扶文君，袁麗紅

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800）

離體培養(yǎng)藏紅花細(xì)胞合成的藏紅花色素穩(wěn)定性

扶文君，袁麗紅

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800）

研究pH、溫度、光照、氧化劑、還原劑、食品添加劑和金屬離子對(duì)離體培養(yǎng)的藏紅花細(xì)胞合成的藏紅花色素穩(wěn)定性的影響，并與藏紅花柱頭色素進(jìn)行比較。結(jié)果表明：藏紅花細(xì)胞合成的色素與柱頭色素均為水溶性色素，呈亮黃色，對(duì)食品添加劑（食鹽、檸檬酸、蔗糖、苯甲酸鈉）和H2O2表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。與柱頭色素相比，藏紅花細(xì)胞合成的色素對(duì)強(qiáng)酸（pH 1）、高溫（80、100℃）和光照（日光燈光、紫外光）表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，對(duì)VC和Cu2+（0.001 mol/L）的穩(wěn)定性略差。稀堿溶液（0.47 mol/L Na2CO3、0.1 mol/L NaOH）、Na2SO3、Fe2+（0.050 mol/L）和Fe3+能使細(xì)胞合成的色素色強(qiáng)增強(qiáng)。

藏紅花；藏紅花色素；離體培養(yǎng)；穩(wěn)定性

藏紅花（Crocus sativus L.）又名番紅花、西紅花，為鳶尾科植物，由于藏紅花柱頭中主要成分藏紅花苷（crocin）具有較好的水溶性和極強(qiáng)的著色力，藏紅花醛（safranal）具有獨(dú)特的香味，因此，藏紅花可作為珍貴的調(diào)味劑、香料和染料［1-2］。近年來(lái)，研究人員通過(guò)醫(yī)藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)藏紅花在抗腫瘤［3］、免疫調(diào)節(jié)［4］、治療心腦血管系統(tǒng)疾?。?］和抗抑郁［6］等方面亦具有良好功效。

植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立和發(fā)展為解決藏紅花資源短缺提供了一條有效途徑。國(guó)內(nèi)外已開展藏紅花細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藏紅花色素的研究，并取得了一定進(jìn)展。陳書安、Dufreshe等［7］和孟風(fēng)來(lái)等［6-8］對(duì)藏紅花細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)20 d后細(xì)胞生物量為12.3g/L（以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì)），28 d藏紅花素含量和產(chǎn)量分別為95.8mg/g和0.92g/L。Dufresne等［7］利用藏紅花細(xì)胞葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase）進(jìn)行藏紅花酸（crocetin）糖基化，在培養(yǎng)12 d的100mL細(xì)胞培養(yǎng)物中加入30mg藏紅花酸，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)4 d可轉(zhuǎn)化形成9mg/g藏紅花酸糖酯。

藏紅花色素在貯存中受到環(huán)境中溫度、pH和光照等因素的干擾，直接影響色素的藥用價(jià)值。而藏紅花色素的主要成分為藏紅花苷、藏紅花苦素、藏紅花醛和一些類胡蘿卜素類物質(zhì)。其中，類胡蘿卜素因具有不穩(wěn)定性，而能發(fā)生直接化學(xué)氧化降解、光氧化降解和熱氧化降解［9］。在自然界中植物代謝產(chǎn)物糖基化現(xiàn)象普遍存在，通過(guò)糖基化化合物由非結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為結(jié)合態(tài)，可使穩(wěn)定性增強(qiáng)［10］。

以藏紅花球莖和幼芽為外植體誘導(dǎo)獲得了性狀優(yōu)良的細(xì)胞系［11］，在此基礎(chǔ)上對(duì)細(xì)胞性狀進(jìn)行調(diào)控并建立了藏紅花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，通過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化和添加誘導(dǎo)子［12］等措施，發(fā)現(xiàn)藏紅花細(xì)胞表現(xiàn)出穩(wěn)定的色素合成能力。為評(píng)價(jià)離體培養(yǎng)藏紅花細(xì)胞合成的色素的應(yīng)用潛力，本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究pH、溫度、光照、氧化劑、還原劑、食品添加劑以及金屬離子對(duì)其穩(wěn)定性的影響，并與柱頭色素進(jìn)行比較，以期為該色素資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藏紅花球莖愈傷組織（橙黃色，質(zhì)地疏松、不透明），由筆者所在實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)和篩選。藏紅花干柱頭，購(gòu)于上海崇明島。

1.2 試劑

NaOH、Na2CO3、H2O2、Na2SO3、VC、CuCl2、FeCl3、FeSO4、Na2HPO4、甲醇、乙醇、乙醚、三氯甲烷、環(huán)己烷、濃鹽酸、食鹽、檸檬酸、蔗糖和苯甲酸鈉等，均為市售分析純。

1.3 儀器設(shè)備

BS-224S型電子天平，德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；FreeZone 2.5型凍干機(jī)，美國(guó)Labconco公司；UV-2800型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼科（上海）儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海精科儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋和光照培養(yǎng)箱，上海博迅有限公司儀器設(shè)備廠。

1.4 方法

1.4.1 藏紅花細(xì)胞培養(yǎng)合成藏紅花色素

將MS培養(yǎng)基上（附加2mg/L萘乙酸（NAA）、0.5mg/L 6-芐基嘌呤（6-BA）、30g/L蔗糖、6.5g/L瓊脂，滅菌前調(diào)pH 6.0～6.1）培養(yǎng)30 d的藏紅花細(xì)胞接種于1/2 B5培養(yǎng)基（大量元素減半，附加2mg/L吲哚乙酸（IAA）、0.5mg/L 6-BA、20g/L蔗糖，滅菌前調(diào)pH 6.0～6.1），接種量為100mL培養(yǎng)基接種15g細(xì)胞，（21±0.5）℃振蕩培養(yǎng)28～30 d后收獲，轉(zhuǎn)速為150r/min。收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物于4℃、8 000r/min離心15min，用去離子水洗滌2次，收獲細(xì)胞并凍干。

1.4.2 色素溶解性的測(cè)定

分別稱取等量?jī)龈杉?xì)胞和柱頭于5mL容量瓶中，加入蒸餾水、無(wú)水甲醇、體積分?jǐn)?shù)50%甲醇、無(wú)水乙醇、體積分?jǐn)?shù)50%乙醇、乙醚、三氯甲烷、環(huán)己烷、0.1 mol/L NaOH、0.47 mol/L Na2CO3和 0.1 mol/L HCl等溶劑，觀察色素在不同溶劑中的溶解性及溶液顏色。

1.4.3 色素母液配制

分別稱取一定量?jī)龈杉?xì)胞和干柱頭于容量瓶中，加蒸餾水浸提48 h后過(guò)濾并定容至1 L，即得色素母液。

1.4.4 色素光譜特性的測(cè)定

測(cè)定色素母液在200～600 nm的紫外-可見吸收光譜。

1.4.5 pH對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取5mL細(xì)胞合成的色素母液和柱頭色素母液，分別加入5mL pH 3、5和7的0.1 mol/L檸檬酸-0.2 mol/L Na2HPO4緩沖液，pH為9的0.05 mol/L硼砂-0.2 mol/L硼酸緩沖液，pH為 11的 0.1 mol/L NaOH-0.05 mol/L Na2HPO4緩沖液及0.1 mol/L HCl，混勻，靜置2 h后觀察顏色并在440 nm處測(cè)吸光值；以加入5mL蒸餾水作對(duì)照。

1.4.6 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取等體積的細(xì)胞合成的色素母液和柱頭色素母液，分別置于20、40、60、80和100℃的恒溫水浴鍋中加熱1 h，在440 nm處測(cè)吸光值。

1.4.7 光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取等體積的細(xì)胞合成的色素母液和柱頭色素母液，分別放置于光照培養(yǎng)箱（光照強(qiáng)度15 000 lx）、避光和紫外燈（15 W）一定時(shí)間，在440 nm處測(cè)吸光值。

1.4.8 氧化劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取5mL細(xì)胞合成的色素母液和柱頭色素母液，分別加入5mL 0.33、0.66、0.99 mol/L H2O2溶液，室溫下放置2 h后在440 nm處測(cè)吸光值；以加入5mL蒸餾水作對(duì)照。

1.4.9 還原劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取5mL細(xì)胞合成的色素母液和柱頭色素母液，分別加入5mL 0.2、0.4、0.6和0.8g/L Na2SO3溶液，1、2和3g/L VC溶液，室溫下放置2 h，在440 nm處測(cè)吸光值；以加入5mL蒸餾水作對(duì)照。

1.4.10 食品添加劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取5mL細(xì)胞合成的色素母液和柱頭色素母液，分別加入5mL 10、20、30和40g/L食鹽溶液，5、10、15和20g/L檸檬酸溶液，20、40、60和80g/L蔗糖溶液，0.5、1.0、1.5和2.0g/L苯甲酸鈉溶液，室溫下放置2 h，在440 nm處測(cè)吸光值；以加入5mL蒸餾水作對(duì)照。

1.4.11 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取5mL細(xì)胞合成的色素母液和柱頭色素母液，分別加入5mL 0.001、0.005、0.01、0.05 mol/L CuCl2、FeCl3和FeSO4溶液，室溫下放置2 h，在440 nm處測(cè)吸光值；以加入5mL蒸餾水作對(duì)照。為消除Fe3+顏色的影響，以相應(yīng)濃度的FeCl3溶液做參比。

1.4.12 數(shù)據(jù)分析

1.4.5～1.4.11試驗(yàn)色素穩(wěn)定性以色素殘存率表示；上述所有試驗(yàn)結(jié)果均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)所得的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 色素的溶解性

2.2 色素的光譜特性

藏紅花細(xì)胞合成的色素和柱頭色素在紫外區(qū)和可見光區(qū)均有吸收，但二者吸收特征具有一定差異（圖1）。由圖1可知：細(xì)胞合成的色素在紫外區(qū)吸收很強(qiáng)，并且明顯強(qiáng)于可見光區(qū)的吸收，在280和330 nm有2個(gè)顯著的吸收特征峰，在400～500 nm可見光區(qū)也有吸收，但由于多個(gè)吸收峰的重疊未表現(xiàn)出顯著的吸收特征峰，且呈現(xiàn)出寬的吸收特征，吸收則隨波長(zhǎng)的減少吸收增強(qiáng)。柱頭色素有3個(gè)吸收特征峰，分別為254、330和440 nm。此外，二者都有末端吸收。

表1 藏紅花色素的溶解性Table 1 The solubilities of pigments in different solvents

圖1 藏紅花色素的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of pigments

藏紅花苷在可見光區(qū)和紫外區(qū)均有吸收特征峰。糖酯鍵使藏紅花苷在260 nm處具有第一個(gè)吸收帶；全反式類胡蘿卜素類化合物使其在400～470 nm處具有第二個(gè)吸收帶，最大吸收波長(zhǎng)為440 nm；全順式結(jié)構(gòu)使其在328 nm處具有第三個(gè)吸收帶［13］。本實(shí)驗(yàn)中藏紅花細(xì)胞合成的色素與柱頭色素在上述3個(gè)波長(zhǎng)段均有吸收，含有主要物質(zhì)藏紅花苷，但細(xì)胞合成的色素的紫外吸收很強(qiáng)?？梢?，藏紅花細(xì)胞合成的色素可能較天然色素成分更復(fù)雜，色素中除了含有主要物質(zhì)藏紅花苷外，還含有其他紫外吸收物質(zhì)，與天然藏紅花色素成分存在差異。

2.3 pH對(duì)色素穩(wěn)定性的影響分析

圖2為pH對(duì)2種色素穩(wěn)定性影響的結(jié)果。從圖2可以看出，在不同pH溶液中2種色素穩(wěn)定性具有一定差異。在pH為1時(shí)細(xì)胞合成的色素的色素殘存率為90.0%，柱頭色素殘存率只有45.2%，說(shuō)明細(xì)胞合成的色素在pH為1時(shí)的穩(wěn)定性優(yōu)于柱頭色素。在pH 3～11范圍內(nèi)柱頭色素比較穩(wěn)定，色調(diào)均為亮黃色?？沦F珍［13］報(bào)道了在pH為11、12溶液中天然藏紅花色素溶液吸光度明顯增加的現(xiàn)象，而本研究中柱頭色素在堿性條件下比較穩(wěn)定，但未表現(xiàn)出增色現(xiàn)象，這可能與藏紅花柱頭的來(lái)源（產(chǎn)地、質(zhì)量）有關(guān)。細(xì)胞合成的色素在pH為1～5范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，色調(diào)為亮黃色，但在中性到堿性條件下具有顯著的增色效應(yīng)，并且增色效應(yīng)隨堿性的增強(qiáng)而增強(qiáng)，在pH=7的緩沖液中呈橙黃色，在pH為9或11緩沖液中呈橙紅色。

圖2 pH對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of pH on stabilities of pigments

2.4 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響分析

（1）由四川省發(fā)改委統(tǒng)籌協(xié)調(diào)編制天然氣分布式能源規(guī)劃。各地市政府在全省“十三五”能源發(fā)展規(guī)劃和相關(guān)政策指導(dǎo)下依據(jù)當(dāng)?shù)爻鞘锌傮w規(guī)劃、供熱規(guī)劃、熱力電力需求、資源稟賦、環(huán)境約束等條件，因地制宜、統(tǒng)籌謀劃、科學(xué)編制各地天然氣分布式能源建設(shè)規(guī)劃并報(bào)省發(fā)改委審批。

溫度對(duì)2種色素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出：溫度對(duì)2種色素的穩(wěn)定性影響不同。20～60℃柱頭色素殘存率變化不大，具有一定的熱穩(wěn)定性，但隨溫度的升高，80和100℃色素殘存率明顯下降。高麗等［14］也報(bào)道了梔子黃色素（主要成分為藏紅花苷）具有一定耐熱性。細(xì)胞合成的色素隨溫度的升高色強(qiáng)增強(qiáng)，100℃色素殘存率為115.9%。說(shuō)明高溫對(duì)藏紅花細(xì)胞合成的色素具有明顯的增色作用。

圖3 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of temperature on stabilities of pigments

2.5 光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響分析

光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖4。從圖4（a）可以看出：在日光燈光照下，柱頭色素對(duì)光極不穩(wěn)定，褪色嚴(yán)重，放置 3 d后色素殘存率只有12.8%；細(xì)胞合成的色素在放置11 d過(guò)程中色素殘存率呈逐漸下降趨勢(shì)，但變化幅度不大，未見明顯褪色現(xiàn)象，11 d后色素殘存率仍達(dá)78.6%。說(shuō)明細(xì)胞合成的色素對(duì)光的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于柱頭色素。

圖4 光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of light on stabilities of pigments

從圖4（b）可以看出：在避光條件下，柱頭色素殘存率逐漸下降，但較日光燈光照下穩(wěn)定，11 d色素殘存率仍有61.6%。細(xì)胞合成的色素變化不大，且色強(qiáng)略有增強(qiáng)，11 d后色素殘存率為104.5%，說(shuō)明在避光條件下細(xì)胞合成的色素穩(wěn)定性優(yōu)于柱頭色素。

從圖4（c）可以看出：在紫外光照射下，柱頭色素殘存率呈逐漸下降趨勢(shì)，變化沒(méi)有日光燈光照下明顯，但比避光條件下變化幅度大，6 d后色素殘留率為62.1%；而細(xì)胞合成的色素放置3 d后色強(qiáng)明顯增強(qiáng)，色素殘存率為125.5%，之后變化幅度不大，6 d后色素殘留率為124.9%?？梢?，細(xì)胞合成的色素對(duì)紫外光亦表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

2.6 氧化劑和還原劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響分析

圖5為氧化劑和還原劑對(duì)2種色素穩(wěn)定性的影響結(jié)果。從圖5（a）可以看出：加入H2O2后，2種色素殘存率略有下降，但加大濃度后2種色素均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，加入0.99 mol/L H2O2后細(xì)胞合成的色素與柱頭色素的色素殘存率仍達(dá)90.9%和 91.4%。從圖5（b）、5（c）可以看出：還原劑Na2SO3和VC對(duì)2種色素的穩(wěn)定性影響不同。Na2SO3和VC對(duì)柱頭色素穩(wěn)定性沒(méi)有明顯影響，但Na2SO3對(duì)藏紅花細(xì)胞合成的色素具有顯著的增色作用，并且增色效應(yīng)隨Na2SO3濃度提高而增強(qiáng)；VC使細(xì)胞合成的色素的色素殘存率有一定降低，并且在1～3g/L實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)色素殘存率基本一致，說(shuō)明還原劑對(duì)細(xì)胞合成的色素穩(wěn)定性影響與還原劑種類有一定關(guān)系。

2.7 食品添加劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響分析

圖6為食品添加劑對(duì)2種色素穩(wěn)定性的影響結(jié)果。由圖6可知：食鹽、檸檬酸、蔗糖和苯甲酸鈉對(duì)細(xì)胞合成的色素和柱頭色素穩(wěn)定性影響不大，2種色素對(duì)4種食品添加劑均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

圖5 氧化劑和還原劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of oxidant and reductant on stabilities of pigments

2.8 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

圖7為金屬離子對(duì)2種色素穩(wěn)定性的影響結(jié)果。由圖7可知：Cu2+、Fe2+、Fe3+對(duì)2種色素穩(wěn)定性影響具有一定差異。Cu2+對(duì)柱頭色素的影響不大，殘存率基本不變，在98.0%～102.0%范圍。細(xì)胞合成的色素在低濃度的Cu2+（0.001 mol/L）溶液中色強(qiáng)下降，色素殘留率為86.0%，但在0.005、0.010和0.050 mol/L Cu2+溶液中表現(xiàn)出良好穩(wěn)定性，色素殘存率為 94.2%～99.2%。在 0.001、0.005和0.010 mol/L Fe2+溶液中，2種色素表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性；但在高濃度Fe2+（0.050 mol/L）溶液中，2種色素色強(qiáng)都明顯增強(qiáng)，細(xì)胞合成的色素與柱頭色素的色素殘存率分別為159.8%和138.6%。柱頭色素對(duì)Fe3+極不穩(wěn)定，色素色強(qiáng)明顯下降，色素殘存率為18.9%～35.2%。但細(xì)胞合成的色素對(duì)Fe3+表現(xiàn)很好的穩(wěn)定性，且具有極強(qiáng)的增色效應(yīng)，增色效應(yīng)隨Fe3+濃度提高而增強(qiáng)，色素殘存率為152.5%～175.2%。

高麗等［14］、郝金聲等［15］分別研究了 Cu2+對(duì)梔子黃色素和密蒙花黃色素穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)色素的吸光值隨Cu2+濃度增加而增加，并未表現(xiàn)出本實(shí)驗(yàn)中低濃度Cu2+對(duì)色素影響的效應(yīng)。因此關(guān)于低濃度Cu2+對(duì)細(xì)胞合成的藏紅花色素穩(wěn)定性影響的原因有待進(jìn)一步探討。

圖7 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of metal ions on stabilities of pigments

3 結(jié)論

藏紅花柱頭色素對(duì)pH 3～11堿性溶液、H2O2、Na2CO3、VC、食鹽、檸檬酸、蔗糖、苯甲酸鈉、Cu2+和Fe2+（0.001、0.005、0.010 mol/L）穩(wěn)定性較好，但對(duì)pH 1、高溫（80、100℃）、光照（日光燈光、紫外燈光）和Fe3+穩(wěn)定性差。

與藏紅花柱頭色素相比，離體培養(yǎng)藏紅花細(xì)胞合成的色素在pH 1、高溫（80、100℃）、光照（日光燈光、紫外燈光）條件下的穩(wěn)定性更佳。細(xì)胞合成的色素在稀堿（0.47 mol/L Na2CO3、0.1 mol/L NaOH）、Na2SO3、Fe2+（0.05 mol/L）和Fe3+溶液中色強(qiáng)增強(qiáng)，對(duì)VC和Cu2+（0.001 mol/L）的穩(wěn)定性略差。說(shuō)明離體培養(yǎng)細(xì)胞合成的藏紅花色素表現(xiàn)出更加優(yōu)良的穩(wěn)定性，尤其對(duì)強(qiáng)酸、高溫和光照的表現(xiàn)更佳，可為該色素的應(yīng)用提供一定的依據(jù)和幫助。

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（責(zé)任編輯 周曉薇）

Stabilities of saffron pigments produced by in vitro cell culture of Crocus sativus L.

FU Wenjun，YUAN Lihong
（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China）

The effects of pH，temperature，light，oxidant，reductant，food additives and metal ions on the stabilities of saffron pigments produced by Crocus sativus cells were investigated，and their stabilities were also compared with those of pigments from saffron stigma.The results showed that they were all watersolubleand bright yellow.They were stable to food additives and H2O2.Compared with saffron stigma pigments，saffron pigments produced by cell culture were more stable to strong acid（pH 1），high temperature（80℃，100℃）and light（incandescent light，UV），and less stable to VCand Cu2+（0.001 mol/L）.The coloring power of saffron pigments produced by cell culture could be increased by dilute alkaline solutions（0.47 mol/L Na2CO3，0.1 mol/L NaOH），Na2SO3，F(xiàn)e2+（0.050 mol/L）and Fe3+.

Crocus sativus L.；saffron pigments；in vitro culture；stabilities

Q943.1

A

1672-3678（2015）02-0041-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.008

2014-04-08

扶文君（1990—），女，江蘇宜興人，碩士研究生，研究方向：植物細(xì)胞工程；袁麗紅（聯(lián)系人），教授，E-mail：yuanlihong@njtech.edu.cn