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半滑舌鰨腹水癥病原的分離鑒定

徐曉麗，尤宏爭，宋昀鵬，鐘文慧，李賀密*

（天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，天津300221）

摘要：從患病半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）內(nèi)臟及腹水中分離到優(yōu)勢菌株8301，回歸感染試驗證實菌株8301對半滑舌鰨具有致病性；采用形態(tài)學(xué)觀察、生化特性分析、16S rDNA基因序列分析等方法對所分離菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，菌株8301為革蘭氏陽性球菌，生化特性與海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）較為接近，以16S rDNA基因為遺傳標(biāo)記構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹將菌株8301與海豚鏈球菌聚為一支，置信度為96%。結(jié)果判定引起此次半滑舌鰨腹水病的病原菌為海豚鏈球菌。對24種抗菌藥物敏感性分析試驗證實菌株8301對制霉菌素、利福平、青霉素、阿奇霉素等敏感，對羅紅霉素、呋喃唑酮等具有抗性。

關(guān)鍵詞：半滑舌鰨;腹水癥;海豚鏈球菌; 16S rDNA

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-3-13 15:23:00

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150313.1523.010.html

徐曉麗,尤宏爭,宋昀鵬,等.半滑舌鰨腹水癥病原的分離鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2015, 46(3): 74-80.

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）屬鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，俗稱牛舌頭、鰨米、鰨目等，是暖溫性近海大型底層鰨類。該魚肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，生長快，出肉率高，適溫范圍廣，是我國北方重要工廠化養(yǎng)殖品種之一，市場價格高。然而近年來在高密度、集約化循環(huán)水養(yǎng)殖模式下，病害問題日益嚴(yán)重。2011年以來天津地區(qū)養(yǎng)殖半滑舌鰨陸續(xù)出現(xiàn)爛鰭、腹水、體表潰爛、內(nèi)臟白點等癥狀，尤其是腹水癥，造成高死亡率，損失嚴(yán)重，產(chǎn)量和養(yǎng)殖面積急劇減少，已成為制約半滑舌鰨產(chǎn)業(yè)發(fā)展重要因素之一。

對半滑舌鰨腹水癥，尚無統(tǒng)一病名，多種病原均可引起半滑舌鰨腹水癥狀。國內(nèi)學(xué)者對半滑舌鰨腹水癥相關(guān)報道中，張曉君等采集江蘇連云港市發(fā)生出血及腹水癥的半滑舌鰨進(jìn)行病原分離鑒定，認(rèn)為該病是由鰻利斯頓氏菌（Listonella an?guillarum）引起[1]；陳政強等從患赤皮及腹水癥的半滑舌鰨體內(nèi)分離到輪蟲弧菌（Vibrio rotiferianus）及哈維氏弧菌（V. harveyi）[2]，人工感染試驗證實這兩株菌均可獨立引起半滑舌鰨發(fā)??；張正等在出現(xiàn)腹水癥狀的半滑舌鰨腎臟和肝臟組織中發(fā)現(xiàn)病毒粒子存在[3]。本研究采集患腹水癥的半滑舌鰨，從病魚內(nèi)臟及腹水中分離細(xì)菌，對分離到的優(yōu)勢菌株進(jìn)行生化特性鑒定、致病性分析及菌株P(guān)CR鑒定，以16S rDNA為遺傳標(biāo)記構(gòu)建該菌系統(tǒng)發(fā)育樹，探明本次腹水癥病原。本研究可豐富半滑舌鰨疾病研究資料，并通過分析所分離菌株藥敏特性，為半滑舌鰨腹水癥治療提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗魚來源

患腹水癥的半滑舌鰨取自天津漢沽某工廠化養(yǎng)殖公司，體長約15~28 cm。回歸感染試驗用健康半滑舌鰨購自天津市海升水產(chǎn)養(yǎng)殖公司，體長（16±2）cm，體質(zhì)量（34±3）g，暫養(yǎng)于75 L塑料整理箱中，30尾·箱-1，試驗期間采用充氣泵充氧，保持水溫24℃，鹽度2.2%，日投餌2次，暫養(yǎng)7 d后進(jìn)行人工感染試驗。

1.2病原菌分離

取患病半滑舌鰨，酒精棉球擦拭魚體表，以無菌注射器從病魚腹腔內(nèi)抽取腹水，涂布于BHI培養(yǎng)基平板；取接種針滅菌后刺入病魚肝、腎等病變組織接種細(xì)菌，劃線接種于BHI平板，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，編碼8301，將純培養(yǎng)的菌液用BHI凍存液（含15%甘油的BHI液體培養(yǎng)基）保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3回歸感染試驗

將分離到的菌株8301接種于含10%新生牛血清的BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，收集菌液以0.01 mol·L-1無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，調(diào)整菌懸液密度分別為3×108、3×107、3×106和3×105cfu·mL-1，用于感染試驗。

感染試驗用健康的半滑舌鰨分5組，飼養(yǎng)于50 cm×40 cm×35 cm玻璃缸中，每組10尾，其中1組為對照組。感染試驗采用腹腔注射方式進(jìn)行，試驗組每尾注射0.1 mL不同密度菌懸液，對照組注射等量無菌PBS。試驗周期為14 d，期間正常投喂換水，每天觀察魚的狀態(tài)，記錄發(fā)病和死亡情況，另取瀕死魚再次進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.4病原菌鑒定

1.4.1形態(tài)與生化特性鑒定

將菌株8301劃線接種于BHI平板，觀察其菌落特征，挑取單菌落制作細(xì)菌涂片做革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)。生化特性參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》[4-5]，取純化后的細(xì)菌接種于生化鑒定管（購自杭州天和微生物有限公司），進(jìn)行生化特性鑒定。

1.4.2 16S rDNA基因序列擴增

挑取純化后的菌株8301單菌落于DEPC水中，沸水煮5 min，瞬時離心后取上清作為PCR反應(yīng)模板。16S rDNA基因序列擴增參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行，PCR擴增產(chǎn)物交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.4.3菌株8301的PCR鑒定

菌株8301的PCR鑒定參照Zlotkin等所建立方法[7]，采用特異性引物擴增海豚鏈球菌16S rD?NA保守序列，以海豚鏈球菌作為陽性對照，以無乳鏈球菌和哈維氏弧菌作為陰性對照，擴增結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果。

1.4.4 16S rDNA基因序列分析

將測序所得16S rDNA基因序列提交至Gen?Bank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，根據(jù)返回結(jié)果從GenBank中選擇同源性較高的細(xì)菌16S rDNA基因序列，采用Clustalx軟件比對，用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件Mega 5.2基于鄰接法（Neighbor-joining，NJ法）構(gòu)建以16S rDNA為遺傳標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育樹，Boot?straps重復(fù)檢驗1 000次。1.5藥敏試驗

藥敏試驗采用紙片擴散法（Kindy-Bauer，KB法）進(jìn)行。調(diào)整菌株8301菌液的麥?zhǔn)蠞舛戎?.5，均勻涂布于培養(yǎng)基平板，用無菌鑷子將不同藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基表面，將該平板置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，記錄各個藥敏紙片的抑菌圈直徑（mm）。根據(jù)抑菌圈直徑大小以及藥敏紙片的產(chǎn)品說明，判定該菌株對抗生素的敏感性。

2　結(jié)果與分析

2.1病魚臨床癥狀

病魚反應(yīng)遲鈍，不食，在水中呈螺旋式游動，時而狂游，體色變淺，腹腔腫脹有腹水，鰓小片充血水腫，眼睛充血發(fā)紅或渾濁發(fā)白，腸壁極薄，腸道內(nèi)充滿清亮的液體（見圖1）。解剖發(fā)現(xiàn)肝臟發(fā)白或呈血紅色，脾臟腎臟均呈鮮紅色。取鰓、體表粘液及病變組織制作水浸片顯微鏡下觀察，未發(fā)現(xiàn)真菌及寄生蟲。從病魚腹水及肝臟、腎臟中分離到優(yōu)勢菌株8301，轉(zhuǎn)接到血平板上培養(yǎng)，形成明顯的β溶血環(huán)。

圖1　患病的半滑舌鰨癥狀Fig. 1　Symptoms of diseased Cynoglossus semilaevis

2.2人工感染試驗

以純培養(yǎng)的菌株8301菌液感染健康的半滑舌鰨，在感染3 d后開始出現(xiàn)游泳異常、旋轉(zhuǎn)狂游等行為，4 d后開始出現(xiàn)死亡，至14 d感染試驗結(jié)束，注射菌液濃度為3×107cfu·mL-1以上的試驗魚全部死亡，而對照組無一死亡，未表現(xiàn)明顯異常（見表1）。感染死亡的病魚，腹部明顯隆起內(nèi)有腹水，肝臟發(fā)白或呈血紅色，脾臟、腎臟呈鮮紅色，腸道無食，與自然感染狀態(tài)相似。從人工感染后發(fā)病的瀕死魚內(nèi)臟及腹水接菌劃線于BHI平板，得到與菌株8301一致的具有β溶血活性的白色菌落，革蘭氏染色顯示形態(tài)與菌株8301一致，說明菌株8301是導(dǎo)致半滑舌鰨腹水癥的病原菌。

表1　菌株8301的人工感染試驗結(jié)果Table 1　Results of artificial infection of strain 8301

2.3病原菌常規(guī)鑒定結(jié)果

菌株8301菌落呈白色圓形，濕潤，邊緣整齊不透明，菌株生長較慢，在BHI平板上28℃培養(yǎng)24 h后，菌落直徑為0.1~0.3 mm。菌株8301為革蘭氏陽性球菌，直徑0.6~0.8 μm，呈長短不一的鏈狀排列（見圖2）。菌株8301不運動，氧化酶與接觸酶均為陰性，吡咯烷酮-β-萘胺（PYRA）陽性，聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）與β-半乳糖苷酶為陰性，水解馬尿酸鹽、七葉靈，具精氨酸脫羧酶活性，能夠利用蔗糖、簟糖、葡萄糖、甘露醇、核糖、水楊甘、半乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸，不能利用阿拉伯糖、棉籽糖、乳糖等，生化特性與海豚鏈球菌較一致（見表2），初步判定菌株8301為海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）。

圖2　菌株8301的菌落和菌體形態(tài)Fig. 2　Colony and cell morphology of strain 8301

表2　菌株8301和海豚鏈球菌的生理生化特征的比較Table 2　Comparison of physiological and chemicalcharacteristics of strain 8301 and S. iniae

2.4 16S rDNA基因序列分析

以16S rDNA通用引物B27F及1492R擴增菌株8301的16S rDNA基因序列，得到約1 500 bp基因片段（見圖3），測序后將該序列與GenBank中已提交的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示菌株8301與海豚鏈球菌（DQ303187.1）的16S rD?NA基因序列高度一致，相似度為99.86%。選取相關(guān)性較高的10余株細(xì)菌的16S rDNA基因序列運用Clustal 1.81軟件進(jìn)行多重序列比對分析，并采用Mega 5.2軟件基于N-J法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將菌株8301與海豚鏈球菌（DQ303187.1、AB593340.1）聚為一支，置信度為96%（見圖4），而采用已建立的海豚鏈球菌PCR方法特異性擴增該菌16S基因的保守區(qū)域，得到預(yù)期300 bp的目的片段（見圖3）；進(jìn)一步證實所分離菌株8301為海豚鏈球菌。由此再結(jié)合菌株8301的形態(tài)及生理生化特性，鑒定菌株8301為海豚鏈球菌。

圖3　菌株8301 16S rDNA基因擴增及PCR鑒定結(jié)果Fig. 3　Results of strain 8301 16S rDNAamplification and PCR identification

2.5藥敏試驗

在供試的24種抗生素中，菌株8301對制霉菌素、利福平、青霉素、阿奇霉素等7種藥物敏感，對強力霉素、氟苯尼考、桿菌肽等5種藥物中度敏感，對羅紅霉素、恩諾沙星、磺胺異噁唑、呋喃唑酮、諾氟沙星、紅霉素等12種藥品表現(xiàn)出抗性（見表3）。

圖4　以16S rDNA基因構(gòu)建的鏈球菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4　Phylogenetic relationship among the Streptococcus species based on analysis of 16S rDNA gene sequences

表3　菌株8301藥敏試驗結(jié)果Table 3　Results of sensitivity test to strain 8301

3　討論與結(jié)論

魚類鏈球菌病在世界范圍內(nèi)能夠危害多種海淡水養(yǎng)殖魚類，尤其是集約化養(yǎng)殖魚類，傳播快，短時間內(nèi)可造成大批魚類死亡，帶來嚴(yán)重經(jīng)濟損失，是魚類最重要的致病菌之一。引起魚類鏈球菌病的病原主要有海豚鏈球菌（S. iniae）、無乳鏈球菌（S. agalactiae）、副乳房鏈球菌（S. parau?beris）、停乳鏈球菌（S. dysgalactiae）、格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）等，不同鏈球菌引起的疾病表現(xiàn)出的癥狀相似，如敗血癥、腦膜炎等[7]。其中海豚鏈球菌具有最廣泛的宿主范圍，自1976年發(fā)現(xiàn)以來，先后在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、羅非魚（Oreochromis speices）、牙鲆（Paralichthys oliva?ceus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、澳洲肺魚（barramundi）、銀鼓魚（Selenotoca multifasciata）、斑馬魚（Danio rerio）、紅擬石首魚（Sciaenops ocel?latus）、斑點叉尾鯉回（Ictalurus punctatus）、美國紅魚（Sciaenops ocellatus）等至少27種養(yǎng)殖和野生魚類中發(fā)現(xiàn)海豚鏈球菌，同時該菌可在不同種魚類之間交叉?zhèn)鞑ィ：薮?，引起重大損失遍及美國、以色列、南非、日本、澳大利亞、中國、菲律賓、臺灣等國家和地區(qū)[8-14]。

本研究首次從患腹水癥的半滑舌鰨內(nèi)臟及腹水中分離到優(yōu)勢菌株8301，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生化特性分析、16S rDNA基因序列分析鑒定為海豚鏈球菌，豐富海豚鏈球菌研究資料；回歸感染試驗證實菌株8301對半滑舌鰨具有較強致病性，注射濃度為3×105cfu·mL-1菌液，即可引起70%死亡率，為此次半滑舌鰨腹水癥的致病菌，但本次人工注射感染的魚并未出現(xiàn)腸壁薄內(nèi)充無色清液的癥狀，可能由于病原毒力強、魚類急性死亡導(dǎo)致，準(zhǔn)確的菌株8301的半數(shù)致死量，還需進(jìn)一步試驗驗證。

海豚鏈球菌在鏈球菌屬中較為特殊，傳統(tǒng)的Lancefield鏈球菌血清型不能將其進(jìn)行準(zhǔn)確分組，不同地理株系又在生化特性上存在一定差異，以致曾被鑒定為另一新種“Streptococcus shiloi”[15-16]。本研究中對海豚鏈球菌生化特性的比較分析，除參考伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊（9thed.），還借鑒從不同宿主獲得的多個海豚鏈球菌分離株的生化特性，認(rèn)為本次所分離菌株8301的生化特性與海豚鏈球菌最為接近[5, 8-12]。分子生物學(xué)鑒定近年來廣泛應(yīng)用于水生動物病原菌的分類和鑒定中，其中16S rDNA基因是在進(jìn)化上最為保守的基因之一，由高度保守區(qū)和可變區(qū)組成，遺傳穩(wěn)定，對細(xì)菌鑒定具有重要價值。

本研究擴增菌株8301的16S rDNA基因序列并進(jìn)行測序，從同源比對及聚類分析結(jié)果來看，菌株8301的16S rDNA基因序列與海豚鏈球菌（DQ303187.1）同源性最高，在系統(tǒng)發(fā)育樹上與海豚鏈球菌聚為一支。因此結(jié)合形態(tài)特征、生化特性和分子生物學(xué)水平鑒定，確定菌株8301為海豚鏈球菌。另外本研究還應(yīng)用Zlotkin等[7]報道的海豚鏈球菌核糖體RNA基因特異性引物進(jìn)行分離株16S rDNA基因保守片段的擴增，得到預(yù)期300 bp長度的基因片段，由此進(jìn)一步確定菌株8301為海豚鏈球菌。

對于海豚鏈球菌引起的疾病，宜通過藥敏試驗選擇最有效的抗生素用于治療，但藥敏試驗受試驗條件和時間限制，篩選能力有限，生產(chǎn)上多是憑經(jīng)驗用藥。一般認(rèn)為，海豚鏈球菌對紅霉素、萬古霉素敏感[11, 14]，羅璋等從銀鼓魚分離的菌株對恩諾沙星、羅紅霉素、強力霉素、四環(huán)素、左氟沙星均敏感[9]，陳德芳分離的海豚鏈球菌株對強力霉素、紅霉素、萬古霉素、恩諾沙星、諾氟沙星敏感，而對青霉素不敏感[10]，沈智華所分離的海豚鏈球菌菌株對先鋒V、氨芐青霉素、青霉素、萬古霉素敏感[10]；本研究所分離菌株8301對青霉素敏感，對強力霉素、四環(huán)素中度敏感，對諾氟沙星、恩諾沙星、紅霉素、羅紅霉素具有抗性。不同分離株藥物敏感性差異可能與各地區(qū)抗生素使用及細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。而海豚鏈球菌為革蘭氏陽性菌，且為白細(xì)胞內(nèi)“寄生菌”，國標(biāo)漁藥中規(guī)定的抗生素類藥物中，抗革蘭氏陽性菌的藥物非常少，如本研究中，對菌株8301敏感的阿奇霉素、青霉素、左氟沙星、慶大霉素等，均不在國標(biāo)漁藥之列，且常規(guī)5~7 d的用藥療程也無法達(dá)到良好的療效。

對于魚類鏈球菌病，預(yù)防比治療更為重要，在日常養(yǎng)殖過程中，降低養(yǎng)殖密度、規(guī)范飼養(yǎng)管理、合理使用微生態(tài)制劑、嚴(yán)控苗種質(zhì)量、適當(dāng)投喂免疫增強劑、減少魚體應(yīng)激、及時采取有效消毒與隔離措施等均能有效降低疾病發(fā)生機率[17]。此外疫苗使用也可有效預(yù)防該病發(fā)生。以色列、日本、西班牙等國已采取注射鏈球菌疫苗方式預(yù)防魚類鏈球菌感染，美國研制的海豚鏈球菌滅活疫苗在羅非魚免疫保護(hù)試驗中取得很好保護(hù)效果，尤其是腹腔接種疫苗，相對保護(hù)率可達(dá)93.2%。商業(yè)化疫苗格氏乳球菌和海豚鏈球菌二聯(lián)苗經(jīng)檢測對虹蹲可產(chǎn)生3~6個月的免疫保護(hù)力[18]。但由于海豚鏈球菌不同血清型的出現(xiàn)以及細(xì)菌表面抗原漂變，滅活疫苗最好采集當(dāng)年、當(dāng)?shù)匕l(fā)病魚樣本制作。目前，國內(nèi)廣西水產(chǎn)研究所和中山大學(xué)均在研制羅非魚海豚鏈球菌疫苗，中科院海洋研究所構(gòu)建牙鲆源海豚鏈球菌Sip11重組亞單位疫苗，并申請專利，但生產(chǎn)應(yīng)用還需較長一段時間。

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Isolation and identification of pathogenic bacterium associated with

ascites in Cynoglossus semilaevisis/XU Xiaoli, YOU Hongzheng, SONG Yunpeng,

ZHONG Wenhui, LI Hemi (Tianjin Fishery Technical Extension Department, Tianjin 300221, China)

Abstract:Dominant bacteria designed as 8301 was isolated from ascites and kidney of diseased Cynoglossus semilaevisis and proved to be pathogenic strongly to C. semilaevisis by artificial challenge. The biological characteristics including morphological, physiological and bio-chemical characteristics were examined, and the 16S rDNA gene were partially sequenced and compared with sequences deposited in Gen-Bank databases. The results showed that strain 8301 appeared gram-positive cocci in chains; based on the physiological and biochemical characteristic analysis, strain 8301 was identified as Streptococcus iniae. Phylogeny analysis with 16S rDNA showed that strain 8301 was branched into the same cluster of S. iniae and the bootstrap was 96%. These results determined that the pathogen of causing ascites in C. semilaevisis was S. iniae. Antimicrobial susceptibility assay showed that strain 8301 was susceptible to nystatin, rifampicin, penicillin and azithromycin, but resistant to roxithromycin, furazolidone, etc.

Key words:Cynoglossussemilaevis; ascites; Streptococcusiniae; 16S rDNA

*通訊作者：李賀密，高級工程師，研究方向為水產(chǎn)養(yǎng)殖。E-mail: scjstgz688@163.com

作者簡介：徐曉麗（1983-），女，工程師，博士，研究方向為水產(chǎn)動物病害與免疫學(xué)。E-mail: xiaolixu1983@gmail.com

基金項目：天津市科技支撐計劃項目（12ZCZDNC00900）；天津市科委科技計劃項目（13ZXNZNC07700）

收稿日期：2014-06-14

文章編號：1005-9369（2015）03-0074-07

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號：S941.1