劉 婷，劉立明，史仲平

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

基于基因組序列的樹(shù)干畢赤酵母生理特性解析

劉 婷1，2，劉立明1，史仲平2

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

樹(shù)干畢赤酵母作為一種潛在的纖維素乙醇生產(chǎn)菌株，有其獨(dú)特的生理優(yōu)勢(shì)。然而與釀酒酵母生產(chǎn)乙醇相比，樹(shù)干畢赤酵母生產(chǎn)纖維素乙醇還存在著諸多阻礙。為了從細(xì)胞整體水平進(jìn)一步解析樹(shù)干畢赤酵母的生理代謝特征，基于樹(shù)干畢赤酵母的全基因組序列，利用生物信息學(xué)的分析算法，分別解析了樹(shù)干畢赤酵母與釀酒酵母代謝網(wǎng)絡(luò)的異同；利用流量平衡分析（FBA）驗(yàn)證了C源生長(zhǎng)表型；預(yù)測(cè)了158個(gè)生長(zhǎng)必需反應(yīng)；鑒定了364個(gè)轉(zhuǎn)錄因子并對(duì)重要調(diào)控蛋白的功能進(jìn)行了分析。

樹(shù)干畢赤酵母；基因組序列；生理特性；流量平衡分析

傳統(tǒng)的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由于具有較高的乙醇產(chǎn)率、成熟的分子改造手段等一系列優(yōu)點(diǎn)而成為乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的最佳模式微生物［1］。乙醇生產(chǎn)的另一種優(yōu)勢(shì)菌株是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis），其最高乙醇得率可達(dá)理論得率的97%，且對(duì)乙醇的耐受性高達(dá)120 g/L［2］。但對(duì)于纖維素乙醇的生產(chǎn)，上述2種微生物均存在的一個(gè)難以克服的缺陷，即不能天然發(fā)酵戊糖（半纖維素的主要成分）。盡管大量代謝工程改造工作以嘗試導(dǎo)入木糖代謝途徑，但是效果卻不夠理想［3］。

樹(shù)干畢赤酵母 （Scheffersomyces stipitis），又名Pichia stipitis［4］，是一種單倍體同宗配合的半子囊酵母，最早從腐木和寄生于林木的甲蟲(chóng)幼蟲(chóng)中分離得到［5］。樹(shù)干畢赤酵母因其廣泛的C源代謝能力而成為纖維素乙醇的潛在生產(chǎn)菌，在細(xì)胞中廣泛存在的糖類(lèi)分解酶系使得樹(shù)干畢赤酵母能夠代謝各種糖類(lèi)分子。在所有從自然界中篩選出的木糖乙醇生產(chǎn)菌株中，樹(shù)干畢赤酵母的代謝優(yōu)勢(shì)也十分顯著：①木糖發(fā)酵能力強(qiáng)。單獨(dú)發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)率高達(dá)57 g/L［7］，得率達(dá)0.47 g/g［8］；②代謝副產(chǎn)物少?？刂迫苎踉谝欢ㄋ絻?nèi)幾乎檢測(cè)不到木糖醇、甘油、乙酸等代謝物；③營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求簡(jiǎn)單。在無(wú)維生素的培養(yǎng)基中也能正常發(fā)酵；④對(duì)雜質(zhì)的抵抗能力強(qiáng)；⑤能夠代謝木質(zhì)纖維素降解物中的毒性物質(zhì)［6］。

與現(xiàn)今較為成熟的釀酒酵母乙醇發(fā)酵技術(shù)相比，樹(shù)干畢赤酵母生產(chǎn)纖維素乙醇還存在著諸多阻礙：①與釀酒酵母的無(wú)氧發(fā)酵（crabtree-positive）生產(chǎn)乙醇的代謝方式不同，樹(shù)干畢赤酵母在溶氧充足的條件下不能合成乙醇，只有控制溶氧在較低的水平（＜1 mmol/（L·h））此菌株才能高效的生產(chǎn)乙醇［9］，對(duì)溶氧精確的要求為工業(yè)化生產(chǎn)控制帶來(lái)了難度；②樹(shù)干畢赤酵母的底物發(fā)酵速率過(guò)低，以葡萄糖為例，釀酒酵母發(fā)酵速率達(dá)1.78 g/（g·h），而樹(shù)干畢赤酵母葡萄糖發(fā)酵速率僅有0.39 g/（g·h）［10］，木糖的發(fā)酵速率則更低，僅為0.23 g/（g·h）［11］，過(guò)低的糖耗速率延長(zhǎng)了發(fā)酵周期，提高了生產(chǎn)成本，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；③與釀酒酵母相比，此菌株的遺傳和生化背景不夠清晰，代謝改造的成功率低。上述這些瓶頸問(wèn)題需要一個(gè)系統(tǒng)水平的平臺(tái)加以理解和解決，而微生物基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型（genome-scale metabolic model，GSMM）提供了這樣一個(gè)契機(jī)。

GSMM的一般研究思路是根據(jù)公布的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因組注釋?zhuān)⒃敿?xì)的生化反應(yīng)列表后轉(zhuǎn)換為計(jì)算機(jī)可讀的語(yǔ)言格式，再運(yùn)用各種模擬算法對(duì)模型進(jìn)行模擬預(yù)測(cè)和驗(yàn)證。自1999年流感嗜血桿菌的GSMM構(gòu)建完成至今，相關(guān)研究工作廣泛地在原核、真核微生物甚至人類(lèi)基因組中開(kāi)展，由此獲得的數(shù)百個(gè)GSMM在生物、醫(yī)藥、食品等行業(yè)的基礎(chǔ)研究方面產(chǎn)生良好效果［12］?；诩s束的分析算法（constaint-based modeling，CBM）為GSMM提供了一個(gè)模擬平臺(tái)，最大限度地了解微生物細(xì)胞的生理和代謝功能；通過(guò)流量平衡分析（FBA）、不同底物生長(zhǎng)表型分析、基因敲除分析、流量可變分析、系統(tǒng)魯棒性分析等不同的模擬算法，對(duì)細(xì)胞的表型進(jìn)行量化預(yù)測(cè)［13］。筆者在前期研究中通過(guò)對(duì)樹(shù)干畢赤酵母基因組注釋并結(jié)合生物化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)信息建立了以基因-蛋白質(zhì)（酶）-生化反應(yīng)關(guān)聯(lián)為核心的基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型iTL885［15］。該模型從糖類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、C源代謝途徑注釋、溶氧角度闡述乙醇生成的影響因素，并提出了潛在的基因敲除靶點(diǎn)提高乙醇的生成速率。本文借助于樹(shù)干畢赤酵母的基因組信息，利用生物信息學(xué)的分析算法，在細(xì)胞整體水平上進(jìn)一步解析樹(shù)干畢赤酵母的代謝特征。

1 材料與方法

1.1 基于COBRA工具箱的分析算法

從 In Silico Organisms 數(shù) 據(jù) 庫(kù) （http：// gcrg.ucsd.edu/InSilicoOrganisms/OtherOrganisms）中下載最近發(fā)表（截至2013年6月10日）的樹(shù)干畢赤酵母基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型iTL885。在Matlab平臺(tái)上利用COBRA（constraint-based reconstruction and analysis）［16］進(jìn)行模擬分析。作為目前應(yīng)用最廣泛的代謝網(wǎng)絡(luò)模型分析手段，COBRA工具箱包含很多常用的分析算法。如流量平衡分析（flux balance analysis，F(xiàn)BA）主要用于預(yù)測(cè)細(xì)胞最大比生長(zhǎng)速率和產(chǎn)物合成速率，而optimizeCbModel是COBRA工具箱中最常用的FBA算法。生長(zhǎng)必需反應(yīng)是指對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)必需的、敲除則導(dǎo)致細(xì)胞不能存活的代謝反應(yīng)，是一定生長(zhǎng)條件下合成細(xì)胞組分所必需的反應(yīng)集。生長(zhǎng)必需反應(yīng)的預(yù)測(cè)原理是運(yùn)用singleRxnDeletion依次限制通過(guò)每個(gè)反應(yīng)的流量為0，考察此時(shí)細(xì)胞最大比生長(zhǎng)速率的變化。如果反應(yīng)敲除后的比生長(zhǎng)速率小于原菌的1.0×10-6，則被敲除的反應(yīng)是必需反應(yīng)，否則為非必需反應(yīng)。

1.2 模擬條件選擇與設(shè)定

對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)表型的模擬需要預(yù)先設(shè)定模擬條件。模擬條件是實(shí)際生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境。參考釀酒酵母等真核微生物的模擬條件，設(shè)置樹(shù)干畢赤酵母模擬的基本培養(yǎng)基組分，包含基本營(yíng)養(yǎng)元素、C源和O2。其中，對(duì)基本營(yíng)養(yǎng)元素的供給沒(méi)有限制，即對(duì)它們的交換反應(yīng)的上下界分別設(shè)置為-1 000和1 000 mmol/（g·h），而對(duì)C源和O2則依據(jù)不同的培養(yǎng)條件需要限制它們所對(duì)應(yīng)的不同的吸收速率。

1.3 轉(zhuǎn)錄因子（TF）的鑒定

①真菌轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（Fungal Transcription Factors Database， FTFD， http：//ftfd.snu.ac.kr/ index.php？a=view）運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)的注釋程序注釋真菌基因組中的轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）［17］，該數(shù)據(jù)庫(kù)已收錄171種真菌的66 392個(gè)假定轉(zhuǎn)錄因子（截至2013年6月10日）。在 FTFD中以Pichia stipitis為關(guān)鍵詞檢索并下載所有的轉(zhuǎn)錄因子，整理包括在FTFD數(shù)據(jù)中的名稱（FTFD name）、所屬TF家族名稱（TF Family name）、基因座位名（Locus name）、序列長(zhǎng)度（Length）和蛋白名稱（Protein name）等信息。這些轉(zhuǎn)錄因子只是基于生物信息學(xué)算法的預(yù)測(cè)，準(zhǔn)確性還有待驗(yàn)證。②在公布樹(shù)干畢赤酵母測(cè)序結(jié)果的數(shù)據(jù)庫(kù)（DOE Joint Genome Institute）樹(shù)干畢赤酵母主頁(yè)（http：//genome.jgipsf.org/Picst3/Picst3.home.html）中根據(jù)GO分類(lèi)，查找GO為0003700的transcription factor activity，獲得139個(gè)比對(duì)的潛在轉(zhuǎn)錄因子。③為獲取更加可靠的轉(zhuǎn)錄因子信息，運(yùn)用本地BLAST對(duì)樹(shù)干畢赤酵母全基因組進(jìn)行比對(duì)（圖1）。釀酒酵母專(zhuān)門(mén)的轉(zhuǎn)錄因子數(shù) 據(jù) 庫(kù) yeastract （http：//www.yeastract.com/ index.php）收錄了釀酒酵母112個(gè)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的TFs及其調(diào)控的靶基因。下載該網(wǎng)站上所有釀酒酵母的轉(zhuǎn)錄因子，將該轉(zhuǎn)錄因子輸入到Uniprot中通過(guò)ID Mapping將轉(zhuǎn)錄因子名稱轉(zhuǎn)化為Uniprot ID，再通過(guò)Retrieve下載相應(yīng)fasta格式的蛋白質(zhì)序列。將該序列與樹(shù)干畢赤酵母的基因組蛋白質(zhì)序列進(jìn)行雙向比對(duì)（BLASTp），比對(duì)結(jié)果的篩選條件設(shè)置為氨基酸序列相似度＞35%和期望值（E值）＜10-10。

圖1 樹(shù)干畢赤酵母轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)的流程Fig.1 Flow chart of the Transcription Factors prediction in S.stipitis

2 結(jié)果與討論

2.1 代謝網(wǎng)絡(luò)特征分析

樹(shù)干畢赤酵母基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型iTL885由885個(gè)代謝基因、1 240個(gè)反應(yīng)和870個(gè)代謝物構(gòu)成［15］（表1）。iTL885完整的內(nèi)容已上傳于In Silico Organisms數(shù)據(jù)庫(kù)。由表1可知：選定釀酒酵母基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型iMM904，比較2個(gè)模型注釋出的基因總數(shù)目，發(fā)現(xiàn)iTL885的開(kāi)放閱讀框（ORFs）覆蓋率是15.2%，高于iMM904（13.7%），證實(shí)了iTL885采用的整合基因組注釋方法的全面性。由于釀酒酵母是一種典型的模式菌株，相關(guān)研究較為透徹，故iMM904包含的基因、反應(yīng)、代謝物數(shù)目均大于iTL885（表1）。iTL885中約92%的代謝反應(yīng)有基因關(guān)聯(lián)，在760個(gè)有基因關(guān)聯(lián)的反應(yīng)中，118個(gè)代謝反應(yīng)由多酶復(fù)合體構(gòu)成的蛋白質(zhì)催化，192個(gè)反應(yīng)由同工酶催化，其余的450個(gè)反應(yīng)由單個(gè)基因催化。不同于iMM904中的8個(gè)細(xì)胞分區(qū)，iTL885中的870個(gè)代謝物僅分布于細(xì)胞質(zhì)（552個(gè)）、線粒體（148個(gè)）和細(xì)胞外（170個(gè)）3個(gè)區(qū)間，其中281個(gè)代謝物存在于不同的細(xì)胞區(qū)間。

表1 樹(shù)干畢赤酵母和釀酒酵母模型比較Table 1 Model contents comparison of S.stipitis iTL885 and S.cerevisiae iMM904

2.2 樹(shù)干畢赤酵母對(duì)C源的利用分析

通過(guò)FBA模擬了樹(shù)干畢赤酵母在27種C源（15種糖類(lèi)、9種醇類(lèi)和3種酸）上的細(xì)胞生長(zhǎng)表型。定性分析發(fā)現(xiàn)模擬結(jié)果和實(shí)際C源利用情況完全一致性（表2）。由表2可知：其中20種能夠支持樹(shù)干畢赤酵母生物量中所有前體物質(zhì)的生成，證實(shí)了樹(shù)干畢赤酵母廣泛的C源代謝能力。有7種（棉子糖、山梨糖、蜜二糖、半乳糖醇、肌醇、甲醇和乳酸）不能支持生長(zhǎng)，說(shuō)明相關(guān)底物在樹(shù)干畢赤酵母細(xì)胞中缺乏后續(xù)的代謝反應(yīng)，致使生物量組分不能全部合成。上述模擬結(jié)果與數(shù)據(jù)中報(bào)道的樹(shù)干畢赤酵母細(xì)胞在不同底物中的實(shí)際生長(zhǎng)情況相一致。

選取3種典型C源（葡萄糖、木糖和鼠李糖），利用iTL885定量預(yù)測(cè)樹(shù)干畢赤酵母的生長(zhǎng)表型。由于缺乏準(zhǔn)確的糖耗速率，在進(jìn)行模擬時(shí)設(shè)定糖耗為相同的碳原子數(shù)。FBA預(yù)測(cè)的細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成見(jiàn)表3。由表3可知：無(wú)論限制O2的吸收與否，細(xì)胞生長(zhǎng)速率由大到小順序?yàn)槠咸烟?、木糖、鼠李糖，即葡萄糖為菌株生長(zhǎng)最佳C源。當(dāng)不限制O2的吸收速率時(shí)，樹(shù)干畢赤酵母表現(xiàn)為完全的呼吸代謝，3種C源的代謝產(chǎn)物中除生物量和CO2外均沒(méi)有其他代謝副產(chǎn)物，生物量生成速率快。當(dāng)限制O2的吸收速率為4 mmol/（g·h）（以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì)）時(shí)，利用葡萄糖和木糖為C源可合成產(chǎn)物乙醇，且在模擬條件下木糖生成乙醇的速率（0.2548 mmol/（g·h））比葡萄糖（0.139 0 mmol/（g·h））更快，而鼠李糖則不能生成乙醇，是不可發(fā)酵C源，這與文獻(xiàn)［19］的研究結(jié)果一致。

表2 樹(shù)干畢赤酵母對(duì)不同C源底物的利用Table 2 Utilization of different substrates by S.stipitis

表3 在葡萄糖、木糖和鼠李糖3種培養(yǎng)基上細(xì)胞生長(zhǎng)表型Table 3 Predicted growth phenotype of S.stipitis in glucose，xylose and rhamnose

2.3 樹(shù)干畢赤酵母生長(zhǎng)必需反應(yīng)分析

基于iTL885預(yù)測(cè)在以葡萄糖為C源的基本培養(yǎng)基上樹(shù)干畢赤酵母共有158個(gè)生長(zhǎng)必需反應(yīng)，占模型代謝反應(yīng)總數(shù)的14.6%，此數(shù)值與報(bào)道的相同條件下釀酒酵母必需反應(yīng)比例（13%）較接近［20］。樹(shù)干畢赤酵母中，必需反應(yīng)在6亞系統(tǒng)中分布情況見(jiàn)圖2。由圖2可知：氨基酸代謝（62個(gè)）、核苷酸代謝（22個(gè)）、脂質(zhì)代謝（27個(gè)）、碳水化合物代謝（27個(gè)）、轉(zhuǎn)運(yùn)代謝（19個(gè)）輔因子和維生素代謝（1個(gè)）。其中氨基酸代謝占有的生長(zhǎng)必需反應(yīng)占必需反應(yīng)總數(shù)的40%，它與C源核心代謝途徑關(guān)聯(lián)緊密，因而是最具剛性的代謝亞系統(tǒng)。樹(shù)干畢赤酵母碳水化合物代謝所占生長(zhǎng)必需反應(yīng)的比例（14%）比釀酒酵母釀酒酵母比例（17%）小，表明2株菌在代謝特征上的差異，樹(shù)干畢赤酵母比釀酒酵母擁有更廣泛和活躍的代謝能力，存在較多相連通的支路途徑，故對(duì)生長(zhǎng)必需的反應(yīng)數(shù)目較少。

圖2 樹(shù)干畢赤酵母（a）和釀酒酵母（b）在葡萄糖基本培養(yǎng)基上細(xì)胞生長(zhǎng)必需反應(yīng)分析Fig.2 Percentage of essential reactions in each subsystems on glucose minimal medium for（a）S.stipitis and（b）S.cerevisiae

2.4 轉(zhuǎn)錄因子的鑒定與功能分析

為獲取最全面的樹(shù)干畢赤酵母的轉(zhuǎn)錄因子信息、基于在線數(shù)據(jù)庫(kù)和本地BLAST 3處數(shù)據(jù)來(lái)源對(duì)樹(shù)干畢赤酵母的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了預(yù)測(cè)（圖3）。由圖3可知：在FTFD中檢索獲得350個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，約占基因組大小6%，分布在39個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族。同時(shí)在JGI樹(shù)干畢赤酵母主頁(yè)中根據(jù)GO信息查找獲得139個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)二者的比較發(fā)現(xiàn)，GO獲取的轉(zhuǎn)錄因子有6個(gè)不存在于FTFD中。運(yùn)用BLASTp蛋白質(zhì)序列雙向比對(duì)，獲得分布于16個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族的87個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，比較發(fā)現(xiàn)有8個(gè)是FTFD未包括在內(nèi)的。綜合上述3種來(lái)源的轉(zhuǎn)錄因子，共計(jì)獲得364個(gè)樹(shù)干畢赤酵母轉(zhuǎn)錄因子，這為后續(xù)相關(guān)研究提供了備選轉(zhuǎn)錄因子庫(kù)。不同來(lái)源獲取的轉(zhuǎn)錄因子的可信度大小依次為BLAST、GO、FTFD。上述轉(zhuǎn)錄因子中還存在諸多功能未知的假定蛋白（putative proteins），因此對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的準(zhǔn)確功能和眾多功能不明確的假定蛋白還需要生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

圖3 BLAST、GO、FTFD預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄因子家族數(shù)目Fig.3 Number of transcription factors and transcription factors families obtained from BLAST，GO，and FTFD

圖4 預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目及其家族分類(lèi)Fig.4 Predicted transcription factors in some transcription factors families

上述方法獲得的是所有可能存在于樹(shù)干畢赤酵母中的轉(zhuǎn)錄因子，共分布于39個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族（TF Family），分布范圍廣。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)其中有6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族包含的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目≥10個(gè)（圖4）。由圖4可知：鋅簇轉(zhuǎn)錄因子（zinc finger）數(shù)目最多，共有10種類(lèi)型構(gòu)成的156個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。排在其次的依次是OB折疊的核酸結(jié)合位點(diǎn)（nucleic acid-binding，OB-fold）轉(zhuǎn)錄因子家族（42個(gè)）、同源域（homeodomain-like，30個(gè)）、翼狀螺旋的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（winged helix repressor DNA-binding，20個(gè)）、Myb（15個(gè)）、bZIP（10個(gè)）這5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族。

進(jìn)一步對(duì)注釋的樹(shù)干畢赤酵母轉(zhuǎn)錄因子與釀酒酵母相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的功能進(jìn)行比較，闡述在樹(shù)干畢赤酵母中部分核心轉(zhuǎn)錄因子的代謝調(diào)控機(jī)制。按照序列同源相似性由高到低的順序?qū)⒉煌D(zhuǎn)錄因子及其調(diào)節(jié)功能列于表4。由表4可以發(fā)現(xiàn)：最具保守型的調(diào)控蛋白（氨基酸合成轉(zhuǎn)錄激活因子）GCN1、GCN4與釀酒酵母呈現(xiàn)一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系；樹(shù)干畢赤酵母中與葡萄糖濃度感受相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)有 RGT2、GRR1、SNF1、SKS1、SNF3、MIG2、MIG2.2和NRG1，這些調(diào)節(jié)蛋白與釀酒酵母中相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出高度的序列結(jié)構(gòu)相似性；同樣具有高度保守性的有O2調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白質(zhì)HAP5、HAP3和HAP2；不具有保守性或者保守性很低的蛋白質(zhì)包括MIG1/CREA、ADR1、HAP1和HAP4。

表4 樹(shù)干畢赤酵母與釀酒酵母同源的調(diào)控轉(zhuǎn)錄蛋白Table 4 Regulatory proteins in S.cerevisiae with corresponding proteins in S.stipitis

鑒于釀酒酵母與樹(shù)干畢赤酵母代謝調(diào)節(jié)的差異，部分重要的調(diào)節(jié)蛋白只存在于釀酒酵母中，而在樹(shù)干畢赤酵母中沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的基因。這些釀酒酵母獨(dú)有的調(diào)節(jié)基因包括INO2/INO4、RGT1、VID22和GCR1/GCR2。其中，INO2/INO4是磷脂代謝的轉(zhuǎn)錄激活因子，與乙醇耐受性相關(guān)［21］；RGT1誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Hxt）表達(dá)；VID22參與糖酵解代謝途徑中的果糖-1，6-二磷酸酶（FBP1）的轉(zhuǎn)運(yùn)和降解；而GCR1/GCR2則能夠激活糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)。較高的乙醇耐受性和糖酵解流量是釀酒酵母為適應(yīng)高糖濃度發(fā)酵進(jìn)化出來(lái)的機(jī)制。而樹(shù)干畢赤酵母長(zhǎng)期生存在低糖濃度環(huán)境中，其乙醇耐受性和糖酵解能力明顯不足。

3 結(jié)論

基于作者前期構(gòu)建的樹(shù)干畢赤酵母基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型iTL885從基因、反應(yīng)、代謝物3個(gè)層次對(duì)樹(shù)干畢赤酵母的代謝網(wǎng)絡(luò)特征進(jìn)行了分析。以iTL885為平臺(tái)，運(yùn)用FBA定性分析了樹(shù)干畢赤酵母利用27種不同底物時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，與報(bào)道的細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)果完全一致。選取木糖、葡萄糖和鼠李糖3種典型C源定量分析細(xì)胞生長(zhǎng)和乙醇生成能力，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)速率由大到小是葡萄糖、木糖、鼠李糖，且葡萄糖和木糖能發(fā)酵生成乙醇，鼠李糖是不可發(fā)酵C源。單反應(yīng)敲除共預(yù)測(cè)到樹(shù)干畢赤酵母有158個(gè)生長(zhǎng)必需反應(yīng)，與釀酒酵母在同樣條件下的生長(zhǎng)必需反應(yīng)進(jìn)行比較，證實(shí)了2株菌在代謝特征上的相同和差異之處?；谠诰€數(shù)據(jù)庫(kù)和本地BLAST，獲取分布于39個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族的364個(gè)樹(shù)干畢赤酵母轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)與釀酒酵母相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的功能進(jìn)行比較，證實(shí)釀酒酵母與樹(shù)干畢赤酵母代謝調(diào)節(jié)的異同。

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（責(zé)任編輯 荀志金）

Metabolic trait of Scheffersomyces stipitis based on genome sequence

LIU Ting1，2，LIU Liming1，SHI Zhongping2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

As a potential cellulosic ethanol producer，Scheffersomyces stipitis has its unique metabolic traits.However，problems need to be solved for Scheffersomyces stipitis cellulosic ethanol production compared with Saccharomyces cerevisiae ethanol production.Based on the genome data of Scheffersomyces stipitis，we did a further systematical analysis of the metabolic traits of Scheffersomyces stipitis was by bioinformatic algorithm.Genome-scale metabolic model（GSMM）similarity and difference between Scheffersomyces stipitis and Saccharomyces cerevisiae was compared.Cell growth phenotype on different carbon sources was validated with flux balance analysis.Furthermore，158 growth essential reactions were predicted on glucose minimal medium.Finally，364 transcription factors were identified and the function of important regulatory proteins were discussed.

Scheffersomyces stipitis；genome sequence；metabolic trait；flux balance analysis

Q78

A

1672-3678（2015）01-0075-07

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.013

2013-06-09

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（NCET-10-0456）；江蘇省杰出青年基金（BK2012002）；中組部首批青年拔尖人才支持計(jì)劃

劉 婷（1988—），女，江蘇淮安人，碩士研究生，研究方向：工業(yè)微生物；史仲平（聯(lián)系人），教授，E-mail：zpshi@jiangnan.edu.cn