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雙抗體夾心ELISA檢測(cè)排泄物PEDV

李一經(jīng)，劉博，姜艷平，崔文，唐麗杰，喬薪瑗，劉敏

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

摘要：用蔗糖密度梯度離心法純化豬流行性腹瀉病毒（PEDV）免疫BALB/c小鼠，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)獲得2株分泌抗豬流行性腹瀉病毒（PEDV）單克隆抗體，建立檢測(cè)PEDV的雙抗體夾心ELISA方法。結(jié)果表明，該雙抗體夾心ELISA最佳反應(yīng)條件為，兔抗PEDV抗體稀釋度為1?800包被37℃1 h加4℃12 h，樣品反應(yīng)時(shí)間為90 min，酶標(biāo)抗體工作濃度為1?2 000作用45 min，以O(shè)D490nm≥0.37作為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。該ELISA的重復(fù)性變異系數(shù)小于10%，最低檢測(cè)限為5×103.67TCID50/mL，并與豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒無(wú)交叉反應(yīng)。用該ELISA方法和RT-PCR方法檢測(cè)48份臨床糞便樣品，結(jié)果顯示，ELISA陽(yáng)性檢出率為39.6%，而RT-PCR方法檢測(cè)卡的陽(yáng)性檢出率為43.8%。表明雙抗體夾心ELISA方法具有特異性強(qiáng)、靈敏性高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于PEDV快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；單克隆抗體；雙抗體夾心ELISA；檢測(cè)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2015-1-27 15:59:15

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150127.1559.001.html

李一經(jīng),劉博,姜艷平,等.雙抗體夾心ELISA檢測(cè)排泄物PEDV[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 46(2): 1-10.

Li Yijing, Liu Bo, Jiang Yanping, et al. Indirect sandwich ELISA for antigen detection of PEDV in feces[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(2): 1-10. (in Chinese with English abstract)

Indirect sandwich ELISA for antigen detection of PEDV in feces

/LI Yijing,LIU Bo, JIANG Yanping, CUI Wen, TANG Lijie, QIAO Xinyuan, LIU Min

(School of Veterinary Medicines, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:To purify porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) by sucrose density gradient centrifugation, and immunized BALB/c mice. Obtained two anti-porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) monoclonal antibody by hybridoma technique, and established method of double antibody sandwich ELISA to detect PEDV. The results showed that, the optimum reaction conditions of the double antibody sandwich ELISA: the dilution rate of the rabbit anti-PEDV antibody is 1?800, after 37℃and 1 h incubation, 4℃and 12 h incubation. The reaction time of samples is 90 min, working concentration of the HRP is 1?2 000 and reaction time is 45 min, and OD490nm≥0.37 as positive criteria. The coefficient variation (CV) of this ELISA repeatability is less than 10%, the lowest detection limit is 5×103.67TCID50/mL, and no cross-reaction with TGEV and PRV. with the porcine transmissible gastroenteritis virus and porcine rotavirus. Detecting 48 clinical stool samples to compare the ELISA method and RT-PCR method, the results showed that positive detection rate of E LISA is 39.6%, while positive detection rate of RT-PCR is 43.8%. In a word, double-antibody sandwich ELISA method has the advantages of strong specificity, high sensitivity and good reproducibility, and it can be used for the rapid detection of PEDV.

Key words: porcine epidemic diarrhea virus; monoclonal antibodies; indirect sandwich ELISA; detection

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由冠狀病毒科豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的各種年齡豬以嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水及仔豬高致死率為主要特征的一種消化道傳染病[1-2]。近幾年該病在我國(guó)流行范圍明顯擴(kuò)大，病原致病性亦有增強(qiáng)趨勢(shì)，是當(dāng)前仔豬腹瀉死亡重要病因之一[3-4]。

豬腹瀉疾病雖然病因是多方面的，但其臨床鑒別非常困難，實(shí)驗(yàn)室診斷是病因確診重要途徑，其中血清學(xué)檢測(cè)是主要方法，血清學(xué)檢測(cè)特異性和敏感性直接取決于檢測(cè)試劑純度與質(zhì)量。單克隆抗體具有均一性好，特異性高，性能穩(wěn)定等特點(diǎn)，由其建立方法易于標(biāo)準(zhǔn)化，是疾病診斷發(fā)展趨勢(shì)[5]。

豬流行性腹瀉與豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）、豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PRV）等典型腸道傳染性疾病在流行特征、臨床癥狀和病理變化上非常相似，臨床鑒別非常困難。目前診斷的方法有免疫電鏡法、免疫熒光法、微量血清中和試驗(yàn)、ELISA法、RT-PCR法、膠體金檢測(cè)技術(shù)（GICA）和RT-PCR法等，其中RT-PCR法由于需要特殊儀器設(shè)備還僅限于實(shí)驗(yàn)室診斷，血清學(xué)方法中ELISA檢測(cè)方法和膠體金檢測(cè)技術(shù)是目前臨床檢測(cè)研究的熱點(diǎn)。而血清學(xué)診斷試劑的特異性和敏感性決定檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，由于缺少特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的診斷試劑，在臨床上一直未得到廣泛應(yīng)用。因此，開發(fā)研制快速診斷PED的新型診斷試劑是目前學(xué)者研究的重點(diǎn)。

本研究以PEDV全病毒為免疫原，通過細(xì)胞融合，制備2株特異性強(qiáng)，分泌抗體穩(wěn)定單克隆抗體，以該抗體為基本檢測(cè)試劑，建立檢測(cè)糞便樣品中PEDV雙抗夾心ELISA，該方法檢測(cè)樣品具有敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)樣本大等特點(diǎn)，可為PEDV臨床樣品快速確診提供免疫學(xué)檢測(cè)手段。

1　材料與方法

1.1材料

豬糞便樣品，經(jīng)PEDV PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，采自黑龍江不同發(fā)病豬場(chǎng)，存放于-80℃超低溫冰箱；PEDV、TGEV和PRV細(xì)胞培養(yǎng)物由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)微生物教研室保存；pGEX-6p-S3/BL21大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)誘導(dǎo)可表達(dá)PEDV S蛋白，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)微生物教研室保存[6]；BALB/c小鼠、購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；SP2/0、vero細(xì)胞等為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)微生物教研室保存。單抗亞類鑒定試劑盒購(gòu)自Sigma公司；羊抗小鼠IgG-HRP購(gòu)自中杉金橋公司；DMEM培養(yǎng)基、HAT選擇培養(yǎng)基和HT選擇培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司。

1.2病毒的增殖與純化

取生長(zhǎng)狀況較好的vero細(xì)胞，先用PBS緩沖液洗1次，加1:100稀釋的PEDV細(xì)胞培養(yǎng)物1 mL和6 mg·mL-1胰蛋白酶，置37℃孵育60 min后，加入維持營(yíng)養(yǎng)液，同時(shí)加入6 mg·mL-1胰蛋白酶，放于37℃CO2培養(yǎng)箱中，每天觀察細(xì)胞病變（CPE），待細(xì)胞病變達(dá)90%收獲細(xì)胞液病毒[7-8]。

1.3豬流行性腹瀉病毒的PCR鑒定

PEDV細(xì)胞培養(yǎng)毒樣品，采用常規(guī)Trizol法提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)針對(duì)PEDV M基因引物進(jìn)行PCR[9]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.4豬流行性腹瀉病毒的純化和鑒定

取PEDV細(xì)胞培養(yǎng)物，采用蔗糖密度梯度離心法進(jìn)行純化[10]，純化PEDV進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot鑒定，作為免疫用抗原。

1.5 McAb的制備

純化PEDV按照常規(guī)免疫程序免疫Balb/c小鼠，最后一次免疫后，過72 h摘除眼球放血，處死小鼠。取免疫后小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合[11]。間接ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。采用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行3次亞克隆，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

1.6 McAb特性檢測(cè)

1.6.1 McAb亞類及分泌抗體穩(wěn)定性鑒定

采用Sigma公司單抗亞類鑒定試劑盒鑒定亞型，方法按操作說(shuō)明書進(jìn)行。分泌MAb雜交瘤細(xì)胞體外連續(xù)傳20代后，用間接ELISA法測(cè)定雜交瘤細(xì)胞分泌McAb穩(wěn)定性。

1.6.2間接免疫熒光檢測(cè)

將長(zhǎng)滿單層vero細(xì)胞接種PEDV，按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)操作方法進(jìn)行操作[9]，同時(shí)設(shè)置正常vero細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.6.3 McAb識(shí)別位點(diǎn)鑒定

將表達(dá)PEDV S蛋白重組菌pGEX-6p-S3/BL21按常規(guī)方法誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot分析，觀察所表達(dá)蛋白能否與單抗發(fā)生反應(yīng)。

表1　引物序列Table 1　Primers sequence of DNA fragment

1.6.4單克隆抗體特異性鑒定

使用TGEV、PRV細(xì)胞培養(yǎng)物以及vero細(xì)胞為包被物，同時(shí)設(shè)PEDV陽(yáng)性對(duì)照，SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為陰性對(duì)照。采用間接ELISA檢測(cè)各株雜交瘤細(xì)胞與相關(guān)病毒的反應(yīng)性。

1.7雙抗夾心ELISA方法的建立

1.7.1兔源抗PEDV抗血清適宜稀釋倍數(shù)的確定

0.05 mol·L-1碳酸鹽包被液將兔抗PEDV多抗以1?200、1?400、1?800、1?1 600、1?3 200、1?6 400、1?12 800、1：25 600稀釋，100 μL·孔-1，設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，37℃作用2 h；用PBST洗滌液洗滌3次，5 min·次-1，每孔加入200 μL的5%脫脂乳作封閉液，37℃封閉2 h，同上洗滌3次，PEDV病毒液和正常vero細(xì)胞上清對(duì)照，間隔加入酶標(biāo)板，設(shè)PBS空白對(duì)照，37℃作用2 h，同上洗滌3次，將McAb細(xì)胞上清液加入酶標(biāo)板中，100 μL·孔-1，37℃作用1 h，同上洗滌3次，加入1?2 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，37℃反應(yīng)1 h，同上洗滌3次，加入新配制的OPD-H2O2底物顯色液，37℃顯色15 min，加入2 mol·L-1H2SO4終止液，讀取數(shù)值。以O(shè)D490nm值接近1，S/N>2時(shí)，兔抗PEDV抗血清稀釋度判定為適宜的工作濃度。

1.7.2兔源抗PEDV抗血清適宜的包被條件

兔源抗PEDV血清以最佳倍數(shù)稀釋，分別以0.1、0.05和0.01 mol·L-1碳酸鹽包被，在4℃12 h、37℃1 h加4℃12 h和37℃2 h加4℃12 h條件下組成方陣，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，確定適宜包被條件。

1.7.3不同封閉液濃度和封閉時(shí)間對(duì)封閉效果的影響

首先選擇2%BSA、3%BSA、5%BSA和5%脫脂乳為封閉液，進(jìn)行捕獲抗體包被后的ELISA封閉，不同的封閉液均37℃封閉2 h，其余步驟按照所建立方法操作，根據(jù)OD490nm值以及S/N值的分析選擇最佳封閉液。在此基礎(chǔ)上，選擇適宜的封閉液進(jìn)行37℃60 min、37℃90 min、37℃120 min等不同的封閉時(shí)間，觀察封閉效果。

1.7.4夾心抗原作用時(shí)間

在捕獲抗體加入后，并經(jīng)封閉液封閉后，加入夾心抗原PEDV細(xì)胞培養(yǎng)物，同時(shí)以vero細(xì)胞培養(yǎng)上清液為陰性抗原作對(duì)照，置37℃，分別反應(yīng)30、60和90 min后測(cè)定OD值，確定抗原適宜的作用時(shí)間。

1.7.5酶標(biāo)二抗適宜作用時(shí)間

按照推薦濃度稀釋羊抗鼠IgG-HRP二抗，在37℃溫度條件下，分別孵育45、60、90和120 min，測(cè)定ELISA反應(yīng)的OD值，確定酶標(biāo)二抗的適宜作用時(shí)間。

1.7.6顯色時(shí)間的確定

在ELISA反應(yīng)中，分別于37℃顯色10、15和20 min，測(cè)定OD值，以確定合適的顯色時(shí)間。

1.8 ELISA陰、陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

采用建立的ELISA方法，對(duì)經(jīng)RT-PCR鑒定為陰性的糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算OD490nm平均值（Mean）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），陽(yáng)性臨界值=陰性樣品+ 3SD。檢測(cè)時(shí)，當(dāng)樣品OD490nm>陽(yáng)性臨界值，并且陽(yáng)性對(duì)照/陰性對(duì)照>2時(shí)，判定為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.9雙抗夾心ELISA病原檢測(cè)的特異性

雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)TGEV、PRV以確定ELISA方法的特異性。

1.10雙抗夾心ELISA病原檢測(cè)的敏感性

從1?50開始二倍稀釋通過細(xì)胞培養(yǎng)的PEDV，建立四個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度取100 μL，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，確定最低檢出量

1.11抗原捕捉ELISA病原檢測(cè)的重復(fù)性

1.11.1板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

在同一酶標(biāo)板內(nèi)對(duì)5個(gè)不同批次的PEDV細(xì)胞毒進(jìn)行抗原捕捉ELISA法檢測(cè)，每個(gè)樣品作4個(gè)平行孔，測(cè)定OD490nm值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算變異系數(shù)。

1.11.2板間重復(fù)性試驗(yàn)

用不同的酶標(biāo)板進(jìn)行同一批次的PEDV細(xì)胞毒抗原捕捉ELISA法檢測(cè)，測(cè)定OD490nm值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算變異系數(shù)。

1.12臨床樣品處理和雙抗夾心ELISA檢測(cè)

取臨床發(fā)生腹瀉，并經(jīng)RT-PCR檢測(cè)PEDV陽(yáng)性糞便樣品和外表健康豬糞便樣品與pH7.4 PBS1?4混合，微型旋渦振蕩5 min，3 000 r·min-14℃離心10 min，收集上清。按照本試驗(yàn)建立的ELISA檢測(cè)方法與RT-PCR同時(shí)檢測(cè)，并將兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，確定該方法的特異性、敏感性和符合率。

2　結(jié)果與分析

2.1 PEDV的增殖

如圖1所示，vero細(xì)胞在接毒68 h后，細(xì)胞的病變已基本達(dá)到可收集程度。同樣條件下的對(duì)照組細(xì)胞則長(zhǎng)勢(shì)正常。大量收集此時(shí)的病變細(xì)胞，最后純化制備所需免疫原。

圖1　PEDV在vero細(xì)胞上的CPE Fig. 1　CPE of PEDV in vero cells

2.2豬流行性腹瀉病毒的PCR鑒定結(jié)果

如圖2所示，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后觀察，以上所得到的PEDV抗原經(jīng)RT-PCR能擴(kuò)增出大小為412 bp的片段，與預(yù)期大小一致。

2.3純化后PEDV病毒SDS-PAGE鑒定

用蔗糖密度梯度離心法純化病毒，純化后的病毒樣品經(jīng)SDS-PAGE、Western Blot檢測(cè)，顯示有多條目的帶，與PEDV結(jié)構(gòu)蛋白大小相符，且雜蛋白帶較少（見圖3）。以上結(jié)果表明提純的病毒抗原是結(jié)構(gòu)較完整的PEDV病毒。

2.4雜交瘤細(xì)胞分泌PEDV MAb的穩(wěn)定性及其亞類鑒定結(jié)果

用間接ELISA方法進(jìn)行篩選，經(jīng)過多次克隆和篩選，并經(jīng)多次凍存與復(fù)蘇，復(fù)蘇后體外連續(xù)傳代，獲得2株能穩(wěn)定分泌抗PEDV MAb的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為5F4和5B3。亞類鑒定結(jié)果表明均屬IgM亞類。

圖2　RT-PCR檢測(cè)樣品Fig. 2　Detection of the samples by RT-PCR

圖3　PEDV全病毒的SDS-PAGE、Western Bolt鑒定結(jié)果Fig. 3　SDS-PAGE and Western Bolt analysis of the PEDV

2.5間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

接種PEDV的vero細(xì)胞分別與2株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液和SP2/0細(xì)胞上清液作用，采用間接免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示與雜交瘤細(xì)胞上清液作用的細(xì)胞發(fā)出不同程度的綠色閃亮熒光，而與SP2/0細(xì)胞上清液作用的細(xì)胞未發(fā)出熒光，說(shuō)明2株單抗均能與PEDV全病毒發(fā)生特異性反應(yīng)（見圖4）。

2.6 pGEX-6p-S3/BL21誘導(dǎo)表達(dá)PEDV S蛋白的SDS-PAGE分析

pGEX-6p-S3/BL21誘導(dǎo)表達(dá)如圖5所示，與2泳道比較在1泳道中有一條約58 ku的蛋白帶，與預(yù)期相符表達(dá)正確。

圖4　三種細(xì)胞培養(yǎng)上清液與接種PEDV的vero細(xì)胞間接免疫熒光染色結(jié)果Fig. 4　Result of interaction between vero cells inoculated with PEDV and 3 types of supernatant

圖5　重組S3蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig. 5　SDS-PAGE analysis of expressed recombinant pGEX-6p-S3 protein

2.7 McAb識(shí)別位點(diǎn)的鑒定

將表達(dá)PEDV S蛋白的pGEX-6p-S3/BL21誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot分析，結(jié)果表明，5F4和5B3單克隆抗體均能與表達(dá)的58 ku 的S蛋白發(fā)生反應(yīng)，見圖6。

2.8單克隆抗體與其他豬腹瀉相關(guān)病毒反應(yīng)性

以間接ELISA測(cè)定雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清液與不同的腹瀉病毒反應(yīng)情況，結(jié)果表明（見表2）。

由表2可知，2株雜交瘤細(xì)胞與PEDV反應(yīng)的S/N值均大于2，而與VERO、TGEV、PRV反應(yīng)的S/N值均小于1。上述結(jié)果說(shuō)明，制備獲得的2株單抗與TGEV、PRV不發(fā)生交叉反應(yīng)，對(duì)PEDV具有較強(qiáng)的特異性。

圖6　Western Blotting檢測(cè)單克隆抗體Fig. 6　Detection of monoclonal antibody by Western Blotting

表2　單抗特異性鑒定結(jié)果Table 2　Specialization test of McAbs

2.9雙抗夾心ELISA方法的建立

2.9.1抗體最佳稀釋倍數(shù)的確定

通過ELISA試驗(yàn)，包被倍比稀釋的兔抗PEDV血清，以單抗上清液作為第二抗體，結(jié)果顯示（見圖7）：OD490nm值隨著稀釋倍數(shù)的增加在1?800倍稀釋時(shí)有明顯降低趨勢(shì)，此時(shí)OD值接近1，S/N> 2。因此確定1: 800倍稀釋為捕獲抗體的最適宜稀釋倍數(shù)。

圖7　兔抗PEDV多抗最佳工作濃度的確定Fig. 7　Determination of the optimal working concentration of Rabbit-PEDV PcAb

2.9.2最佳包被條件確定

分別以0.01、0.05和0.1 mol·L-1碳酸鹽稀釋抗體，不同包被條件下進(jìn)行方陣法檢測(cè)。結(jié)果表明，以0.01 mol·L-1碳酸鹽稀釋抗體包被時(shí)，包被時(shí)間4℃12 h與37℃1 h加4℃12 h相比差別不大；以0.1 mol·L-1碳酸鹽稀釋抗體包被時(shí)，以包被時(shí)間4℃12 h最佳；以0.05 mol·L-1碳酸鹽稀釋抗體包被時(shí)，以包被時(shí)間37℃1 h加4℃12 h為最佳，包被時(shí)間4℃12 h反而最差。根據(jù)S/N最大值，確定0.05 mol·L-1碳酸鹽稀釋，以37℃1 h加4℃12 h包被為最佳條件（見圖8）。

2.9.3封閉液的確定

選用不同的封閉液進(jìn)行封閉，進(jìn)行抗原捕捉ELISA檢測(cè)。結(jié)果如圖9，可見5 %脫脂乳封閉效果最佳，S/N值最大，陰性值最低。因此確定最佳封閉液是5 %脫脂乳。

圖8　最佳包被條件確定Fig. 8　Determination of the Optimal coating conditions

圖9　封閉時(shí)間的選擇Fig. 9　Determination of the optimal blocking buffer

2.9.4封閉時(shí)間的確定

在確定封閉液后，對(duì)其封閉時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)行抗原捕捉ELISA檢測(cè)。結(jié)果如圖10，可見，封閉時(shí)間為60 min時(shí)，S/N值最大，陰性值較低。確定最佳封閉時(shí)間為60 min。

2.9.5夾心抗原作用時(shí)間的確定

兔多抗以合適的稀釋度進(jìn)行包被，分別加入PEDV和vero細(xì)胞上清后，置37℃分別反應(yīng)30、60 和90 min進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，反應(yīng)時(shí)間為60 min時(shí)，陽(yáng)性值最高，

但是陰性值居中，S/N值居中。從總體趨勢(shì)來(lái)看，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性值變化不大，陰性值越來(lái)越低，S/N值越來(lái)越大，確定37℃反應(yīng)90 min為抗原合適的作用時(shí)間（見圖11）。

2.9.6酶標(biāo)二抗作用時(shí)間的確定

加入羊抗鼠IgG-HRP二抗（1?2 000稀釋）后，在37℃條件下，分別作用45、60、90和120 min，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性和陰性值均升高，S/N值隨時(shí)間增加而降低，45 min為適宜的作用時(shí)間，37℃作用45 min為合適的反應(yīng)條件（見圖12）。

圖10　待檢樣品孵育時(shí)間的確定Fig. 10　Determination of the optimal incubating time of sample

圖11　抗原最佳作用時(shí)間的測(cè)定Fig. 11　Determination of optimal reaction time of antigen

圖11　抗原最佳作用時(shí)間的測(cè)定Fig. 11　Determination of optimal reaction time of antigen

2.9.7顯色時(shí)間的確定

相同條件，分別37℃顯色10、15和20 min，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。結(jié)果（見圖13）顯示，陽(yáng)性和陰性O(shè)D490nm值隨著顯色時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，同時(shí)非特異性也增高。從S/N值分析，可以看出，顯色10 min比15 min S/N值高一些，表明并不是時(shí)間越長(zhǎng)，反應(yīng)效果越好；反應(yīng)時(shí)間增加到20 min時(shí)，S/N值比反應(yīng)15 min時(shí)高，表明有非特異性反應(yīng)。確定37℃顯色10 min為合適的反應(yīng)條件。

圖13　最佳顯色時(shí)間的測(cè)定Fig. 13　Determination of substrate optimal reaction time

2.10 ELISA陰、陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

取臨床PEDV RT-PCR檢測(cè)陰性豬糞便樣品，進(jìn)行雙抗體ELISA，其平均OD值為0.267±0.033，根據(jù)公式陽(yáng)性臨界值= +3SD計(jì)算，確定為當(dāng)S/N> 2.1，同時(shí)OD490nm值≥0.37時(shí)，則判為陽(yáng)性，否則為陰性。

2.11特異性試驗(yàn)

用建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)分別含有TGEV、PRV及PEDV的糞便樣品，結(jié)果顯示TGEV和PRV檢測(cè)均為陰性，PEDV檢測(cè)為陽(yáng)性，表明本方法特異性較好。

2.12靈敏性試驗(yàn)

將PEDV細(xì)胞培養(yǎng)物以不同倍數(shù)稀釋，同時(shí)設(shè)立陰性、陽(yáng)性作對(duì)照，采用建立的ELISA方法檢測(cè)，結(jié)果表明，隨著病毒含量的降低，其OD490nm值呈線性下降，當(dāng)病毒1?200稀釋時(shí)（5×103.67TCID50/mL），結(jié)果為陽(yáng)性（OD490nm值為0.432），而稀釋度為1?400時(shí)（2.5×103.67TCID50/mL），結(jié)果為陰性（OD490nm值為0.262），表明該方最低檢測(cè)限為5× 103.67TCID50/mL。

2.13抗原捕捉ELISA方法重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)5個(gè)不同批次的PEDV細(xì)胞培養(yǎng)毒進(jìn)行板內(nèi)和板間重復(fù)性試驗(yàn)。板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表3，計(jì)算其變異系數(shù)在1.1%~4.2%。板間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表4，計(jì)算其變異系數(shù)在1.1%~9%。兩個(gè)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%，說(shuō)明本試驗(yàn)建立的抗原捕捉ELISA法具有良好的重復(fù)性。

表3　板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)Table 3　Repeatability test in one plate

2.14雙抗夾心ELISA臨床樣品檢測(cè)

采用本試驗(yàn)建立的雙抗體夾心ELISA方法與RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)48份豬糞便樣品，檢測(cè)結(jié)果顯示：本試驗(yàn)建立的ELISA方法共檢出陽(yáng)性樣品19份（見表5），而RT-PCR方法檢測(cè)出陽(yáng)性樣品21份。對(duì)兩方法結(jié)果進(jìn)行比較顯示，RT-PCR方法檢測(cè)為陰性的樣品，本試驗(yàn)建立的雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)也為陰性，而RT-PCR方法檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品中有兩份樣品本方法檢測(cè)為陰性（如圖14第1、4泳道）。據(jù)此可知，陰性樣品的符合率為100%（27/27），陽(yáng)性樣品的符合率為90.5%（19/21），表明建立的雙抗體夾心ELISA方法具有較高的準(zhǔn)確性和特異性，可以用于感染PEDV的糞便樣品檢測(cè)。

表4　板間重復(fù)性試驗(yàn)Table 4　Repeatability test among different plates

表5　抗原捕捉ELISA方法檢測(cè)臨床樣品Table 5　Detection of the clinical samples by antigen capture ELISA

圖14　RT-PCR檢測(cè)臨床樣品Fig. 14　Detection of the clinical positive samples by RT-PCR

3　討論與結(jié)論

目前針對(duì)PEDV單克隆抗體的制備主要采用全病毒和重組蛋白作為免疫原，重組蛋白主要采用原核或真核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，由于PEDV的抗原表位目前了解較少，一般表達(dá)重組蛋白均根據(jù)軟件預(yù)測(cè)PEDV抗原表位，以其作為免疫原制備單抗存在反應(yīng)性不好、不穩(wěn)定、不能夠同糞便中PEDV發(fā)生反應(yīng)等問題，而全病毒作為免疫原，一般有機(jī)會(huì)篩選出反應(yīng)性好、特異性強(qiáng)、能夠直接檢測(cè)PEDV單克隆抗體。所以本研究采用細(xì)胞培養(yǎng)PEDV作為免疫原，采用蔗糖密度梯度離心方法進(jìn)行純化[11]，不僅提純抗原純度及活性較高，而且病毒形態(tài)較完整，更接近于天然病毒，保持病毒本身抗原性。為能獲得針對(duì)PEDV表面結(jié)構(gòu)蛋白單抗，本試驗(yàn)在收病毒液時(shí)盡量減少反復(fù)凍融次數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果也表明，通過Western Blot試驗(yàn)，將單抗上清與本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)PEDV S蛋白作用，兩株單抗均能與PEDV S蛋白S3區(qū)（951aa-1383aa）發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明這兩株單抗識(shí)別位點(diǎn)是PEDV S蛋白951aa-1383aa區(qū)域中某一個(gè)抗原表位。在PEDV結(jié)構(gòu)蛋白中，S蛋白屬于病毒表面蛋白，因此在實(shí)際檢測(cè)中，不需要裂解處理病料中病毒粒子即可檢測(cè)到該蛋白。

本試驗(yàn)采用純化后PEDV作為免疫原，腹腔注射BALB/c小鼠，經(jīng)間接ELISA法檢測(cè)顯示小鼠血清抗體水平較高，說(shuō)明免疫效果確實(shí)達(dá)到較好試驗(yàn)效果。所獲得2株雜交瘤細(xì)胞通過間接ELISA、間接免疫熒光檢測(cè)證實(shí)其與病毒均可發(fā)生良好反應(yīng)，而特異性試驗(yàn)證明不與其他腹瀉病毒發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明所制備單抗可用于PEDV病原檢測(cè)。本研究表明此兩株單抗可以應(yīng)用于針對(duì)PEDV抗原檢測(cè)診斷試劑研制，為建立PEDV快速檢測(cè)系統(tǒng)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)；并且提示PEDV S蛋白951aa-1383aa區(qū)域可能有一個(gè)抗原表位存在。因此，本試驗(yàn)篩選所獲單克隆抗體可用于PEDV S蛋白抗原結(jié)構(gòu)及功能研究、膠體金檢測(cè)技術(shù)研究和抗原捕捉ELISA方法的建立，進(jìn)而為PEDV后續(xù)研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

豬流行性腹瀉是典型消化道傳染病，病毒粒子隨著糞便大量排出，造成病毒擴(kuò)散導(dǎo)致仔豬大批死亡。取糞便樣品進(jìn)行病原檢測(cè)，對(duì)該病早期診斷具有重要意義。本試驗(yàn)制備兩株能夠與PEDV全病毒發(fā)生反應(yīng)單抗和一種兔抗PEDV高免血清；利用多抗作為捕獲抗體，單抗作為第二抗體建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法；通過方陣試驗(yàn)確定兔抗PEDV最佳稀釋度為1?800，通過試驗(yàn)確定該方法陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為S/N>2，同時(shí)OD490nm≥0.37；該方最低檢測(cè)限為5×103.67TCID50/mL，用建立的方法檢測(cè)含有PEDV、TGEV、PRV糞便，檢測(cè)結(jié)果顯示含PEDV樣品檢測(cè)為陽(yáng)性，其余為陰性，表明本方法有較好的特異性。ELISA方法與PCR方法相比較結(jié)果顯示，RT-PCR方法檢測(cè)為陰性樣品，同時(shí)本試驗(yàn)所建立雙抗體夾心ELISA方法，檢測(cè)也為陰性，而RT-PCR方法檢測(cè)為陽(yáng)性樣品中有兩份樣品本方法檢測(cè)為陰性，據(jù)此得出結(jié)論，陰性樣品符合率為100%（27/27），陽(yáng)性樣品符合率為90.5% （19/21），說(shuō)明與PCR檢測(cè)病原比較，該方法特異性強(qiáng)，但敏感性要低于PCR方法[12-13]，因此，在實(shí)驗(yàn)室精確診斷中，所建立雙抗體夾心ELISA方法可以用于PEDV檢測(cè)。該方法有操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)檢測(cè)大量樣本。

綜上所述，本試驗(yàn)建立檢測(cè)PEDV抗原捕捉ELISA方法適合基層現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)需要。

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作者簡(jiǎn)介：李一經(jīng)（1960-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物與免疫學(xué)。E-mail: yijingli@163. com

基金項(xiàng)目：科技部863計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA101304-3）；黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新基金（2011TD001）

收稿日期：2014-03-04

文章編號(hào)：1005-9369（2015）02-0001-10

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號(hào)：S767.5；X172