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亞麻MAPK基因克隆及鹽堿脅迫下的表達(dá)分析

于瑩1，陳宏宇2，程莉莉1，趙東升1，袁紅梅1，吳廣文1，關(guān)鳳芝1*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，哈爾濱150086；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

摘要：為研究MAPK基因與亞麻應(yīng)答鹽堿脅迫的關(guān)系，利用生物信息學(xué)方法從亞麻基因組中預(yù)測得到20個亞麻MAPK基因，命名為LuMPK1～LuMPK20，這20個MAPK基因都含有T[D/E]Y保守結(jié)構(gòu)域，除LuMPK5和LuMPK20以外，其他基因都是兩兩一組。利用PCR技術(shù)克隆得到5個亞麻MAPK基因（LuMPK3、LuMPK8、LuMPK11、LuMPK14、LuMPK16），這5個基因序列與預(yù)測序列完全一致。利用數(shù)字基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，分析亞麻鹽堿脅迫下這5個基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，這5個基因的表達(dá)均受到鹽堿脅迫影響。LuMPK3、LuMPK11、LuMPK14、LuMPK16在中性鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)，LuMPK3、LuMPK8、LuMPK11、LuMPK14在堿性鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)，LuMPK16在堿性鹽脅迫下下調(diào)表達(dá)。研究為亞麻MAPK基因功能，尤其是耐鹽堿功能研究奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：亞麻；MAPK；基因克隆；鹽堿脅迫；表達(dá)分析

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-3-13 15:22:00

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150313.1522.009.html

于瑩,陳宏宇,程莉莉,等.亞麻MAPK基因克隆及鹽堿脅迫下的表達(dá)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2015, 46(3): 21-28.

亞麻是一種世界性纖維作物和油料作物，在我國經(jīng)濟作物生產(chǎn)中具有重要地位[1]。近年來，耕地面積萎縮，為解決麻類作物與糧食作物爭地矛盾，麻類作物走出糧田，拓展種植區(qū)域，向非耕地發(fā)展是麻類作物可持續(xù)發(fā)展的必由之路。亞麻種植向鹽堿地發(fā)展對保證國家糧食安全和亞麻纖維供應(yīng)具有重要意義。我國東北地區(qū)是世界三大鹽堿土集中分布區(qū)之一[2]，土壤中的致害鹽類除以NaCl為主的中性鹽，還有以Na2CO3和NaHCO3為主的堿性鹽[3]。但關(guān)于植物堿性鹽脅迫的相關(guān)研究報道較少。

促有絲分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activat?ed protein kinases, MAPKs）是植物外界刺激信號傳導(dǎo)物質(zhì)，能將外界各種刺激信號，包括高鹽脅迫、滲透脅迫、低溫脅迫等傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，引起相應(yīng)基因表達(dá)[4]。MAPKs與其他信號分子組成MAPK級聯(lián)途經(jīng)，通過依次磷酸化將逆境信號傳遞下去，即MAPKs→MAPKKs→MAPKKKs[5]。

目前，科學(xué)家已從擬南芥[6]、水稻[7]、玉米[8]、小麥[9]、大麥[10]、燕麥[11]、煙草[12]等植物中分離得到MAPK基因。研究表明，MAPK基因與植物耐鹽性有密切關(guān)系[13-15]。但是，亞麻MAPK基因還沒有相關(guān)報道。

本研究從亞麻基因組中預(yù)測得到20個亞麻MAPK基因，命名為LuMPK1~LuMPK20，分析這些基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位及進化關(guān)系等信息。利用PCR技術(shù)克隆得到5個亞麻MAPK基因，利用數(shù)字基因表達(dá)譜（DGE）數(shù)據(jù)，分析鹽堿脅迫下這5個基因的表達(dá)情況，可為亞麻MAPK基因功能的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

植物材料種植及脅迫處理：亞麻（Linum usita?tissimum L.）種子由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所提供。將亞麻種子播種于裝有蛭石花盆中，待生長3周后（約10 cm），移入含有25 mmol·L-1Na2CO3脅迫溶液中處理18 h后取樣，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，留作基因克隆的模板?？俁NA提取采用原平皓植物RNA快速提取試劑盒（HF109-02），反轉(zhuǎn)錄采用東洋紡SYBR Green Re?altime PCR Master Mix試劑盒（QPK-201T）。

1.2方法

1.2.1亞麻MAPK基因的預(yù)測

從phytozome網(wǎng)站（http://www.phytozome.net/）下載亞麻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進行本地化。利用已經(jīng)報道的其他植物MAPK蛋白序列進行多序列比對，構(gòu)建MAPK訓(xùn)練集。利用隱馬爾科夫模型（Hidden markov model, HMM）[16]和MAPK訓(xùn)練集搜索本地亞麻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，獲得可能的亞麻MAPK基因。利用PLANTSP程序（http://plantsp.genomics.purdue. edu/）檢測亞麻MAPK基因保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.2亞麻MAPK基因結(jié)構(gòu)分析、序列比對及進化樹構(gòu)建

亞麻MAPK基因結(jié)構(gòu)分析在phytozome網(wǎng)站（http://www.phytozome.net/）上進行。在線預(yù)測亞麻MAPK蛋白分子質(zhì)量和等電點（http://web.expasy.org/compute_pi/）。亞細(xì)胞定位分析采用在線程序CEL?LO v.2.5 server（http://cello.life.nctu.edu.tw/）[17]。利用DNAMAN軟件對亞麻MAPK蛋白序列進行多序列比對。為研究亞麻MAPK基因的進化關(guān)系，利用MEGA v5軟件將20個擬南芥MAPK基因與20個亞麻MAPK基因構(gòu)建進化樹[18]。1.2.3亞麻MAPK基因的克隆

根據(jù)預(yù)測亞麻MAPK基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，引物序列見表1。

表1　亞麻MAPK基因的引物序列Table 1　Primer sequences of flax MAPK genes

PCR反應(yīng)程序：94℃5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃2 min（30個循環(huán)）；72℃10 min。將PCR擴增產(chǎn)物進行測序，利用DNAMAN 6.0軟件對PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進行同源性比對分析。PCR擴增采用東洋紡KOD Plus Neo試劑盒（Lot: 266600），PCR反應(yīng)體系按照試劑盒說明書進行。引物合成及測序工作由江蘇金唯智公司完成。

1.2.4亞麻MARK基因在鹽堿脅迫下的表達(dá)分析

鹽堿脅迫下亞麻數(shù)字基因表達(dá)譜（DGE）數(shù)據(jù)[19]被用來研究亞麻MAPK基因在鹽堿脅迫下的表達(dá)模式。DGE測序的亞麻樣品鹽堿脅迫處理條件為25 mmol·L-1Na2CO3（pH 11.6）（Alkaline salt stress, AS2）、50 mmol·L-1NaCl（Neutral salt stress, NSS）和6 mmol·L-1NaOH（pH 11.6）（Alkaline stress, AS），蒸餾水作對照。

2　結(jié)果與分析

2.1亞麻MAPK基因的預(yù)測

利用隱馬爾科夫模型（HMM）預(yù)測亞麻MAPK基因，結(jié)果得到24個搜索結(jié)果高于600分，被初步認(rèn)為是可能的亞麻MAPK基因（見圖1）。采用在線軟件PLANTSP檢測亞麻MAPK保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果有4個基因無MAP激酶結(jié)構(gòu)域（Lus10021945、Lus10034601、Lus10038472、Lus10041234），說明可能的亞麻MAPK基因有20個。按照HMM預(yù)測的分值，從高到低，將亞麻MAPK基因命名為LuMPK1~LuMPK20。

圖1　亞麻MAPK基因的隱馬爾科夫模型(HMM)預(yù)測結(jié)果Fig. 1　HMM predicted results of MAPK gene from flax

2.2亞麻MAPK基因結(jié)構(gòu)分析、序列比對及進化樹構(gòu)建

對20個亞麻MAPK基因進行結(jié)構(gòu)分析（見表2）。結(jié)果表明，所有基因均含有內(nèi)含子，但是數(shù)目為2~11個不等?；蜷L度為1 431~14 267 bp，有10倍的差距，但是CDS長度為1 104~1 851 bp，相差不大，說明主要是內(nèi)含子長度差別較大。蛋白長度為367~616 aa，其中有5對基因的長度相同（LuMPK6/LuMPK7、LuMPK8/LuMPK20、LuMPK11/LuMPK12、LuMPK13/LuMPK14、LuMPK15/LuMPK 16）。蛋白分子質(zhì)量為42.2~69.7 ku，等電點為5.46~ 9.21。其中有4個基因的等電點大于7（LuMPK2、LuMPK3、LuMPK18、LuMPK19），說明其屬于堿性蛋白。亞麻基因組測序數(shù)據(jù)沒有染色體定位信息，所以按照scaffold信息定位基因。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，5個基因定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體上，9個基因定位在細(xì)胞核中，6個基因定位在細(xì)胞質(zhì)中。

表2　亞麻MAPK基因結(jié)構(gòu)分析Table 2　List of MAPK gene structure in flax

對20個亞麻MAPK基因進行序列比對分析（見圖2）。結(jié)果表明，所有亞麻MAPK基因均含有植物MAPK基因特有的T[D/E]Y保守結(jié)構(gòu)域，其中有5個基因含有TDY結(jié)構(gòu)域，15個基因含有TEY結(jié)構(gòu)域。將20個亞麻MAPK基因與20個擬南芥MAPK基因構(gòu)建進化樹（見圖3）。

圖3結(jié)果表明，20個亞麻MAPK基因被分為4個組（A~D），其中5個在A組，6個在B組，4個在C組，5個在D組。除LuMPK5和LuMPK20以外，其他基因均兩兩一組。

圖2　亞麻MAPK蛋白序列比對Fig. 2　Alignment of MAPK proteins in flax

圖3　亞麻MAPK蛋白與擬南芥MAPK蛋白進化關(guān)系分析Fig. 3　Phylogenetic relationships of MAPK families between flax and Arabidopsis

2.3亞麻MAPK基因的克隆

利用基因特異引物和PCR方法，從鹽堿脅迫后亞麻全植株中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄（見圖4A）。擴增得到目的基因產(chǎn)物，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（見圖4B~F）。

結(jié)果表明，分別克隆得到1個約2 000 bp和4個約1 200 bp的目的條帶。將PCR產(chǎn)物切膠回收，并測序。測序結(jié)果比對證實PCR擴增產(chǎn)物為Lus10005568（LuMPK3）、Lus10007921（LuMPK8）、Lus10017518（LuMPK11）、Lus10018127（LuMPK14）和Lus10010637（LuMPK16）的完整序列。

2.4亞麻MAPK基因在鹽堿脅迫下的表達(dá)分析

利用DGE測序數(shù)據(jù)分析亞麻LuMPK3、LuMPK8、LuMPK11、LuMPK14、LuMPK16基因在鹽堿脅迫下的表達(dá)模式（見圖5）。

結(jié)果表明，LuMPK3、LuMPK8、LuMPK11、LuMPK14、LuMPK16這5個基因的表達(dá)均受到鹽堿脅迫影響。LuMPK3、LuMPK11、LuMPK14、LuMPK16在中性鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)，LuMPK3、LuMPK8、LuMPK11、LuMPK14在堿性鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)，LuMPK16在堿性鹽脅迫下下調(diào)表達(dá)。說明這5個基因可能與亞麻應(yīng)答鹽堿脅迫密切相關(guān)。

圖4　亞麻MAPK基因的克隆Fig. 4　Cloning of MAPKgene in flax

圖5　亞麻LuMPK3、LuMPK8、LuMPK11、LuMPK14、LuMPK16基因在鹽堿脅迫下的表達(dá)模式Fig. 5　Expression pattern of LuMPK3, LuMPK8, LuMPK11, LuMPK14, LuMPK16 under saline and alkaline stress

3　討論與結(jié)論

促有絲分裂原活化蛋白激酶是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于植物、動物和真菌中。植物MAPK是重要信號傳導(dǎo)物質(zhì)，在植物應(yīng)答非生物逆境過程中發(fā)揮重要作用。目前，許多植物MAPK基因均已被分離出來，其中擬南芥有20 個[6]，水稻有17個[7]，玉米有19個[8]，楊樹21個[20]，煙草17個[12]，番茄16個[21]，蘋果26個[22]。本研究從亞麻基因組中預(yù)測得到20個MAPK基因，與擬南芥中數(shù)目一致。亞麻MAPK基因中有5個含有TDY結(jié)構(gòu)域，15個含有TEY結(jié)構(gòu)域；水稻中有11個含有TDY結(jié)構(gòu)域，5個含有TEY結(jié)構(gòu)域；擬南芥中有8個含有TDY結(jié)構(gòu)域，12個含有TEY結(jié)構(gòu)域。說明不同物種間MAPK基因數(shù)目和結(jié)構(gòu)域分類不同，這些基因可能參與植物不同的代謝活動。

通過構(gòu)建進化樹，發(fā)現(xiàn)亞麻MAPK基因大多數(shù)均是兩兩一組，每一組基因序列均非常相似，這些基因在進化上可能是復(fù)制而來。很難利用熒光定量PCR方法設(shè)計引物區(qū)分不同基因表達(dá)模式。所以，采用DGE測序數(shù)據(jù)分析亞麻MAPK基因的表達(dá)模式。利用PCR方法只克隆得到5個亞麻MAPK基因，說明其他MAPK基因在樣品中沒有表達(dá)或表達(dá)量太低，也可能是假基因或者基因組測序拼接不準(zhǔn)確及PCR技術(shù)本身原因。

近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)在逆境脅迫下植物MAPK基因?qū)}脅迫會做出積極應(yīng)答[23-24]。本文通過對5個亞麻MAPK基因在鹽堿脅迫下的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)這5個基因的表達(dá)均受鹽堿脅迫影響。A組和B組MAPK被認(rèn)為與植物應(yīng)答環(huán)境脅迫相關(guān)[25]，參與擬南芥應(yīng)答環(huán)境脅迫的AtMPK4就屬于B組[26]，本研究中LuMPK14屬于A組，LuMPK8和LuMPK11屬于B組，C組MAPK研究較少，但是本研究中LuMPK16屬于C組，其表達(dá)也受鹽堿脅迫影響，有報道D組MAPK與非生物脅迫有關(guān)[27-28]，本研究中LuMPK3屬于D組。因此，推測A~D組MAPK在亞麻響應(yīng)鹽脅迫過程中發(fā)揮重要作用。這些基因具體功能及與亞麻應(yīng)答脅迫分子機制關(guān)系有待進一步研究。

為研究MAPK基因與亞麻應(yīng)答鹽堿脅迫關(guān)系，本研究利用生物信息學(xué)方法從亞麻基因組數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到20個亞麻MAPK基因，命名為LuMPK1~LuMPK20，分析這20個MAPK基因的基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位及進化關(guān)系等信息。利用PCR技術(shù)克隆得到5個亞麻MAPK基因（LuMPK3、LuMPK8、LuMPK11、LuMPK14、LuMPK16）全長。利用DGE數(shù)據(jù)，分析鹽堿脅迫下這5個基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，5個基因的表達(dá)均受到鹽堿脅迫影響。

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Yu Ying, Chen Hongyu, Cheng Lili, et al. Cloning and expression analysis of MAPK gene under saline-alkaline stress in flax [J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(3): 21-28. (in Chinese with English abstract)

Cloning and expression analysis of MAPK gene under saline-alkaline

stress in flax/YU Ying1, CHEN Hongyu2, CHENG Lili1, ZHAO Dongsheng1, YUAN Hongmei1, WU Guangwen1, GUAN Fengzhi1(1.Institute of Industrial Crops, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China; 2. School of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:In order to investigate the relationship between flax MAPKgenes and saline-alkaline stress, 20 flax MAPK genes, named LuMPK1-LuMPK20, repectively, were predicted from flax genome by bioinformatics methods. These 20 MAPK genes all contained T[D/E]Y conserved domains and existed in pairs except LuMPK5 and LuMPK20. Five MAPK genes (LuMPK3, LuMPK8, LuMPK11, LuMPK14, LuMPK16) were cloned by PCR and their sequences were consistent with the predicted sequences. The expressions of these genes were analyzed by digital gene expression under saline and alkaline stresses. The results showed that the expressions of these five genes were subject to saline and alkaline stresses. LuMPK3, LuMPK11, LuMPK14, LuMPK16 were up-regulated under neutral salt stress, and LuMPK3, LuMPK8, LuMPK11, LuMPK14 were up-regulated under alkaline salt stress. LuMPK16 was down-regulated under alkaline salt stress. This study laid the theoretical foundation for the function of MAPK genes in flax, especially the saline-alkaline tolerance function.

Key words:flax；MAPK；gene cloning；saline-alkaline stress；expression analysis

*通訊作者：關(guān)鳳芝，研究員，研究方向為亞麻遺傳育種。E-mail: kj-gfz@163.com

作者簡介：于瑩（1981-），女，助理研究員，博士，研究方向為亞麻分子育種。E-mail: yuying_1981_0451@163. com

基金項目：哈爾濱市青年科技創(chuàng)新人才專項（2013RFQYJ011）；黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院級課題重點項目（2012ZD011）；黑龍江省博士后資助經(jīng)費項目（LBH-Z13182）

收稿日期：2014-12-19

文章編號：1005-9369（2015）03-0021-08

文獻標(biāo)志碼：A

中圖分類號：S563.2；Q785