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鹽酸-乙二醇-水介質(zhì)高效預(yù)處理山核桃殼及其糖化工藝

張守雷，何玉財(cái)，紀(jì)俊玲，陳群

（常州大學(xué)石油化工學(xué)院，江蘇常州213164）

摘要：為了提高木質(zhì)纖維素的酶解效率，采用鹽酸輔助乙二醇對(duì)山核桃殼進(jìn)行預(yù)處理。通過油浴的處理方式優(yōu)化得出的最佳預(yù)處理?xiàng)l件為：處理介質(zhì)為鹽酸-乙二醇-水（1.2%∶88.8%∶10%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的混合物，預(yù)處理溫度為130℃，預(yù)處理時(shí)間為30min。為了減小預(yù)處理的溫度和時(shí)間，采用微波輻射的輔助預(yù)處理，最佳預(yù)處理?xiàng)l件為：微波輻射溫度100℃，微波輻射時(shí)間5min，微波輻射功率200W。糖化預(yù)處理后的山核桃殼經(jīng)水解72h后，其還原糖產(chǎn)率可達(dá)到88.6%（油浴）和74.2%（微波）。利用電鏡（SEM）和紅外光譜（FT-IR）分析油浴和微波預(yù)處理后的山核桃殼，可以發(fā)現(xiàn)山核桃殼緊密的結(jié)構(gòu)遭到破壞，變成更加易于酶解的松散、多孔結(jié)構(gòu)，增加了酶可及度，因此很大程度上提高了糖化率。可見，鹽酸-乙二醇-水溶液高效預(yù)處理可以提高山核桃殼酶解糖化的效率。

關(guān)鍵詞：山核桃殼；乙二醇；鹽酸；預(yù)處理；優(yōu)化；酶解

第一作者：張守雷（1988—），男，碩士研究生。聯(lián)系人：紀(jì)俊玲，博士，教授。E-mail jijunling@vip.163.com。

山核桃的果肉具有獨(dú)特的口感風(fēng)味及極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且產(chǎn)量較大。然而殘留的山核桃殼常常被人們當(dāng)作垃圾廢棄物進(jìn)行處理，山核桃殼直接丟棄或焚燒不僅污染環(huán)境而且難以降解，也造成資源的浪費(fèi)。如何有效地利用山核桃殼以及其他的一些農(nóng)林廢棄物，使之轉(zhuǎn)化為生物燃料或者其他有應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)品，是目前研究的熱點(diǎn)之一[1-7]。

眾所周知，纖維素和半纖維素被木質(zhì)素包裹較難降解，纖維素的結(jié)晶度較高，且分子內(nèi)與分子間存在著大量的氫鍵，這些對(duì)生物的降解產(chǎn)生了一定的抑制作用[8]。因此，對(duì)纖維素原料進(jìn)行高效預(yù)處理就顯得尤為重要。目前纖維素原料預(yù)處理方法主要包括物理法、化學(xué)法、生物法[9-10]以及這些方法的組合等。近些年來，由于離子液體不易揮發(fā)、穩(wěn)定性好且無毒環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，作為一種綠色溶劑對(duì)預(yù)處理的高效性引起了許多專家學(xué)者的關(guān)注，然而離子液體的成本相對(duì)較高且不易回收，導(dǎo)致其應(yīng)用受限。而高沸醇溶劑預(yù)處理法[11]有著顯著的優(yōu)越性，高沸醇不僅對(duì)木質(zhì)素的溶解性較好，并且對(duì)設(shè)備的腐蝕性低。溶劑在使用的過程中可循環(huán)使用，預(yù)處理操作條件簡(jiǎn)單，預(yù)處理后溶液中的木質(zhì)素容易分離再利用。王景全等[12]利用高沸醇法對(duì)甘蔗渣進(jìn)行了預(yù)處理，研究了木質(zhì)素和碳水化合物在此過程中的溶出規(guī)律。高沸醇溶劑法已經(jīng)在多種纖維素原料的預(yù)處理及木質(zhì)素的提取中使用，但是在預(yù)處理過程中高沸點(diǎn)醇的使用量過大，需要進(jìn)一步降低其用量。

為了提高預(yù)處理的效率，無機(jī)酸應(yīng)用于纖維素原料的預(yù)處理[13-16]。常用的無機(jī)酸為鹽酸、硫酸和磷酸（HCl、H2SO4和H3PO4）[14-15]。然而，高濃度的HCl、H2SO4和H3PO4對(duì)設(shè)備的腐蝕性較強(qiáng)，稀酸預(yù)處理可避免這一問題，并且可避免產(chǎn)生發(fā)酵抑制劑。稀酸可脫除半纖維素和木質(zhì)素，已應(yīng)用于輔助預(yù)處理改善生物質(zhì)酶水解效率。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，高沸點(diǎn)醇甘油和乙二醇可作為預(yù)處理試劑進(jìn)行纖維素原料的預(yù)處理。與甘油相比，乙二醇的黏度較低，并且纖維素原料可溶于乙二醇形成糖苷然后液化，從而達(dá)到纖維素原料的預(yù)處理。為了實(shí)現(xiàn)山核桃殼的高值化利用，本研究采用稀酸輔助乙二醇體系對(duì)山核桃殼進(jìn)行預(yù)處理，不僅能夠減少預(yù)處理體系中有機(jī)溶劑的用量和降低體系的黏度，而且能夠?qū)崿F(xiàn)纖維素原料的高效預(yù)處理及糖化[17-18]。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要原料和試劑

山核桃殼來自浙江省臨安市，用蒸餾水洗干凈后于95℃烘箱干燥，用粉碎機(jī)將其打碎后的平均粒徑為0.3mm，將其置于樣品袋中儲(chǔ)存以備用。

纖維素酶（Spezyme CP Cellulase）購(gòu)自Sigma(St.Louis，MO)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

離心機(jī)TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外可見分光光度計(jì)GD6309007，上海棱光技術(shù)有限公司；高效液相色譜儀1515型，美國(guó)Waters。

1.3鹽酸-乙二醇-水體系預(yù)處理

1.3.1油浴加熱預(yù)處理

一定量的乙二醇、鹽酸和水于100mL三口燒瓶中，混合均勻后，再加入干燥的山核桃殼（液、固比為20mL∶1g，下同），在30～150℃條件下機(jī)械攪拌進(jìn)行油浴加熱處理，反應(yīng)0～50min后停止加熱，加入等體積的蒸餾水進(jìn)行纖維素原料的再生，攪拌10min。再生后，加入蒸餾水洗滌再生的纖維素原料3次，烘干待用。

1.3.2微波輔助預(yù)處理

鹽酸-乙二醇-水（1.2%∶88.8%∶10%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）于100mL三口燒瓶中，混合均勻后，再加入干燥的山核桃殼，在30～110℃和0～300W條件下微波輔助處理，反應(yīng)0～6min。反應(yīng)完畢，加入蒸餾水洗滌再生的纖維素原料3次，烘干待用。

1.4酶解糖化

在50mL錐形瓶中，分別加入0.050mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH=4.8）10mL，纖維素酶(30 FPU/g底物），山核桃殼殘?jiān)鼭舛葹?0g/L，在50℃、160r/min的恒溫?fù)u床中振蕩反應(yīng)。以未處理的山核桃殼殘?jiān)腔鲗?duì)照。于不同糖化反應(yīng)時(shí)間取200μL反應(yīng)液，進(jìn)一步分析糖濃度。

1.5糖化液分析方法

1.5.1分光光度法測(cè)定還原糖濃度

取100μL上清糖化液與1.5mL 3,5-二硝基水楊酸溶液混合于試管中，進(jìn)一步沸水浴反應(yīng)5min，冷卻后再向試管中加入蒸餾水5mL。充分混勻后，于520nm波長(zhǎng)下用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行比色分析。

1.5.2高效液相色譜法測(cè)定葡萄糖濃度

采用BreezeTM2系列高效液相色譜儀分析糖化液中葡萄糖的含量；色譜柱型號(hào)為Aminex?HPX-87H柱（Bio-Rad，美國(guó)），泵為1515型；示差折光檢測(cè)器為2414型；柱溫65℃，流動(dòng)相5mmol/L H2SO4，流速0.6mL/min；進(jìn)樣量20μL。1.5.3還原糖和葡萄糖產(chǎn)率計(jì)算

還原糖及葡萄糖產(chǎn)率計(jì)算公式見式（1）、式（2）。

2　結(jié)果與討論

2.1油浴加熱預(yù)處理的優(yōu)化

2.1.1酸種類對(duì)預(yù)處理的影響

在油浴溫度為130℃條件下，乙二醇含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）為88.8%，水含量為10%，無機(jī)酸（HCl、H2SO4和H3PO4）含量為1.2%，對(duì)山核桃殼進(jìn)行預(yù)處理30min。糖化結(jié)果如表1所示還原糖產(chǎn)率為酶解72h的結(jié)果。與未處理的山核桃殼相比，經(jīng)酸處理之后，其糖化活性明顯增加，HCl輔助乙二醇預(yù)處理與H2SO4和H3PO4輔助乙二醇相比糖化活性更高。原因可能是Cl?的電負(fù)性比SO42?和PO43?強(qiáng)，容易與纖維素分子形成氫鍵，能夠破壞纖維素分子間或分子內(nèi)的氫鍵，提高其糖化活性[19]。

2.1.2預(yù)處理溫度和時(shí)間對(duì)預(yù)處理過程的影響

在預(yù)處理時(shí)間為30min的條件下，乙二醇含量為88.8%，水含量為10%，HCl含量為1.2%，考察預(yù)處理溫度（30～150℃）對(duì)糖化活性的影響，結(jié)果如圖1(a)所示，預(yù)處理溫度為130℃時(shí)還原糖產(chǎn)率最高。當(dāng)溫度低于130℃，隨著溫度的升高，木質(zhì)素在乙二醇中的溶解能力增強(qiáng)，能更好地分解半纖維素[20]，使纖維素的酶解效率提高；當(dāng)溫度高于130℃，隨著溫度的升高山核桃殼中的纖維素可能發(fā)生轉(zhuǎn)化，使纖維素含量降低。因此，過高的溫度使還原糖產(chǎn)率下降。可見，最適預(yù)處理溫度為130℃。

表1不同的無機(jī)酸對(duì)預(yù)處理的影響

在預(yù)處理溫度為130℃條件下，乙二醇含量為88.8%，水含量為10%，HCl含量為1.2%，考察不同預(yù)處理時(shí)間（0～50min）對(duì)糖化活性的影響，結(jié)果如圖1(b)所示。預(yù)處理時(shí)間低于30min時(shí)，隨著時(shí)間的增加，山核桃殼殘?jiān)奶腔钚灾饾u提高；當(dāng)預(yù)處理時(shí)間高于30min，其糖化活性開始下降?？赡艿脑蚴牵S著預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，山核桃殼殘?jiān)械哪举|(zhì)素和半纖維素不斷地溶解于溶液中，同時(shí)Cl?與纖維素分子能夠形成氫鍵，從而導(dǎo)致纖維素分子內(nèi)和分子間的氫鍵被破壞，使得山核桃殼的糖化活性變大[21]。因此，最適預(yù)處理時(shí)間為30min。

2.1.3HCl濃度和水含量對(duì)預(yù)處理過程的影響

圖1　預(yù)處理溫度和時(shí)間對(duì)山核桃殼糖化活性的影響

在預(yù)處理時(shí)間為30min、預(yù)處理溫度為130℃和體系含水量為10%的條件下，考察HCl濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）對(duì)山核桃殼糖化活性的影響，結(jié)果如圖2(a)所示。結(jié)果表明，HCl最適添加濃度為1.2%。鹽酸-乙二醇預(yù)處理山核桃殼中加入乙二醇可溶解木質(zhì)素，而鹽酸可分解半纖維素。Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)木質(zhì)纖維素在磷酸作用下，結(jié)構(gòu)從緊密狀轉(zhuǎn)變?yōu)榕蛩蔂?，提高其酶解率?/p>

在預(yù)處理時(shí)間為30min、預(yù)處理溫度為130℃和鹽酸濃度為1.2%的條件下，進(jìn)一步考察體系含水量（5%～20%）對(duì)山核桃殼糖化活性的影響，結(jié)果如圖2(b)所示。當(dāng)體系含水量為5%～10%時(shí)，糖化活性開始逐漸增加，當(dāng)體系含水量高于10%以后其糖化活性開始下降?？赡艿脑蚴?，水可以降低體系的黏度，增加纖維素的溶解能力。隨著水含量增加，過量的水使乙二醇的濃度下降，從而導(dǎo)致纖維素的溶解能力減弱。因此，選擇的最適體系含水量為10%[23]。

可見，最適的預(yù)處理體系為鹽酸-乙二醇-水(1.2%∶88.8%∶10%)，采用油浴加熱預(yù)處理，最適的預(yù)處理溫度和時(shí)間分別為130℃和30min。糖化72h，油浴處理的山核桃殼還原糖產(chǎn)率為88.6%（圖2）。

圖2　預(yù)處理體系酸濃度和含水量對(duì)山核桃殼糖化活性的影響

2.2微波輔助預(yù)處理山核桃殼

微波輔助預(yù)處理作為一種方便且清潔的方式廣泛地被應(yīng)用。微波輔助處理能夠?qū)崿F(xiàn)在較低的溫度和較短的時(shí)間內(nèi)高效反應(yīng)[24]。本研究以鹽酸-乙二醇-水（1.2%∶88.8%∶10%）為預(yù)處理介質(zhì)，采用微波輔助預(yù)處理，并對(duì)預(yù)處理溫度（30～110℃）、預(yù)處理時(shí)間（0～6min）以及微波功率（0～300W）進(jìn)行優(yōu)化。

圖3　預(yù)處理溫度、微波輻射時(shí)間和輻射功率對(duì)山核桃殼預(yù)處理的影響

在預(yù)處理時(shí)間為5min、微波功率為200 W的條件下，考察預(yù)處理溫度（30～110℃）對(duì)糖化活性的影響，結(jié)果如圖3(a)所示。當(dāng)微波輻射溫度小于100℃時(shí)，還原糖產(chǎn)率隨著預(yù)處理溫度的提高逐漸增加；當(dāng)溫度超過100℃后，還原糖產(chǎn)率開始下降?？赡艿脑蚴且叶寂c鹽酸的混合溶液在預(yù)處理溫度較低時(shí)黏度較大，流動(dòng)性差，乙二醇擴(kuò)散慢，影響纖維素的溶解。隨著預(yù)處理溫度的提高，乙二醇擴(kuò)散較快，能夠促進(jìn)木質(zhì)素在乙二醇中的溶解。當(dāng)預(yù)處理溫度超過100℃時(shí)，還原糖產(chǎn)率開始降低，可能是因?yàn)樵跍囟冗^高時(shí)部分纖維素進(jìn)行了降解。因此，最適微波輻射溫度為100℃。

在預(yù)處理溫度為100℃、微波功率為200W的條件下，考察預(yù)處理時(shí)間（0～6min）對(duì)糖化活性的影響，結(jié)果如圖3(b)可知。隨著時(shí)間的增加，還原糖產(chǎn)率上升，當(dāng)加熱時(shí)間為5min時(shí)，還原糖產(chǎn)率達(dá)到最大，5min后，還原糖產(chǎn)率開始下降。可能的原因是微波輻射時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致纖維素組分被降解，從而影響了還原糖產(chǎn)率。因此，最適微波輻射時(shí)間為5min。

在預(yù)處理溫度為100℃、預(yù)處理時(shí)間為5min的條件下，考察微波功率（0～300W）對(duì)糖化活性的影響，結(jié)果如圖3(c)所示。當(dāng)微波輻射功率為200W時(shí)，還原糖產(chǎn)率達(dá)到最高，超過200W后，隨著微波輻射功率的增加，還原糖產(chǎn)率開始下降?？赡苁且?yàn)槲⒉üβ瘦^高時(shí)，加速了纖維素的分解[25-27]。因此，最適微波輻射功率為200W。

綜上，以鹽酸-乙二醇-水（1.2%∶88.8%∶10%）為預(yù)處理介質(zhì)，采用微波輻射預(yù)處理，最適的預(yù)處理溫度、預(yù)處理時(shí)間和微波輻射強(qiáng)度分別為100℃、5min和200W。糖化72h，微波輻射輔助預(yù)處理的山核桃殼還原糖產(chǎn)率為74.2%。

2.3預(yù)處理山核桃殼前后掃描電鏡和紅外分析

通過掃描電鏡圖（圖4）分析山核桃殼在處理前后表面的變化。與表面平滑的未處理山核桃殼相比，經(jīng)過油浴和微波處理后的山核桃殼的表面比較粗糙，且多孔。這就說明與結(jié)晶度較高的未處理山核桃殼相比，處理后的山核桃殼聚合度下降，內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得山核桃殼的溶解性提高，從而提高酶解效率。

通過紅外譜圖（圖5）分析山核桃殼在處理前后結(jié)構(gòu)的變化。根據(jù)譜圖可以發(fā)現(xiàn)：O—H伸縮振動(dòng)峰是3400cm?1，經(jīng)過預(yù)處理后，峰的強(qiáng)度變?nèi)?，說明—OH被破壞，從而引起氫鍵的斷裂。半纖維素的吸收峰為1735cm?1，預(yù)處理后峰的吸收強(qiáng)度變?nèi)?；木質(zhì)素的吸收峰是1509cm?1和1633cm?1，預(yù)處理后峰的吸收強(qiáng)度也變?nèi)趿?，說明山核桃殼半纖維素產(chǎn)生分解，且木質(zhì)素被溶解，同時(shí)山核桃殼半纖維素和木質(zhì)素之間的連接結(jié)構(gòu)被破壞。經(jīng)過鹽酸-乙二醇-水預(yù)處理后，山核桃殼的結(jié)構(gòu)遭到破壞，由于半纖維素和木質(zhì)素的脫除，導(dǎo)致山核桃殼纖維素充分暴露出來，進(jìn)一步提高了山核桃殼糖化酶解效率。

圖4　山核桃殼預(yù)處理前后掃描電鏡圖比較

圖5　山核桃殼預(yù)處理前后紅外圖譜比較

2.4糖化進(jìn)程

進(jìn)一步利用鹽酸-乙二醇-水（1.2%∶88.8%∶10%）預(yù)處理體系分別采用油浴和微波輻射輔助的最適條件下預(yù)處理山核桃殼，酶解糖化結(jié)果如圖6所示。山核桃殼經(jīng)過油浴和微波預(yù)處理后，隨著糖化時(shí)間的延長(zhǎng)，糖的產(chǎn)率都逐漸增加，當(dāng)糖化時(shí)間達(dá)到72h時(shí)，酶解反應(yīng)基本平衡，糖化率接近達(dá)到最大值。油浴加熱預(yù)處理山核桃殼的還原糖和葡萄糖產(chǎn)率分別為88.6%和71.2%，而微波輻射輔助預(yù)處理山核桃殼的還原糖和葡萄糖產(chǎn)率分別為74.2% 和63.0%。繼續(xù)糖化到96h，還原糖和葡萄糖的產(chǎn)率變化不明顯?？梢?，微波輔助處理后的山核桃殼比油浴處理后的山核桃殼的糖化效果略低，但是油浴預(yù)處理方式相對(duì)微波輔助處理方式所需時(shí)間較長(zhǎng)。兩種預(yù)處理方法的還原糖化率均可達(dá)到74%以上。

圖6　糖化進(jìn)程

3　結(jié)論

本工作首次利用一種高效的鹽酸輔助乙二醇體系對(duì)山核桃殼殘?jiān)M(jìn)行預(yù)處理，實(shí)現(xiàn)其高效糖化。經(jīng)優(yōu)化，最適的預(yù)處理體系為鹽酸-乙二醇-水（1.2%∶88.8%∶10%），最適的預(yù)處理（油?。囟群蜁r(shí)間分別為130℃和30min，而微波處理的最適溫度是100℃，時(shí)間是5min，最佳功率是200W。預(yù)處理的山核桃殼殘?jiān)腔?2h，油浴加熱預(yù)處理的山核桃殼的還原糖和葡萄糖產(chǎn)率分別為88.6%和71.2%；而微波輻射輔助處理的山核桃殼的還原糖和葡萄糖產(chǎn)率略低，分別為74.2%和63.0%。優(yōu)化的預(yù)處理體系可以減小溶液的黏度和溶劑的用量，為山核桃殼等農(nóng)林廢棄物纖維素原料的高效預(yù)處理提供了新思路。該方法進(jìn)一步說明了鹽酸-乙二醇-水預(yù)處理纖維素原料的高效性，具有潛在的應(yīng)用前景。

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應(yīng)用技術(shù)

Effective pretreatment of hickory shell with hydrochloric acid-ethylene glycol-water media and its saccharification

ZHANG Shoulei，HE Yucai，JI Junling，CHEN Qun

（School of Petrochemical Engineering，Changzhou University，Changzhou 213164，Jiangsu，China）

Abstract：To improve the enzymatic saccharification of lignocellulosic biomass，ethylene glycol assisted with hydrochloric acid was used for pretreating hickory shell in this study.After the optimization in oil-bath system，the optimal pretreatment condition was obtained as following：the pretreatment media was hydrochloric acid-ethylene glycol-water(1.2%∶88.8%∶10%，mass ratio)，pretreatment temperature 130℃，and pretreatment time 30min.In order to reduce the pretreatment temperature and time，microwave radiation was employed to assist the pretreatment with hydrochloric acid-ethylene glycol-water(1.2%∶88.8%∶10%，mass ratio)media，and the optimal pretreatment condition was achieved as following：microwave radiation temperature 100℃，microwave radiation time 5min，and microwave radiation power 200W.These results showed that the saccharification rate of pretreated hickory shell was higher than that of untreated one.After the pretreatment with oil-bath and microwave radiation，the reducing sugar yield from the enzymatic hydrolysis could reach 88.6%(oil bath)and 74.2%(microwave)after 72h.By using electron microscopy(SEM)and infrared spectroscopy(FT-IR)analysis，the structure of pretreated hickory shell was destroyed，the structure became loose，and porous were easier to be enzymatically hydrolyzed，which increased the enzyme accessibility，thereby greatly improving the saccharification rate.Therefore，the pretreatment withbook=8,ebook=283hydrochloric acid-ethylene glycol-water solution can improve the efficiency of the enzymatic saccharification of hickory shell.

Key words：hickory shell；ethylene glycol；hydrochloride acid；pretreatment；optimization；enzymatic hydrolysis

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（21102011）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20141172）及江蘇省科技支撐計(jì)劃（BE2014622）項(xiàng)目。

收稿日期：2014-12-24；修改稿日期：2015-01-24。

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2015.08.045

文章編號(hào)：1000–6613（2015）08–3188–07

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號(hào)：Q 93；X 703