楊愛華，劉 佳，張震宇，劉立明

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

調(diào)控因子SlyA和RfaH在E.coli K4合成果糖軟骨素中的生理作用

楊愛華1，2，劉 佳1，2，張震宇1，劉立明1，2

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

利用基因工程手段過量表達E.coli K4莢膜多糖（K4CPS）合成途徑中相關(guān)代謝調(diào)控因子SlyA和RfaH，以構(gòu)建高效合成K4CPS的菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：slyA和rfaH基因的單獨過量表達和共表達重組菌的K4CPS的產(chǎn)量較對照菌分別提高了81.8%、46.5%和153.8%；甘油比消耗速率較對照菌降低了12.5%、18.8%和31.3%，而乙酸含量則較對照菌降低了98.6%、39.7%和91.6%。因此，調(diào)控蛋白SlyA和RfaH的過量表達能夠大幅度提高E.coli K4的K4CPS合成，并增強菌體對甘油的利用率，而乙酸合成明顯降低。而與單獨表達策略相比，共表達策略能夠更加有效地增強菌體合成K4CPS的能力。

硫酸軟骨素；E.coli K4；K4CPS；轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是重要的糖胺聚糖產(chǎn)品之一，目前主要被藥用于骨關(guān)節(jié)炎癥狀的治療，此外還具有抗寄生蟲和病毒感染等功能，在再生醫(yī)學(xué)以及抗腫瘤藥物的開發(fā)等方面潛在的應(yīng)用價值同樣受到廣泛關(guān)注［1-2］。CS還可用作膳食補充劑和保濕劑［3］。

多種細菌可以合成類硫酸軟骨素的莢膜多糖，這使基于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)CS成為可能。果糖軟骨素是Escherichia coli O5∶K4∶H4莢膜中的糖胺聚糖，其結(jié)構(gòu)式為（GlcUA（Fru）-1，3-GalNAc-1，4）（GlcUA代表葡萄糖醛酸，GalNAc代表乙酰半乳糖胺，F(xiàn)ru代表果糖），具有與 CS類似的多糖骨架［4-5］。目前，已利用E.coli K4發(fā)酵與化學(xué)修飾相結(jié)合的方法已成功合成了包括CS-A和CS-C的多種CS［6］。

K4CPS屬于大腸桿菌Group 2莢膜類型，由包含3個功能區(qū)（region 1、regioin 2和region 3）的基因簇控制合成［7］。其中，region 1為單獨轉(zhuǎn)錄單元，由位于region 1上游的σ70啟動子（PR1）控制轉(zhuǎn)錄［8］。region 3和region 2共同形成一個轉(zhuǎn)錄單元，由啟動子PR3控制轉(zhuǎn)錄［9］。從PR3方向的轉(zhuǎn)錄過程需要反終止因子RfaH的參與［10］。該蛋白與PR3下游非翻譯區(qū)（UTR）713 bp的ops序列結(jié)合，從而保證從啟動子PR3起始，經(jīng)過region 2的轉(zhuǎn)錄過程正常進行［11］?；騬faH的突變或ops序列的缺失，將導(dǎo)致莢膜合成能力的喪失，而rfaH的過量表達能有效促進PR3方向的轉(zhuǎn)錄［9，12］?；虼氐霓D(zhuǎn)錄表達調(diào)控系統(tǒng)復(fù)雜而嚴密，除反終止因子RfaH以外，多種調(diào)控蛋白也參與其中，以調(diào)控蛋白SlyA最為重要。SlyA的表達受到溫度的控制，與蛋白H-NS共同參與調(diào)控基因簇在37℃正常轉(zhuǎn)錄，而20℃的轉(zhuǎn)錄抑制。但SlyA的表達并不依賴于H-NS蛋白。20℃時，SlyA的表達量較低，主要為H-NS蛋白結(jié)合在啟動子區(qū)域，抑制了基因簇的轉(zhuǎn)錄。在37℃條件下，SlyA的表達量上升，與H-NS形成SlyA-DNAH-NS復(fù)合物激活從PR1和PR3的轉(zhuǎn)錄［7，11，13-14］。可見，調(diào)控蛋白SlyA對莢膜多糖合成基因簇具有明顯的正調(diào)控作用。莢膜多糖合成基因簇中包括編碼單糖合成及轉(zhuǎn)運、多糖的聚合、多糖跨膜轉(zhuǎn)運等功能蛋白的多個基因，K4CPS的合成需要以上基因的協(xié)同表達。

因此，本研究中，基于莢膜多糖合成基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SlyA和RfaH對基因簇轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要作用，克隆slyA和rfaH基因，構(gòu)建2株單表達重組菌E.coli pTH-slyA、E.coli pTH-rfaH，以研究SlyA和RfaH對K4CPS合成的影響，并構(gòu)建共表達重組菌E.coli pTHslyA-rfaH，增強特別是從啟動子PR3方向的基因簇的轉(zhuǎn)錄水平，以構(gòu)建高效的K4CPS合成菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體

PMD 19-T-simple，購于TaKaRa公司；pTrcHis A載體，購于Invitrogen公司；大腸桿菌JM109保存于筆者所在實驗室，大腸桿菌K4（Escherichia coli O5∶K4∶H4），購于American Type Culture Collection，保藏編號為ATCC23502。

1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶BamH I、Kpn I、Hind III、T4 DNA連接酶、Ex Taq DNA聚合酶購于TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）購于上海生工生物工程公司；細菌基因組提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；PCR儀、全自動凝膠成像系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司；UltiMate 3000型高效液相色譜儀，美國Dionex公司。

1.3 培養(yǎng)基

菌株構(gòu)建過程中所用培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基均為LB培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成［15］（g/L）：甘油20，大豆蛋白胨1，K2HPO49.7，KH2PO42，（NH4）2SO43，檸檬酸三鈉0.5，MgCl20.1。

1.4 實驗方法

1.4.1 引物的設(shè)計和slyA和rfaH基因的擴增

根據(jù)Genbank中收錄的 E.coli K4的 slyA和rfaH基因序列，設(shè)計特異擴增引物，如表1所示。引物合成由上海翰宇生物科技有限公司完成。將E.coli K4用LB培養(yǎng)基在37℃、200r/min培養(yǎng)過夜，收集菌體細胞，提取其基因組。以該基因組DNA為模板，使用slyA up和slyA down1擴增出用于單表達的slyA片段，使用slyA up和slyA down2擴增出用于共表達的slyA片段，使用rfaH up1和rfaH dowm擴增出用于單表達的rfaH片段，使用rfaH up2和rfaH down擴增出用于共表達的rfaH基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)過膠回收后，與pMD19-T simple在16℃下連接過夜。鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli JM109感受態(tài)細胞。篩選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證，得到陽性質(zhì)粒T-slyA1、T-slyA2、T-rfaH1和T-rfaH2，送至上海生工生物工程有限公司測序。

表1 本研究中所使用的引物Table 1 PCR primers used in this study

1.4.2 重組質(zhì)粒和工程菌的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III分別對表達載體pTrcHis A和質(zhì)粒T-slyA1進行雙酶切，膠回收pTrcHis A線性質(zhì)粒和目標基因，將表達載體和目標基因片段相連，得到單表達重組質(zhì)粒pTH-slyA。用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III分別對表達載體pTrcHis A和質(zhì)粒T-rfaH1進行雙酶切，膠回收pTrcHis A線性質(zhì)粒和目標基因，將表達載體和目標基因片段相連，得到單表達重組質(zhì)粒pTH-rfaH。

用限制性內(nèi)切酶BamH I和Kpn I分別對表達載體pTrcHis A和質(zhì)粒T-slyA2進行雙酶切，膠回收pTrcHis A線性質(zhì)粒和目標基因片段。將表達載體和目標基因片段相連，得到重組質(zhì)粒pTH-slyA。該質(zhì)粒經(jīng)Kpn I和Hind III酶切后膠回收。膠回收的片段與T-rfaH2的Kpn I和Hind III酶切片段相連，得到共表達重組質(zhì)粒pTH-slyA-rfaH。共表達載體同其單表達載體一樣，均由Trc啟動子啟動，且每個基因帶有獨立和相同的核糖體結(jié)合位點。將上述構(gòu)建的表達載體pTH-slyA、pTH-rfaH和pTH-slyA-rfaH轉(zhuǎn)入E.coli K4感受態(tài)細胞，在加有氨芐的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，酶切及PCR驗證。

1.4.3 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達及鑒定

將選定的重組大腸桿菌接入含有氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。種子液按10%的接種量接至含有氨芐抗生素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至600nm處的吸光值（OD600）達到0.6時，加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4 mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。細胞總蛋白和胞內(nèi)組分經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨膠凝電泳（SDS-PAGE）檢測。

1.4.4 K4CPS含量檢測

發(fā)酵液8 000r/min離心5min，收集上清液，上清液用3倍體積的無水乙醇沉淀多糖，12 000r/min離心10min，所得沉淀用于K4CPS含量的測定。K4CPS含量測定用硫酸咔唑法［16］。

1.4.5 甘油和乙酸濃度的測定

用高效液相色譜（HPLC）儀檢測發(fā)酵液上清中甘油和乙酸含量。色譜柱為Aminex HPX-87H色譜柱（美國Bio-Rad公司）；流動相為5 mmol/L H2SO4，流速0.6mL/min；RID檢測器。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌的構(gòu)建和表達

以E.coli K4基因組為模板，利用PCR擴增出目的片段slyA和rfaH并連接至pMD19-T simple vector。獲得重組質(zhì)粒T-slyA和T-rfaH，且基因的測序結(jié)果表明，slyA和rfaH的基因序列與NCBI登記序列完全相同，長度分別為441和489 bp。按照1.4.2節(jié)中的方法構(gòu)建重組表達質(zhì)粒 pTH-slyA、pTH-rfaH和pTH-slyA-rfaH，經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切驗證，酶切片段大小與理論值相符，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，質(zhì)粒的構(gòu)建和驗證結(jié)果如圖1所示。

將質(zhì)粒pTH-slyA、pTH-rfaH和pTH-slyA-rfaH分別導(dǎo)入E.coli K4中得到重組菌E.coli pTH-slyA、E.coli pTH-rfaH和E.coli pTH-slyA-rfaH。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，菌體破碎后的離心上清進行SDSPAGE分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：重組菌E.coli pTH-slyA、E.coli pTH-rfaH和E.coli pTH-slyA-rfaH均有明顯的目的蛋白表達條帶，且蛋白條帶的大小均與預(yù)期相符（蛋白SlyA和RfaH大小分別約1.617×104和1.793×104）。表明基因slyA和rfaH均在E.coli K4中得到了過表達。

2.2 調(diào)控因子SlyA和RfaH過量表達對菌體生長的影響

搖瓶發(fā)酵比較各重組菌與出發(fā)菌E.coli K4的生長情況，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：重組菌E.coli pTH-slyA和E.coli pTH-slyA-rfaH延滯期明顯延長，分別在3、6 h進入對數(shù)生長期。而E.coli K4幾乎沒有延滯期，在8 h時便可達到穩(wěn)定期。重組菌在對數(shù)生長期的最大比生長速率（0.42、0.32 h-1）也分別低于E.coli K4的69.1%和76.5%。雖然不同菌株細胞比生長速率各不相同，但至發(fā)酵結(jié)束時，3株菌E.coli K4、E.coli pTH-slyA和E.coli pTH-slyA-rfaH的OD600基本一致。而E.coli pTH-rfaH盡管初始生長狀態(tài)良好，與E.coli K4同時進入穩(wěn)定期，但它的最大菌體密度僅有（10.98±0.16）g/L，分別比E.coli K4、E.coli pTH-slyA和E.coli pTH-slyA-rfaH降低了18.0%、10.0%和18.1%。因此，調(diào)控蛋白SlyA的過表達明顯抑制了菌體的生長，而RfaH的過量表達對菌體的比生長速率影響較小。

圖1 表達載體的構(gòu)建與驗證Fig.1 Construction and confirmation of recombinant plasmid

圖2 重組菌蛋白誘導(dǎo)表達SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression proteins in three recombinant stains

2.3 重組菌的甘油消耗和乙酸合成分析

圖4為菌株的甘油消耗和乙酸合成分析。從圖4中可以看出：4株菌消耗甘油的規(guī)律基本一致，在菌體的對數(shù)生長期，甘油快速消耗。但至發(fā)酵結(jié)束，E.coli K4培養(yǎng)基中的甘油質(zhì)量濃度為（3.12±0.35）g/L，而重組菌 E.coli pTH-rfaH、E.coli pTH-slyA和E.coli pTH-slyA-rfaH僅有（1.29±0.1）、（0.40±0.01）和（0.31±0.03）g/L，比E.coli K4甘油消耗得更為徹底，細胞產(chǎn)生乙酸的含量也有較大變化。重組菌在代謝過程中產(chǎn)生的乙酸量明顯比E.coli K4降低。乙酸是E.coli K4發(fā)酵過程中產(chǎn)生的主要有機酸副產(chǎn)物（乙酸含量至少占總有機酸含量的80%）［17］。一般而言，乙酸在E.coli有氧發(fā)酵條件下的產(chǎn)生與2種因素有關(guān)［18］：①培養(yǎng)基內(nèi)溶解氧濃度較低；②底物攝取與轉(zhuǎn)化成生物量及產(chǎn)物之間不平衡，使得乙酰-CoA由三羧酸循環(huán)（TCA）轉(zhuǎn)向乙酸合成。在培養(yǎng)環(huán)境一致的條件下，重組菌 E.coli pTH-rfaH、E.coli pTH-slyA和E.coli pTH-slyA-rfaH平均甘油比消耗速率（0.14、0.13和 0.11 h-1）比E.coli K4（0.16 h-1）分別將低了12.5%、18.8%和31.3%。較低的甘油比消耗速率，不利于乙酸的合成。乙酸含量比對照菌降低了 98.6%、39.7%和91.6%。另一方面，培養(yǎng)基內(nèi)較低的乙酸含量也使得甘油可以持續(xù)被菌體消耗。

圖3 重組菌與出發(fā)菌的細胞生長情況比較Fig.3 Comparision of cell growth（in term of OD600）between E.coli K4 and recombinant stains

2.4 重組菌合成K4CPS性能的分析

對重組菌合成K4CPS性能進行分析，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出：重組菌產(chǎn)K4CPS量較出發(fā)菌均有提高。單獨過量表達slyA與rfaH基因分別使K4CPS積累量達到（1 000±44）和（806±58）mg/L，較E.coli K4的（550±34）mg/L提高了81.8%和46.5%；而共表達slyA和rfaH基因的重組菌K4CPS的產(chǎn)量高達（1 396±55）mg/L，較出發(fā)菌株提高了153.8%。K4CPS的平均比合成速率分別為6.42、6.30和8.86 h-1，比E.coli K4（5.10 h-1）提高了25.9%、23.5%和73.7%。且K4CPS對單位菌體的得率由100 mg/g分別提高至 199、178和 253 mg/g，提高幅度高達99.0%、78.0%和 153.0%，表明調(diào)控因子 SlyA和RfaH的過量表達能夠大幅度增強菌體的K4CPS合成能力。另外，與 E.coli K4相比，重組菌 E.coli pTH-slyA、E.coli pTH-rfaH、E.coli pTH-slyA-rfaH的K4CPS對甘油的得率也分別提高了54.5%、30.3%和115.1%。結(jié)合2.3節(jié)中重組菌消耗了更多的甘油而產(chǎn)生很少量的乙酸，說明調(diào)控蛋白SlyA和RfaH的過表達有效激活了K4CPS合成路徑，減少了副產(chǎn)物的產(chǎn)生，使甘油更多地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。

圖4 重組菌與出發(fā)菌甘油消耗及乙酸產(chǎn)生情況比較Fig.4 Comparision of glycerol consumed and acetate acid production in E.coli K4 and recombinant strains

圖5 基因slyA和rfaH的過量表達對K4CPS積累情況的影響Fig.5 Effects of overexpression of slyA and rfaH genes on K4CPS accumulation

將重組菌和出發(fā)菌實驗數(shù)據(jù)進行整理，得到的發(fā)酵過程參數(shù)如表2所示。表2說明調(diào)控因子基因的過量表達有效地提高了K4CPS的積累量，且共表達策略能夠更加有效地激活莢膜多糖合成基因簇的表達，從而將碳代謝流轉(zhuǎn)入莢膜多糖合成途徑。

表2 對照菌株與工程菌株發(fā)酵參數(shù)比較Table 2 Comparion of fermentation parameters between wild type and recominant stains

3 結(jié)論

基因slyA不僅能夠加強K4CPS的合成能力，將K4CPS由（550±34）mg/L增加至（1 000±44）mg/L，提高了81.8%，還能一定程度上增強菌體對甘油的利用能力。反終止因子RfaH的過量表達則使K4CPS產(chǎn)量提高了46.5%。針對與單獨表達slyA和rfaH基因明顯促進K4CPS積累的實驗結(jié)果，采用共表達策略使編碼SlyA和RfaH調(diào)控蛋白的基因共同由Trc啟動子啟動，構(gòu)建一個串聯(lián)表達系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，slyA和rfaH的共表達，能夠大幅度提高K4CPS的產(chǎn)量，較E.coli K4和單表達slyA、rfaH的菌株分別提高了153.8%、81.8%和46.5%。本研究的實驗結(jié)果表明，莢膜多糖合成基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SlyA和RfaH的過量表達可明顯促進K4CPS的合成。

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（責(zé)任編輯 周曉薇）

Effects of overexpression of transcriptional regulators SlyA and RfaH on fructosylated chondroitin production in E.coli K4

YANG Aihua1，2，LIU Jia1，2，ZHANG Zhenyu1，LIU Liming1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To enhance K4CPS production of E.coli K4，the transcriptional factor SlyA and RfaH were over expressed in E.coli K4 to create E.coli pTH-slyA，E.coli pTH-rfaH and co-expression strain E.coli pTH-slyA-rfaH.The over-expression of SlyA and RfaH significantly enhanced K4CPS production.The K4CPS concentration for E.coli pTH-slyA，E.coli pTH-rfaH and E.coli pTH-slyA-rfaH was increased by 81.8%、46.5%and 153.8%，compared with that of E.coli K4，respectively.The glycerol consumption rate of recombinant strain decreased by 12.5%、18.8%and 31.3%than that of E.coli K4.Moreover，the concentration of acetic acid decreased by 98.6%、39.7%and 91.6%compared with that of E.coli K4.The overexpression of slyA and rfaH could significantly enhanced K4CPS production.

chondroitin sulfate；E.coli K4；K4CPS；transcriptional regulator

TQ929.2

A

1672-3678（2015）05-0014-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.003

2014-03-13

江蘇省科技支撐計劃（BE2010617）；中組部青年拔尖人才支撐計劃；江蘇省杰出青年基金（BK2010002）

楊愛華（1988—），女，山東聊城人，碩士研究生，研究方向：生物工程；劉立明（聯(lián)系人），教授，mingll@jiangnan.edu.cn；張震宇（聯(lián)系人），教授，zhangzy@jiangnan.edu.cn