劉世君 田友清 丁平 等

摘要：為了優(yōu)選煙草（Nicotiana tabacum L.）提取物最佳提取方法，采用高效液相色譜法測定了不同條件下超聲波制備的煙草提取物。結(jié)果表明，在色譜柱為Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-磷酸緩沖液（1∶9），檢測波長為259 nm的條件下，通過測定和比較煙草在不同溶劑（水、甲醇）、不同提取時間、不同NaOH濃度、不同超聲波頻率、不同品種條件下的特征色譜峰情況及參照峰煙堿含量，篩選出以0.5%NaOH水溶液，40 kHz超聲波提取30 min為煙草提取物最佳制備工藝，且選擇紅花煙葉較好，為制備煙草提取物和煙草煙油替代品奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：煙草（Nicotiana tabacum L.）；煙堿；指紋圖譜；高效液相色譜

中圖分類號：S572 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）20-5108-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.046

Comparison on Fingerprints of Tobacco Extracts from Different Extraction Processes

LIU Shi-jun1，TIAN You-qing1，2，DING Ping1，ZHANG Yun-qing1

（1.Lianyungang TCM Branch， Jiangsu Union Technical Institute， Lianyungang 222007， Jiangsu， China；

2.Lianyungang Common Technological Center for Drug Research and Development， Lianyungang 222007， Jiangsu， China）

Abstract： In order to select the best method for extracting tobacco， the method of HPLC was applied to assay the HPLCs of tobacco extracts from different extraction conditions in ultrasonic process. The results showed that： Under the condition that the separation was performed on a Inertsil ODS-SP column（4.6 mm×250 mm， 5 μm） with a mobile phase consisting of methanol and phosphate buffer solution （1∶9） and the detection was carried out on a UV detector at 259 nm， the characteristic fingerprints and nicotine content of reference peaks in the conditions of different solvent（water or methol）， time of extraction， NaOH concentration， ultrasonic frequency and source（Tongliao or Lianyungang） were assayed and compared. The selected process was tobacco extracted with ultrasonic wave at 40 kHz for 30 min in water with 0.5% NaOH， and the tobacco from Nicotiana tabacum L. was better， which provides basis for the preparation tobacco extraction and tobacco oil alternative.

Key words： tobacco（Nicotiana tabacum L.）； nicotine； fingerprint； HPLC

.煙草（Nicotiana tabacum L.）為茄科煙草屬一年生或有限多年生草本植物，全世界有60多種，其中紅花煙草（Nicotiana X sanderae）和黃花煙草（Nicotiana rustica L.）為制造卷煙和煙絲的主要品種。煙草在民間除了主要用于吸食外，還作為藥物治療多種疾病[1，2]。如用煙油（煙草被煙客用煙斗常年抽吸后，在煙桿內(nèi)積存的煙膏油）治療蛇蟲咬傷、惡瘡、頑癬等[3]療效顯著，尤其對帶狀皰疹更是作用獨(dú)特[4]。

為了將煙草開發(fā)成治療帶狀皰疹的藥物，以民間煙油為參照，以指紋圖譜為指標(biāo)，通過提取工藝篩選，發(fā)現(xiàn)超聲波法能較好地體現(xiàn)煙油的成分特征。為了進(jìn)一步優(yōu)化超聲波法提取工藝，試驗擬通過比較不同溶劑、提取時間、NaOH濃度、超聲波頻率、品種來源的煙草提取物特征性指紋圖譜及煙堿提取情況，篩選出較佳的煙草提取物制備條件，旨在為制備煙草提取物和煙草煙油替代品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 煙堿標(biāo)準(zhǔn)品（批號為54-11-5，純度98%），購自南京春秋生物工程有限公司；甲醇為色譜純，購自德國默克公司；氫氧化鈉為分析純，購自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；三乙胺為分析純，購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；磷酸為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉，購自上海雅貝科技有限公司；水為純凈水，購自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.1.2 煙油及煙草樣品 煙草A，購自內(nèi)蒙古通遼市木里圖鎮(zhèn)唐家集市，經(jīng)丁平副教授鑒定為茄科煙草屬植物黃花煙草的干燥全草；煙草B，購自連云港海州廟會市場，產(chǎn)于山東臨沂，經(jīng)丁平副教授鑒定為茄科煙草屬植物紅花煙草的干燥全草。

1.1.3 儀器 LC-2010型高效液相色譜儀（包括SIL-10ADvp自動進(jìn)樣器、LC-10ADvp輸液泵、CTO-10Avp 柱溫箱、SPD-10Avp 紫外-可見檢測器和LCsolution數(shù)據(jù)處理軟件）（日本島津公司）；XS105DU型電子天平（瑞典Mettler toledo）；DL-180A型超聲波振蕩器（上海之信儀器有限公司）；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-SP色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：甲醇-磷酸緩沖液（1∶9），檢測波長：259 nm，柱溫：35 ℃，流速：0.8 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.2 溶液制備 取煙堿標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成含煙堿2.16 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；取干燥煙葉1.0 g，碾碎，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，加入甲醇（或水）、NaOH，浸泡1 h后，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾即得。

1.2.3 參照峰的選擇 煙草提取物最多可檢測出7個色譜峰，其中共有峰有4個，選擇峰面積較大且穩(wěn)定、峰分離度較好、在5.2 min左右出現(xiàn)的煙堿色譜峰作為參照峰。

1.2.4 煙堿線性關(guān)系考察 將上述煙堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次稀釋為2.920 0、1.460 0、0.730 0、0.3650 0、0.182 5、 0.091 25 mg/mL等不同濃度，依照HPLC檢測條件進(jìn)行測定，以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為：Y=1×107X +696 218，r=0.999 6。結(jié)果表明，煙堿標(biāo)準(zhǔn)品在0.091 25～2.920 0 mg/mL線性關(guān)系良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑的煙草指紋圖譜比較

分別以甲醇和水為溶劑，加入NaOH 0.20 g（終濃度為1%），超聲波提取30 min，所得煙草提取物HPLC見圖1。由圖1可知，水提取物主要特征峰有7個，甲醇提取物主要特征峰有5個，其中4個（峰1、3、5、6）為二者共有。以煙堿（峰3）為參照，水提取物煙堿平均含量為4.11%（以干燥煙草量計，下同），甲醇提取物煙堿平均含量為1.76%，二者差異極顯著（P<0.001），故以水為溶劑優(yōu)于甲醇。

2.2 不同提取時間的煙草指紋圖譜比較

以水為溶劑，加入NaOH 0.20 g（終濃度為1%），分別超聲波提取30、60、90 min，所得煙草提取物HPLC見圖2。由圖2可知，不同提取時間所得提取物主要特征峰均為7個。以煙堿（峰3）為參照，30、60、90 min煙草提取物煙堿平均含量分別為4.11%、4.00%、3.92%，三者間無顯著差異（P>0.05）。從節(jié)約時間和能源考慮，選擇超聲波提取30 min。

2.3 不同NaOH濃度的煙草指紋圖譜比較

以水為溶劑，分別加入NaOH 0.20 g和0.1 g（終濃度分別為1%和0.5%），超聲波提取30 min，所得煙草提取物HPLC見圖3。由圖3可知，含1%NaOH提取物主要特征峰有7個，含0.5%NaOH提取物主要特征峰有6個，其中峰1，2，3，4，5，6為二者共有。以煙堿（峰3）為參照，含1%和0.5%NaOH煙草提取物煙堿平均含量分別為4.11%和4.05%，兩者間無顯著差異（P>0.05）。因pH過高會影響色譜柱使用及后續(xù)制劑的藥效，選擇以含0.5%NaOH進(jìn)行提取。

2.4 不同超聲波頻率的煙草指紋圖譜比較

以水為溶劑，加入NaOH 0.20 g（終濃度為1%），以超聲波頻率40 kHz和59 kHz提取30 min，所得煙草提取物HPLC見圖4。由圖4可知，不同頻率超聲波提取物主要特征峰均為7個。以煙堿（峰3）為參照，40、59 kHz超聲波煙草提取物煙堿平均含量分別為3.92%和3.91%，兩者間無顯著差異（P>0.05）。考慮到超聲波頻率越低，穿透力越強(qiáng)，選擇以40 kHz超聲波頻率進(jìn)行提取。

2.5 不同品種煙草指紋圖譜比較

取煙草A和煙草B，分別加入NaOH 0.20 g（終濃度為1%），以超聲波頻率40 kHz提取30 min，所得煙草提取物HPLC見圖5。由圖5可知，不同產(chǎn)地?zé)煵萏崛∥镏饕卣鞣逵幸欢ú顒e，其中煙草B比煙草A多一個色譜峰（峰7）。以煙堿（峰3）為參照，煙草A提取物煙堿平均含量為3.83%，煙草B提取物煙堿平均含量為4.00%，兩者間無顯著性差異（P>0.05）。綜合考慮其他特征峰及面積，以煙草B為優(yōu)選。

2.6 指標(biāo)測定

2.6.1 精密度試驗 吸取同一批次供試品溶液10 μL（煙草水提取物），按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，并計算各特征指紋峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各特征指紋峰的相對保留時間的RSD在0.95%～1.28%，相對峰面積的RSD在0.86%～1.56%，均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批次供試品溶液10 μL（煙草水提取物），分別在0、4、8、12、24 h 按上述色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，并計算各特征指紋峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各特征指紋峰的相對保留時間的RSD在0.56%～1.86%，相對峰面積的RSD在0.76%～1.56%，均小于2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3 重復(fù)性試驗 制備同一批次5份煙草水提取物，按上述色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，并計算各特征指紋峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各特征指紋峰的相對保留時間的RSD在0.58%～1.48%，相對峰面積的RSD在0.78%～1.82%，均小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。

3 小結(jié)與討論

指紋圖譜作為天然藥物或植物提取混合物群質(zhì)量控制的一種方法，現(xiàn)已得到廣泛應(yīng)用，并已成為國際共識。近年來，指紋圖譜技術(shù)在煙草行業(yè)中的應(yīng)用研究已取得長足進(jìn)展，相關(guān)報道也逐漸增多[5]。本試驗為了篩選煙草提取物制備工藝，以制備出與民間煙草煙油具有相似物質(zhì)基礎(chǔ)的煙草提取物，通過采用高效液相色譜法，比較了煙草在不同溶劑、不同提取時間、不同NaOH濃度、不同超聲波頻率、不同品種等條件下的特征色譜峰情況及參照峰煙堿含量，發(fā)現(xiàn)煙草超聲波水提物特征色譜峰數(shù)較甲醇提取物多，尤其是煙堿含量二者差異極顯著，而與超聲波提取時間、NaOH濃度、超聲波頻率和品種來源等因素關(guān)系不大。綜合考慮煙堿提取效率、指紋圖譜峰數(shù)、操作方便、節(jié)約能源和時間、對色譜柱使用及后續(xù)制劑藥效影響等因素，煙草提取物制備以水為溶劑、加入0.5%NaOH、40 kHz超聲波提取30 min為最佳工藝，而煙草品種以紅花煙草為優(yōu)，即農(nóng)民種植的旱煙。

煙堿為煙草中的主要有效成分，具有廣泛的藥理作用[6]，故本試驗選擇其作為參照峰。由于煙堿的極性較大，根據(jù)相似相溶原理，極性較大的溶劑提取率較高，同時煙堿在堿性水相中為游離態(tài)，增加了它的溶解度，因此用含0.5%NaOH的水作為溶劑優(yōu)于甲醇，與文獻(xiàn)報道相一致[7，8]。如果不加NaOH，就很難檢測出煙堿，由于進(jìn)樣體積小，且流動相為甲醇-磷酸緩沖溶液，pH偏高一些對色譜柱影響并不大。

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