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基于線粒體DNA D-loop區(qū)全序列分析藏雞遺傳多樣性及其起源進化關(guān)系的研究

賈曉旭，唐修君，陸俊賢，顧榮，葛慶聯(lián)，高玉時*，蘇一軍

摘要：通過對藏雞線粒體DNA（mtDNA）Dloop區(qū)全序列的測序和比對，結(jié)合GenBank已經(jīng)測出Dloop區(qū)全序列的部分品種雞的序列，探討藏雞的遺傳多樣性和母系起源。結(jié)果表明，藏雞DNA（mtDNA）Dloop區(qū)全長1 231~ 1 232 bp、1 231 bp單倍型在859 bp處存在C堿基缺失。在20只個體中，共發(fā)現(xiàn)20處單核苷酸多態(tài)位點，7種單倍型。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，藏雞7種單倍型可以分為A、B、E三個分支。A分支與紅色原雞（Gallus gallus murghi）聚為一類，推測可能起源于紅色原雞的印度亞種分支，B和E與紅色原雞滇南亞種（Gallus gallus spadiceus）聚為一類，推測這兩個分支可能起源于云南、緬甸附近地區(qū)的紅色原雞滇南亞種。研究從分子水平上為藏雞的遺傳資源保護和開發(fā)利用提供參考

關(guān)鍵詞：藏雞；線粒體DNA；D-loop區(qū)；系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；起源

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-1-27 16:00:16 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150127.1600.006.html

賈曉旭,唐修君,陸俊賢,等.基于線粒體DNA D-loop區(qū)全序列分析藏雞遺傳多樣性及其起源進化關(guān)系的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2015, 46(2): 32-36.

藏雞是我國青藏高原上具有特殊種質(zhì)特性的地方品種，對高原惡劣氣候和低氧環(huán)境有良好適應(yīng)能力。具有耐粗放飼養(yǎng)、抗病力強、肉質(zhì)鮮嫩等優(yōu)點，但由于蛋小、生長緩慢、開產(chǎn)較晚等缺點，亟需對其進行遺傳改良[1]。

線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）具有母系單倍體遺傳特性、在世代傳遞過程中不發(fā)生DNA重組、較核DNA突變率高及進化速率快等優(yōu)點，能反映物種母系遷徙歷史，利于了解物種馴化經(jīng)歷[2-4]。mtDNA控制區(qū)（D-loop區(qū)）進化速率較其他區(qū)域高5~10倍。因此，D-loop區(qū)序列是對親緣關(guān)系較近群體進行遺傳分化研究的理想分子標(biāo)記。已被廣泛用于家禽起源與進化、群體遺傳結(jié)構(gòu)、品種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等方面研究[5-6]。為從母系遺傳角度闡明藏雞群體的遺傳變異狀況和母系血統(tǒng)來源，本文測定藏雞線粒體DNA D-loop區(qū)全序列，從分子水平上探討藏雞的起源和遺傳多樣性，為藏雞種質(zhì)資源保護、利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

20只藏雞采集于國家地方禽種資源基因庫，隨機取樣，翅靜脈采血，ACD抗凝，采用常規(guī)的酚/氯仿法提取血液基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。選取紅色原雞三個亞種（指名亞種Gallus gallus spadiceus、滇南亞種Gallus gallus spadiceus、印度亞種Gallus gallus spadiceus）、西藏臨近國家（老撾、印度尼西亞）當(dāng)?shù)赝林贩N、臨近省份（云南、新疆、湖南）品種，對世界家禽品種培育做出重要貢獻的白洛克、白來航、洛島紅、新漢夏等已經(jīng)測出線粒體DNA D-loop區(qū)全序列的14個品種，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載其線粒體DNA D-loop區(qū)全序列（見表1），與藏雞進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

根據(jù)紅色原雞線粒體基因組已知DNA序列（GenBank序列號: NC_007235）用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計1對引物擴增藏雞線粒體DNA的D-loop區(qū)，引物序列分別為: PF：5' AAACACCCAAACTC ACTAAC 3'；PR：5' CACTGGGATGCGGATACTTG C 3'。交于上海生工生物有限公司合成。

PCR擴增體系（50 μL）：PCRMix（南京博爾迪公司）25 μL，10 μmol·L-1引物各1.5 μL，模板2 μL，滅菌水20 μL。反應(yīng)程序為：95℃5 min，（95℃30 s，53℃60 s，72℃60 s）30循環(huán)，72℃4 min。1.5%低溶點瓊脂糖(Promega公司）凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用試劑盒回收純化，然后交由上海英駿公司進行測序。所有序列采用雙向測序，以便比對核實。

表1　用于分類的品種序列信息Table 1　List of taxonomic samples information

將得到的序列與GenBank中紅色原雞參考序列進行比對，剪掉引物及多余的序列，DNA序列片段經(jīng)DNAStar 5.02軟件的SeqMan程序拼接。用DnaSP version 5軟件統(tǒng)計多態(tài)位點數(shù)（Number of polymorphic sites）和突變位點總數(shù)（Total number of mutations），單倍型數(shù)（Number of haplotype），單倍型多樣度（Haplotype diversity），核苷酸多樣度（Mucleotide diversity）等[7]。用MEGA 4.0進行轉(zhuǎn)換與顛換數(shù)目的統(tǒng)計和堿基組成分析，并用其采用鄰接法（neighbor-jointing，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹選用Kimura 2模型，1 000次重復(fù)[8]。

2　結(jié)果與分析

設(shè)計引物在藏雞基因組中得到較好的擴增,通過測序發(fā)現(xiàn)藏雞線粒體DNA D-loop區(qū)序列全長除1只為1 231 bp外（859 bp處C堿基缺失），其余均為1 232 bp。T、C、A和G 4種堿基含量分別為33.5%、26.5%、26.7%和13.3%，其中A+T含量（60.2%）明顯高于G+C含量（39.8.2%），與其他家禽品種線粒體DNA D-loop區(qū)序列的堿基組成基本一致[9-10]。藏雞mtDNA D-loop區(qū)核苷酸多樣性為（0.00475±0.00481），單倍型多樣性為（0.774± 0.065），表現(xiàn)出豐富的線粒體遺傳多樣性。從圖1可以看出，藏雞D-loop區(qū)在第1到第132 bp之間沒有發(fā)現(xiàn)堿基變異，說明這是相對保守的一個區(qū)域，變異區(qū)在第133與1 215 bp之間，而高變區(qū)主要集中在第212~330 bp之間，長度占全長的10% （118/1 232），卻集中60%（12/20）的堿基變異。

通過DnaSP軟件進行單倍型統(tǒng)計分析，藏雞群體D-loop區(qū)序列中檢測到20個多態(tài)位點，并由此界定7個單倍型（Hap1~Hap7見圖1）。其中單倍型1和單倍型5均有7個個體，為優(yōu)勢單倍型。利用藏雞mt DNA D-loop區(qū)7個單倍型構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)生樹，從圖1、2可以看出，單倍型可以分為A、B、E三個分支。其中A分支僅有1種單倍型，1個個體；B分支有2種單倍型，8個個體；E分支有4種單倍型，11個個體。

圖2　7種單倍型藏雞線粒體DNA D-loop區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2　Neighbor-joining phylogenetic tree of 7 mtDNAD-loop haplotypes of Tibetan chicken

根據(jù)藏雞線粒體DNA D-loop區(qū)全序列A、B、E三個分支，采用NJ法構(gòu)建藏雞與其他品種的系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖3）。

由圖3可知，藏雞A分支與新漢夏、白洛克、白來航、原雞印度亞種聚為一類，節(jié)點的BP值為78；而老撾土著雞、新疆吐魯番雞與原雞指名亞種聚為一類。藏雞B分支與洛島紅、云南赤轱轆雞、湖南桃源雞、原雞滇南亞種（云南）聚為一類，節(jié)點的BP值為94；藏雞E分支先與云南江邊雞聚為一類，再與印度尼西亞斗雞聚為一類，最后與原雞滇南亞種（緬甸）聚為一類，節(jié)點的自舉置信度（BP）為98。藏雞B與E分支親緣關(guān)系較近，同在一個大的支系。

圖3　基于線粒體DNA D-loop區(qū)序列采用N-J法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3　Neighbor-joining tree based on populations mtDNA D-loop sequences

3　討論與結(jié)論

國內(nèi)外有關(guān)雞mtDNA D-loop區(qū)研究大都集中在高變區(qū)[11-13]，一般小于600 bp，區(qū)域較小，得到的信息可能不全面。本研究發(fā)現(xiàn)藏雞Dloop區(qū)全長1 231~1 232 bp，1 231 bp單倍型在859 bp處存在C堿基缺失，藏雞D-loop區(qū)在738、792、900、1 215 bp處存在堿基轉(zhuǎn)換或顛換。因此筆者認為用mtDNA D-loop區(qū)全序列進行遺傳多樣性和起源進化分析更為準確。

群體mtDNA變異程度的兩個重要指標(biāo)是單倍型多樣度和核苷酸多樣度。二者值越大，遺傳多樣性越豐富，群體多樣性程度越高。在20只個體中，共發(fā)現(xiàn)20處單核苷酸多態(tài)位點，7種單倍型，核苷酸多樣性為（0.00475±0.00481），單倍型多樣性為（0.774±0.065），表現(xiàn)出豐富的線粒體遺傳多樣性。變異區(qū)在第133個堿基與1 215個堿基之間，而高變區(qū)主要集中在第212~330堿基之間。

Fumihito等研究表明紅色原雞為家雞的野生祖先[14]，由多個母系在中國南部、南亞和東南亞經(jīng)過多次獨立馴化[15]。本研究結(jié)果顯示，藏雞可劃分為A、B、E三個分支，由于mtDNA呈母系遺傳，以上結(jié)果揭示藏雞在遺傳組成上具有3個血統(tǒng)來源。

藏雞群體主要分布于分支B和E中，分別與原雞滇南亞種（緬甸）和原雞滇南亞種（云南）聚為一類，其母系可能起源于緬甸和云南的原雞滇南亞種（Gallus gallus spadiceus），分支A群體數(shù)量較少，與原雞印度亞種聚為一類，母系可能起源于原雞印度亞種（Gallus gallus murghi）。這與Niu等和Liu等中國家雞多個母系起源的研究結(jié)果一致[16-17]。吐魯番斗雞和老撾土雞與原雞指名亞種聚為一類，可能起源原雞指名亞種（Gallus gallus gallus）。

藏雞B和E分支與我國地方品種江鄉(xiāng)雞、赤轱轆雞、桃源雞聚到一起，這與發(fā)生地方品種間雜交有關(guān)。雞E分支與印度尼西亞斗雞聚為一類，藏雞習(xí)性富于神經(jīng)質(zhì)，好斗性強，也可能與含有斗雞血緣有關(guān)。藏雞B分支與洛島紅一類，洛島紅育成較晚，是由紅色馬來斗雞、褐色來航雞和九斤黃雞雜交而成，由于聚類分析B分支與白來航親緣關(guān)系較遠，推測藏雞B分支與洛島紅的母系九斤黃或馬來斗雞共同血緣。藏雞A分支個體較少，與大部分藏雞個體親緣關(guān)系較遠，與白來航和白洛克等國外優(yōu)秀品種聚為一類，可能是人為雜交結(jié)果，也可能具有共同母系血緣，可考慮對其生產(chǎn)性能做進一步研究。

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Jia Xiaoxu, Tang Xiujun, Lu Junxian, et al. Investigation of genetic diversity and evolution of Tibetan chicken based on complete mitochondrial DNA D-loop region sequence[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(2): 32-36. (in Chinese with English abstract)

Investigation of genetic diversity and evolution of Tibetan chicken

based on complete mitochondrial DNA D-loop region sequence

Abstract:To determine the origin and genetic diversity of Tibetan chicken, we analyzed its complete mtDNA D-loop sequences and the available chicken sequences in GenBank. The results showed that, the D-loop region of Tibetan chicken was 1 231-1 232 bp, the 1 231 bp haplotype existed a base C deficiency within 859 site. In the 20 samples assayed,20 mutation sites and 7 haplotypes were found. Phylogenetic analysis found that 7 haplotypes of Tibetan chicken converged into three clades. The clade A were clustered with Gallus gallus murghi, the cluster results indicated clade A may originated from the continental subspecies of Gallus gallus murghi of India or its surrounding areas.The clade B and Clade E and were clustered with Gallus gallus spadiceus, the cluster results indicated two clades may originated from the continental subspecies of Gallus gallus spadiceus of Yunnan or

Myanmar or its surrounding areas. The study results will be a reference for genetic resources conservation and development and utilization of Tibetan chicken.

Key words:Tibetan chicken; mitochondrial DNA; D-loop region; phylogenetic relationship; origin

*通訊作者：高玉時，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向為家禽遺傳育種與品質(zhì)評價。E-mail: gaoys100@sina. com

作者簡介：賈曉旭（1982-），男，助理研究員，碩士，研究方向為家禽遺傳育種與品質(zhì)評價。E-mail: 596374801@qq. com

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基于線粒體DNA D-loop區(qū)全序列分析藏雞遺傳多樣性及其起源進化關(guān)系的研究

1 材料與方法

2 結(jié)果與分析

3 討論與結(jié)論

1　材料與方法

2　結(jié)果與分析

3　討論與結(jié)論