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雞氨肽酶N蛋白多克隆抗體制備及其生物學(xué)功能研究

李廣興1，李蘭蘭1，潘龍1，洪琴1, 2，張恒1, 3，楊巍1，黃小丹1, 4，馬德星1，張瑞莉1，楊貴君1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；

2.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司生物部，上海200131；

3.山東信得科技股份有限公司，山東濰坊262200；

4.黑龍江職業(yè)學(xué)院，哈爾濱150080）

摘要：試驗參考GenBank上雞氨肽酶N（gAPN）基因序列（登錄號為NM_204861.1）設(shè)計多對特異性引物，利用RT-PCR分段克隆gAPN基因各段克隆產(chǎn)物并利用SOE-PCR將其進行連接，得到大小為2 906 bp的全長基因。利用原核表達載體pET-30a（+）構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-gAPN并轉(zhuǎn)化E. coli Rosetta，經(jīng)誘導(dǎo)表達得到大小為113 ku目的條帶。以純化gAPN重組蛋白為免疫原制備兔抗gAPN多克隆抗體，間接Elisa方法檢測多抗血清效價為215。Western Blot試驗證明，此多克隆抗體可以與原核表達的蛋白產(chǎn)生特異性條帶，同時與18日齡雞腎組織中獲得的天然gAPN蛋白樣品有良好的反應(yīng)性。間接免疫熒光試驗顯示，多克隆抗體可檢測到pcDNA-gAPN轉(zhuǎn)染HELA細胞所表達的gAPN蛋白。上述結(jié)果可為gAPN蛋白的深入研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雞氨肽酶N；多克隆抗體；免疫印跡；間接免疫熒光

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-1-27 16:00:06

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150127.1600.004.html

李廣興,李蘭蘭,潘龍,等.雞氨肽酶N蛋白多克隆抗體制備及其生物學(xué)功能研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2015, 46(2): 24-31.

Li Guangxing, Li Lanlan, Pan Long, et al. Preparation of polyclonal antibody against chicken amino peptidase N protein and its biological functions[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(2): 24-31. (in Chinese with English abstract)/LI Guangxing1, LI Lanlan1, PAN Long1, HONG Qin1, 2,

Preparation of polyclonal antibody against chicken amino peptidase N

protein and its biological functions

ZHANG Heng1, 3, YANG Wei1, HUANG Xiaodan1, 4, MA Dexing1, ZHANG Ruili1, YANG Guijun1(1. School of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Biology Department, Wuxi AppTec Co., Ltd, Shanghai 200131, China; 3. Shandong Sinder Technology Co., Ltd, Weifang Shandong 262200, China; 4. Heilongjiang Polytechnic, Harbin 150080, China)

Abstract:In this study, specific primers were designed according to the reference gAPN gene (NM_204861.1) of GenBank. The complete chicken amino peptidase N (gAPN) gene of totally 2 906 bp was cloned and linked with RT-PCR and SOE PCR technique. The gAPN was expressed after construction of pET-30a-gAPN and transformed E. coli Rosetta, the molecular weight of gAPN recombinant protein is 113 ku. The purified recombinant protein was used as antigen for preparation of rabbit anti-gAPN polyclonal antibody, the titer of polyclonal antibody was 215. Western Blot showed that this polyclonal antibody had highly reactivity and specialty with recombinant protein and natural gAPN from kidney of 18-day-old of chicken. IFA test demonstrated that this polyclonal antibody could react with the HELA cell transfected with eukaryotic expression plasmid of pcDNA-gAPN.

Key words: chicken amino peptidase N; polyclonal antiserum; Western Blot; indirect fluorescence antibody assay

氨肽酶N（APN）是一種Ⅱ型金屬蛋白酶，主要分布于腎臟、小腸和呼吸道上皮細胞等處，具有促進血管生成、充當病毒細胞受體、介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種功能[1]。冠狀病毒在感染宿主細胞過程中需要受體參與，現(xiàn)已經(jīng)鑒定出與冠狀病毒S蛋白N-端RBDS結(jié)合的細胞受體包括唾液酸和癌胚抗原相關(guān)細胞黏附分子1（CEACAM1），與C-末端RBDS結(jié)合的細胞受體包括APN和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 （ACE-2）[2]，但這些可能存在的病毒受體生物學(xué)功能尚需進一步研究。

APN可作為多種冠狀病毒的細胞受體，Alpha屬人和各種動物冠狀病毒可利用其自然宿主APN和貓氨肽酶N（fAPN）作為受體[3]。唾液酸也可以作為受體或輔助受體發(fā)揮作用，Gamma屬冠狀病毒IBV以N-乙酰基神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）作為輔助受體，但IBV與Neu5Ac的結(jié)合域尚未確定[4]。小鼠CEACAM1主要生理功能是介導(dǎo)細胞黏附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，是所有小鼠肝炎病毒株的主要受體[5]。目前IBV感染是否利用APN作為其受體還未達成共識，且APN發(fā)揮受體作用的功能區(qū)尚不清楚。明曉波等對雞APN在不同雞組織中的分布、定量研究表明，IBV的組織嗜性與APN酶活性存在一定的相關(guān)性，但規(guī)律性不強；采用熒光定量PCR的方法測定不同日齡雛雞主要組織器官中APN的mRNA表達量，結(jié)果表明IBV的組織嗜性與APN的自然分布存在明顯的正相關(guān)性，同時克隆APN基因構(gòu)建真核重組表達質(zhì)粒，利用間接免疫熒光驗證雞APN作為IBV的受體可能性[6]。

本試驗從雞腎臟中分段克隆全長gAPN，蛋白成功表達后制備多克隆抗體，利用Western Blot和間接免疫熒光試驗研究其生物活性及其天然活性，為進一步證實APN作為IBV功能受體的可能性奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗載體、質(zhì)粒、實驗動物及主要試劑

原核表達載體pET-30a（+）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院獸醫(yī)病理解剖實驗室保存；PCR試劑、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、IPTG、高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Maker購自大連寶生物工程有限公司；pMD-18T載體、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京索萊寶生物公司；感受態(tài)細胞E. coli JM109、Rosetta購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HRP標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉生物技術(shù)有限公司；新西蘭雌性白兔購自哈爾濱市某養(yǎng)殖場。

1.2引物設(shè)計與合成

參考GenBank上登錄號為（NM_204861.1）的gAPN基因序列用Premier 5.0和Oligo6.0設(shè)計以下特異性引物（見表1）對gAPN基因進行分段克隆及對原核質(zhì)粒進行構(gòu)建。

1.3雞氨肽酶N總RNA的提取、目的基因的擴增及核苷酸序列分析

取28日齡SPF來航雞的腎臟組織50~100 mg，按Trizol Reagent說明書提取總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄說明書以O(shè)ligo（dT）18 Primer為反轉(zhuǎn)錄引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，先用引物Apn1F，Apn1R；Apn2F，Apn2R；Apn3F，Apn3R分別克隆出三段基因，再采用SOE-PCR，按Ex Taq DNA聚合酶說明書分兩次進行g(shù)APN全長的克隆，先用引物Apn1F，Apn2R進行第一次合成，片段長度為2 062 bp，再使用引物Apn2F，Apn3R合成gAPN全長，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃30 s，63℃30 s，72℃3 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，將反應(yīng)產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收，將回收的目的基因與pMD-18T載體連接，對重組質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化和鑒定，將鑒定陽性的重組質(zhì)粒送至生工生物工程股份有限公司進行序列測定，將測序得到的gApn核苷酸序列用DNAstar軟件進行分析。

1.4 gAPN原核重組表達質(zhì)粒pET-gAPN和真核重組表達質(zhì)粒pcDNA-gAPN的構(gòu)建

用引物pET-ApnF、pET-ApnR；pcDNA-apnF、pcDNA-apnR對gAPN全長進行亞克隆，將亞克隆后的膠回收產(chǎn)物和原核表達載體pET-30 a（+）、真核表達載體pcDNA3.1同時用Eco RⅠ和HindⅢ進行雙酶切，純化后用T4DNA連接酶連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，挑取單克隆，培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進行鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-gAPN、pcDNA-gAPN，將重組質(zhì)粒進行測序鑒定。

表1　基因克隆所用特異性引物Table 1　Specific primers used for cloning

1.5重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達與純化

將pET-gApn和空載體pET-30a（+）分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossetta，取100 μL涂布在相應(yīng)抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落于含相應(yīng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，在波長600 nm處檢測培養(yǎng)物的OD600=0.5數(shù)值，取1 mL重組菌液培養(yǎng)物作為誘導(dǎo)前對照，剩余培養(yǎng)物中加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取一次樣，誘導(dǎo)7 h后進行SDS-PAGE分析。表達產(chǎn)物參照文獻[7]所述方法進行純化，獲得的產(chǎn)物命名為gAPN蛋白，用透析袋復(fù)性，并進行SDS-PAGE分析。

1.6 gApn蛋白多克隆抗體的制備及效價測定

1.6.1多克隆抗體的制備

將復(fù)性的gApn蛋白（1 mg·mL-1）與等體積弗氏完全佐劑混合乳化為油乳劑，采用背部多點注射方法對新西蘭白兔進行免疫，以后每隔一周將純化復(fù)性后的蛋白與等體積弗氏不完全佐劑混合乳化采用皮下多點注射免疫白兔，共免疫4次，最后一次免疫后一周對白兔進行頸動脈無菌取血，分離血清。

1.6.2間接ELISA多克隆抗血清效價檢測

用稀釋液（0.1 mol·L-1pH 8.6 NaHCO3）稀釋為10 μg·mL-1的gApn蛋白作為包被抗原，被檢血清按2-5~2-16稀釋度進行稀釋，作為一抗進行間接ELISA，檢測多克隆抗血清的抗體效價。

1.7多克隆抗體的鑒定及生物活性的檢測

1.7.1抗體特異性的Western Blot檢測

分別用天然gApn蛋白和重組gApn蛋白與兔抗gApn陽性血清進行Western Blot檢測。重組gAPN融合蛋白檢測時，使用gAPN融合蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，將gAPN多抗做1?5 000倍稀釋，酶標二抗1?1 000倍稀釋，進行Western Blot檢測；天然gAPN蛋白檢測時，取20 mg雞腎臟，加入100 μL組織裂解液進行研磨裂解，離心取上清，制備SDS-PAGE樣品進行轉(zhuǎn)印，將gAPN多抗做1?1 000倍稀釋，酶標二抗1?1 000倍稀釋，進行Western Blot檢測。

1.7.2多克隆抗體的IFA檢測

將表達gAPN蛋白的真核質(zhì)粒pcDNA-gAPN和pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染長滿單層70%的Hela細胞，24 h后用多聚甲醛固定，一抗為1?100倍稀釋的多抗血清，二抗為1?200倍稀釋的FITC標記山羊抗兔IgG，進行間接免疫熒光試驗。

2　結(jié)果與分析

2.1雞APN基因的克隆

從28日齡雞腎臟提取總RNA進行RT-PCR，用引物Apn1F，Apn1R擴增片段大小為864 bp，用引物Apn2F，Apn2R擴增片段大小為1 327 bp，用引物Apn3F，Apn3R擴增片段大小為759 bp（見圖1），經(jīng)過兩次SOE-PCR，第一次SOE-PCR擴增出片段長度約為2 062 bp（見圖2），第二次SOE-PCR成功擴增出片段長度為2 906 bp的目的片段（見圖2），將PCR產(chǎn)物亞克隆到pMD18-T載體，將鑒定陽性的重組質(zhì)粒（見圖3）送生物公司測序，結(jié)果表明所克隆的序列為gAPN全長?？寺〉膅APN序列已經(jīng)登錄GenBank，登錄號為JX014437.1。

圖1　gAPN基因PCR擴增產(chǎn)物Fig. 1　PCR product of gAPN gene

圖2　gAPN基因SOE PCR擴增產(chǎn)物Fig. 2　SOE-PCR product of gAPN gene

圖3　gAPN基因鑒定結(jié)果Fig. 3　Identification of gAPN gene

2.2序列分析

利用DNAstar軟件，將本試驗克隆的gAPN基因和其他幾種動物參考APN基因序列（見表2）進行比對（見表3）。通過比對發(fā)現(xiàn)本試驗所克隆gAPN基因序列與其他幾個物種APN序列之間的同源性均在69%以上，表明在各個物種中存在相同的高度保守區(qū)域，同時各物種間又存在各種差異的可變區(qū)；其中本文克隆gAPN基因與雞APN參考序列（NM_204861.1）同源性為99.1%，表明雞源APN基因高度保守。

表2　參考動物的APN基因序列Table 2　Reference APN gene sequence of different animals

表3　參考動物的APN基因同源性分析結(jié)果Table 3　Percent identity analysis of different animal APN genes

2.3雞APN基因的重組原核、真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建、蛋白表達

2.3.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

亞克隆gAPN基因插入原核表達載體pET30a（+）和真核表達載體pcDNA3.1，PCR和雙酶切鑒定結(jié)果顯示，重組表達質(zhì)粒pET-gAPN（見圖4）和pcDNA-gAPN（見圖5）均構(gòu)建正確，測序結(jié)果證實成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-gAPN和pcDNA-gAPN。

圖4　重組質(zhì)粒pET-gAPN鑒定結(jié)果Fig. 4　Identification of the recombinant plasmid pET-gAPN

圖5　重組質(zhì)粒pcDNA-gAPN鑒定結(jié)果Fig. 5　Identification of the recombinant plasmid pcDNA-gAPN

2.3.2重組蛋白的表達

將鑒定正確的重組原核表達質(zhì)粒pET-gAPN轉(zhuǎn)化至Rosetta感受態(tài)，37℃，1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)，共誘導(dǎo)7 h（見圖6），可見在116和97 ku間出現(xiàn)一條目的條帶，與預(yù)測的蛋白大小113 ku相符，隨著誘導(dǎo)時間的延長表達量逐漸變大，在4 h時達到最大。

2.4多克隆抗體的鑒定

2.4.1 gAPN多克隆抗體血清的效價測定

用ELISA法測定gAPN多克隆抗體血清效價，結(jié)果顯示隨著血清稀釋度的增高，OD值逐步降低，當多克隆血清稀釋215倍時P/N>2，稀釋216倍時P/N<2確定gAPN多克隆抗體血清效價為215（見圖7）。

圖6　gAPN蛋白表達的SDS-PAGE分析Fig. 6　SDS-PAGE analysis of gAPN protein expression

圖7　多抗血清效價的ELISA檢測結(jié)果Fig. 7　ELISA analysis of the binding activities of polyclonal antibody

2.4.2 gAPN蛋白的Western Blot檢測結(jié)果

將原核表達的gAPN蛋白進行Western Blot，原核表達的gAPN大小為113 ku，在130和95 ku見可見特異性單一條帶（見圖8），證明制備的多克隆抗體可以和原核表達的蛋白產(chǎn)生特異性結(jié)合。

使用從雞腎臟提取的總蛋白進行Western blot，天然gAPN蛋白的大小為160 ku，在150和230 ku間可見單一條帶（見圖9），證明制備的多克隆抗體與天然gAPN蛋白可產(chǎn)生特異性反應(yīng)，反應(yīng)性良好，條帶單一，可用于后續(xù)試驗。

圖8　原核表達gAPN蛋白與gAPN多抗的Western BlotFig. 8　Western Blot of prokaryotic expression gAPN withrabbit anti gAPN antiserum

圖9　gAPN多抗與天然gAPN的Western blotFig. 9　Detection Natural gAPN by Western blotting

2.4.3多克隆抗體的IFA檢測

結(jié)果見圖10。

間接免疫熒光試驗顯示，轉(zhuǎn)染真核質(zhì)粒pcDNA-gAPN的HELA細胞可以檢測到特異性熒光（見圖10A），而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的細胞未出現(xiàn)特異性熒光（見圖10B）。

圖10　多克隆抗體的IFA檢測Fig. 10　Assay of the polyclonal antiserum with indirect fluorescence antibody

3　討論與結(jié)論

氨肽酶N（APN）/CD13是II型金屬蛋白酶，由一個短N-端胞漿域、跨膜部分和包含活性部位的大細胞胞外結(jié)構(gòu)域組成，共計967個氨基酸。APN廣泛存在于各種器官和組織中[8]，高表達于腎小管上皮細胞、腸上皮細胞、肺上皮細胞和各種類型細胞[9]。天然APN分子質(zhì)量為160 ku，哺乳動物APN是普遍存在的多功能酶，與腫瘤發(fā)生和免疫器官發(fā)育有關(guān)，參與抗原和抗原遞呈過程中微調(diào)。功能有利于對生物活性肽反應(yīng)（疼痛管理，血管加壓素釋放）調(diào)制和影響免疫功能和主要生物活動。目前已經(jīng)證明氨肽酶N可作為Alpha屬冠狀病毒豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）[10]、豬病毒性腹瀉病毒（PEDV）[11]的受體。豬呼吸道冠狀病毒（PRCoV）、人類冠狀病毒229E（HCoV-229E）[12]、貓冠狀病毒（FCoV）和犬冠狀病毒（CCoV）利用其自然宿主和貓氨肽酶N（fAPN）作為受體，但貓APN不是Gamma屬冠狀病毒IBV受體[3]。冠狀病毒在識別受體APN時是有種屬特異性，且特異性與APN蛋白N-連接糖基化相關(guān)[13]。本研究從28日齡的來航雞腎臟中提取RNA，利用設(shè)計的三對引物克隆出gAPN基因的3個片段，再利用兩次SOE-PCR成功將3段基因連接在一起得到全長2 906 bp的gAPN基因。將本試驗克隆的gAPN序列與其他幾種動物APN序列進行同源性分析，表明本試驗克隆gAPN基因序列與雞APN參考序列（NM_ 204861.1）同源性為99.1%，表明雞APN基因高度保守；與參考動物的序列同源性均在69%以上，各個物種間存在相同的保守區(qū)域，這些區(qū)域高度保守，各物種間又存在各種差異可變區(qū)，這些可變區(qū)是各物種在進化過程中形成。Wentworth等試驗證明，受體結(jié)合位點和功能性的氨基酸都位于各物種APN基因的高變區(qū)，在APN上已經(jīng)確定3個受體結(jié)合區(qū)域均位于其表面（AA 283-292，vbm 1；AA 728-744，vbm 2；AA 760-784，vbm 3），F(xiàn)CoV和CCoV可以結(jié)合vbm 2和vbm 3；PRCOV主要結(jié)合pAPN的AA 783 和787[14]；HCoV-229E結(jié)合AA 283-292（vbm1）[15]。

本文進行g(shù)APN原核重組蛋白的表達和多抗制備，間接免疫熒光試驗證明制備多抗和真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HELA細胞呈現(xiàn)特異性熒光，同時此多抗還可以與雞腎臟中的天然結(jié)構(gòu)gAPN蛋白特異性結(jié)合，證明此多抗具有較好的與天然APN結(jié)合能力。本實驗室利用Western Blot證明原核表達gAPN蛋白可以和IBV病毒反應(yīng)，由于SDS-PAGE是變性電泳，SDS將蛋白質(zhì)變性，使之失去天然結(jié)構(gòu)，證明gAPN與IBV結(jié)合不依賴蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，與酶的活性中心無關(guān)，這與Costa等其他冠狀病毒相關(guān)受體研究結(jié)果一致[16]，提示gAPN可作為IBV可能的功能性受體在病毒侵染細胞過程中發(fā)揮作用。本文中g(shù)APN重組蛋白表達和多克隆抗體的制備及其生物學(xué)活性研究對檢測分析雞各種組織和器官中g(shù)APN的分布和含量，可為分析其在IBV侵染細胞中的生物學(xué)作用及闡明該病的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

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作者簡介：李廣興（1968-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為動物病理學(xué)。E-mail: ligx@neau. edu. cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31172295，31272569）；黑龍江省自然科學(xué)基金項目（ZJN0702-01）

收稿日期：2014-02-27

文章編號：1005-9369（2015）02-0024-08

文獻標志碼：A

中圖分類號：S852.23