h使細胞內(nèi)的p-AMPKα/AMPKα和p-ACC/ACC的比值增加，分別平均增加（0.50±0.06）和（0.43±0.05）倍，與對照細胞比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；1000 μg/ml的天麻粉水浸出物使細胞內(nèi)p-AMPKα/AMPKα和p-ACC/ ACC比值較對照細胞分別平均增加（1.32±0.17）和（1.38±0.19）倍（P＜0.01）。天麻粉水浸出物對AMPK通路的作用也具有時間依賴性（圖2B），濃度為500 μg/ml的天麻粉水浸出物處理1 h使HL-7702細胞的p-AMPKα/AMPKα和p-ACC/ACC比值較對照細胞增加，分別平均增加（1.05±0.12）和（1.11±0.13）倍，（P＜0.01），且藥物作用至少維持12 h。

圖2 天麻粉水浸出物對HL-7702細胞AMPK通路的劑量（A）和時間（B）依賴性的激活作用與對照細胞比較，*P＜0.05、**P＜0.01

如圖3所示，HL-7702細胞單加compound C可使p-AMPKα和p-ACC的基礎水平下降，與對照細胞比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。濃度為500 μg/ml的天麻粉水浸出物處理8 h可使細胞內(nèi)p-AMPKα/ AMPKα和p-ACC/ACC比值較對照細胞分別平均增加（1.28±0.17）和（1.24±0.13）倍（P＜0.01）；10 μmol/L的compound C預處理30 min并與天麻粉水浸出物共同孵育后能完全阻斷后者對AMPK通路的激活作用，使p-AMPKα/AMPKα和p-ACC/ACC比值降低到對照細胞的基礎水平，與單加天麻粉水浸出物的細胞比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。以上結(jié)果證明天麻粉水浸出物在HL-7702細胞中能激活AMPK信號通路，且其藥效能被compound C阻斷。

2.3 天麻粉水浸出物抑制HL-7702細胞內(nèi)TG蓄積作用依賴AMPK通路的激活

如圖4所示，單加compoundC對OA誘導的HL-7702細胞TG蓄積沒有任何作用，濃度為500 μg/ml的天麻粉水浸出物與OA共同孵育24 h后可使細胞內(nèi)TG平均降低（40.8±4.5）％，與單加OA細胞比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。10 μmol/L的compound C預處理30 min并與OA+天麻粉水浸出物共同孵育24 h后能完全阻斷天麻粉水浸出物減少細胞內(nèi)TG的藥效，其與OA+天麻粉水浸出物處理的細胞比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖3 compound C阻斷天麻粉水浸出物對HL-7702細胞AMPK通路的激活作用與對照細胞比較，*P＜0.05、**P＜0.01；與單加天麻粉水浸出物細胞比較，##P＜0.01

圖4 compound C阻斷天麻粉水浸出物減少OA誘導的HL-7702細胞TG蓄積的作用與對照細胞比較，***P＜0.01；與單加OA細胞比較，##P＜0.01；與OA+天麻粉水浸出物處理的細胞比較，△△P＜0.01

3 討論

本研究首次報道，天麻粉水浸出物對肝細胞AMPK的激活作用。由于AMPK主要參與調(diào)控能量代謝和物質(zhì)代謝，是治療代謝性疾病包括血脂紊亂、非酒精性脂肪肝、糖尿病和肥胖癥等的重要分子靶點［9］，因此天麻粉水浸出物對AMPK的激活作用可部分解釋其降血脂、減肥和減輕動物肝臟脂肪蓄積的藥效［2-7］。

中藥的生產(chǎn)和處理方法會對其藥效產(chǎn)生很大的影響［10-11］。由于天麻粉的主要有效成分如天麻素等易溶于水［1］，在本研究中，筆者采用水浸提的方法來處理天麻粉。有文獻報道［12］，天麻粉經(jīng)去離子水超聲浸出并濃縮后從其組分中鑒定出20多種化合物，其中包括天麻素以及多種醛類、酚類和糖苷等，與其他文獻［13］報道天麻的成分相吻合。本研究中天麻粉水浸出物中主要成分是什么以及比例尚需深入研究，另外上述成分中除天麻素外其他物質(zhì)對AMPK是否有激活作用也值得進一步研究。

除常溫水浸出之外，也有報道采用水煎［14］和乙醇浸出［15］等工藝來處理天麻。其中有報道天麻水煎劑對醋氨酚所致小鼠肝臟損傷有一定保護作用［14］。不同處理工藝是否對天麻的AMPK激活作用有影響需進一步研究。

筆者在之前的研究工作中同時采用天麻粉和天麻素來治療金黃地鼠的高脂血癥并觀察到良好的療效，其中天麻粉的最大劑量（500 mg/kg）為天麻素最大劑量（50 mg/kg）的10倍［2］。在本研究中，天麻粉水浸出物的最高濃度（1000 μg/ml）也被設計為先前報道［8］天麻素最高濃度（338.7 μmol/L，相當于100 μg/ml）的10倍。

綜上所述，本研究揭示了天麻粉水浸出物通過激活AMPK通路來抑制OA誘導的HL-7702細胞TG蓄積的藥理作用。另有文獻報道，天麻和天麻素具有降糖作用［4，16-17］，而AMPK是調(diào)節(jié)肝臟、肌肉和脂肪組織胰島素敏感性的主要分子［9，18-20］，因此天麻是否具有胰島素增敏作用及對肌肉和脂肪組織的AMPK是否有激活作用也是有意義的研究課題。

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Experimental study of inhibitory effect of Gastrodia powder aqueous extract on oleic acid-induced triglyceride accumulation in HL-7702 cell

ZUO Zeng-yan YU Bin GENG Ya-na KONG Wei-jia▲
Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing100050，China

Objective To study the inhibitory effect of Gastrodia powder aqueous extract on oleic acid（OA）-induced triglyceride（TG）accumulation in HL-7702 cell and related cellular signaling pathway.Methods 1 mmol/L of OA was used to induce cellular steatosis，Gastrodia powder aqueous extract at different concentrations were added and incubated together for 24-h for determination of intracellular TG content.In Western blot experiment，cells were treated with Gastrodia powder aqueous extract as indicated，phosphorylation level of AMP-activated protein kinase α（AMPKα）as well as acetyl coA carboxylase（ACC）were determined.In experiment using compound C，cells were pretreated with 10 μmol/L of compound C for 30-min and then Gastrodia powder aqueous extract was added.After 8-h of incubation，Western blot was performed.Alternatively，the cells were treated with OA+Gastrodia powder aqueous extract for 24 h after compound C pretreatment，intracellular TG contents were then assayed.Results Compared with that of control cell，the intracellular TG content increased for about（4.0±0.5）fold in HL-7702 cell after 24-h of OA incubation（P＜0.01）.Gastrodia powder aqueous extract could decrease intracellular TG in a dose-dependent manner.Administration of Gastrodia powder aqueous extract could activate the AMPK pathway dose and time dependently in HL-7702 cell，as indicated by the obvious increase of phosphorylated AMPK α（p-AMPKα）as well as phosphorylated ACC（p-ACC）level.When the cells were pretreated with compound C and incubated with Gastrodia powder aqueous extract，the stimulating activity of Gastrodia powder aqueous extract on AMPK pathway and its reducing effect on intracellular TG accumulation were completely blocked.Conclusion Gastrodia powder aqueous extract inhibits OA-induced TG accumulation greatly in HL-7702 cell，and this inhibitory effect depends on the activation of AMPK pathway in cells.

Gastrodia powder；Aqueous extract；HL-7702 cell；Oleic acid；Triglyceride；AMP-activated protein kinase

R965

A

1674-4721（2015）05（a）-0012-05

2015-01-16 本文編輯：李亞聰）

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項項目（IMBF20060505）

左增艷（1962-），女，副主任技師，主要研究方向：微生物與生化藥學

▲通訊作者