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（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030）

摘要：為分析擬南芥中轉(zhuǎn)錄因子AtOFP4在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能，對(duì)擬南芥OVATE基因家族中第I亞組的Atofp4缺失突變體進(jìn)行篩選與表型分析，對(duì)35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型分析。結(jié)果表明，與野生型相比，Atofp4突變體植株表型沒有顯著變化；而35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株各器官形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)多效畸變，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)因地上器官表皮細(xì)胞在長(zhǎng)軸上顯著縮短導(dǎo)致植株各器官形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。GA3處理35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植物幼苗，結(jié)果表明，GA3對(duì)下胚軸生長(zhǎng)具有明顯補(bǔ)償作用，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子AtOFP4與GA3相關(guān)。在正常生長(zhǎng)條件下，AtOFP4基因過(guò)量表達(dá)可抑制表皮細(xì)胞伸長(zhǎng)，影響轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)發(fā)育。

常纓,張微,李宏玲,等.轉(zhuǎn)錄因子AtOFP4影響擬南芥表皮細(xì)胞的伸長(zhǎng)[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 46(3): 50-58.

Chang Ying, Zhang Wei, Li Hongling, et al. Effect of transcription factor AtOFP4 on epidermal cells elongation in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(3): 50-58. (in Chinese with English abstract)

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor）是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，亦稱反式作用因子。植物中的轉(zhuǎn)錄因子分為兩種，一種是非特異性轉(zhuǎn)錄因子，可非選擇性調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；另一種為特異型轉(zhuǎn)錄因子，能夠選擇性調(diào)控某種或某些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。典型的轉(zhuǎn)錄因子含有DNA結(jié)合區(qū)（DNA- binding domain）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)（Activation domain）、寡聚化位點(diǎn)（Oligo?merization site）以及核定位信號(hào)（Nuclear localiza?tion signal）等功能區(qū)域，這些功能區(qū)域決定轉(zhuǎn)錄因子的功能和特性[1]。轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育與器官形態(tài)建成，抵御外界生物脅迫與非生物脅迫等方面具有重要調(diào)控作用[2]。OVATE基因首次在番茄中被鑒定出，該試驗(yàn)結(jié)果表明OVATE基因突變可導(dǎo)致番茄果實(shí)由圓形轉(zhuǎn)變成梨形。OVATE基因編碼的蛋白內(nèi)含一個(gè)核定位信號(hào)，其C端約70個(gè)氨基酸序列在植物中是保守的，這個(gè)保守區(qū)域被稱為OVATE結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而，包含這個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白被鑒定為OVATE家族蛋白（OFPs）[3]。Hack?busch等提出一個(gè)與TALE蛋白相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)模型，在這個(gè)模型中包含一個(gè)從未被鑒定的植物家族蛋白[Arabidopsis thaliana ovate family pro?teins（AtOFPs）]。并證明，這些蛋白質(zhì)控制著TALE蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位，對(duì)植物發(fā)育起重要調(diào)節(jié)作用。擬南芥AtOFPs是一類新型的、植物特有的轉(zhuǎn)錄因子[4]。在擬南芥基因組中可以編碼含有OVATE結(jié)構(gòu)域的蛋白基因共有18個(gè)[5]。根據(jù)擬南芥AtOFPs轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生的表型類型可將其分為三個(gè)亞組：Ⅰ類亞組（AtOFP1、AtOFP2、AtOFP4、AtOFP5和AtOFP7）、Ⅱ類亞組（AtOFP6和AtOFP8）和Ⅲ類亞組（AtOFP13、AtOFP15、AtOFP16和AtOFP18），其他AtOFP基因超表達(dá)體未觀察到明顯的表型[6]。Wang等僅對(duì)AtOFP1進(jìn)行初步研究，研究中發(fā)現(xiàn)AtOFP1在擬南芥芽、根、莖、葉、花、花序和角果中均有表達(dá)。確定AtOFP1定位在細(xì)胞核中，推測(cè)是一個(gè)活性轉(zhuǎn)錄抑制因子，抑制細(xì)胞伸長(zhǎng)。染色質(zhì)免疫沉淀試驗(yàn)結(jié)果表明AtOFP1直接調(diào)控AtGA20ox1表達(dá)，而AtGA20ox1是編碼GA合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因，通過(guò)外源添加GA3能夠部分恢復(fù)35S:HA-AtOFP1轉(zhuǎn)基因植株的表型[7]。對(duì)于在光下生長(zhǎng)的植物來(lái)說(shuō)，GA能夠促進(jìn)下胚軸和莖的細(xì)胞延長(zhǎng)。已有研究表明，在擬南芥中，乙烯、生長(zhǎng)素、蕓苔素能和GA一起共同促進(jìn)細(xì)胞延伸和下胚軸延長(zhǎng)[8-10]。Pagnussat等報(bào)道，AtOFP5在早期胚囊發(fā)育中，對(duì)BLH1- KNAT3起復(fù)雜的負(fù)調(diào)控作用[11]。

最近，研究發(fā)現(xiàn)AtOFP4通過(guò)與KNAT7相互作用參與調(diào)節(jié)次生細(xì)胞壁形成[5]。由于AtOFP4與 AtOFP1同屬Ⅰ類亞組，并且，二者轉(zhuǎn)基因植株表型很相近。那么，AtOFP4在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中是否也與GA3有關(guān)？為研究Ⅰ類亞組中AtOFP4基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，本文從三個(gè)方面探究：首先對(duì)AtOFP4基因缺失突變體進(jìn)行篩選與鑒定，并進(jìn)行表型分析；同時(shí)對(duì)AtOFP4轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型分析；最后通過(guò)外源添加GA3試驗(yàn)來(lái)探究AtOFP4轉(zhuǎn)基因植株所產(chǎn)生的表型是否與GA有關(guān)。本研究通過(guò)分析AtOFP4轉(zhuǎn)基因植株對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生的影響，例如使植株矮化、葉片形態(tài)改變、果型變化等，探索該基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能，推測(cè)整個(gè)蛋白家族在植物生長(zhǎng)發(fā)育中可能行使的功能和相應(yīng)機(jī)制，對(duì)研究觀賞植物、經(jīng)濟(jì)作物生長(zhǎng)具有重要意義。

1　材料與方法

野生型擬南芥Columbia（Col）及35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植物等由加拿大大不列顛哥倫比亞大學(xué)（UBC）植物系陳金桂博士和王樹才博士提供。TDNA插入突變體訂購(gòu)自T-DNA插入突變種子庫(kù)ABRC（Arabidopis biological resource center）。

所用擬南芥試驗(yàn)材料均為哥倫比亞Columbia （Col）生態(tài)型，分別為：野生型（Col）、Atofp4缺失突變體、35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株。將種子放在1.5 mL EP管中,用移液槍加入1 mL 80%酒精，7 000 r·min-1離心2 min，棄酒精；再加1 mL 2.5%次氯酸鈉，離心2 min，棄次氯酸鈉；最后加1 mL無(wú)菌水離心1 min（5次）。種子經(jīng)消毒后，加入0.5 mL無(wú)菌水于EP管中懸浮種子；用移液槍將種子吸到已滅菌含有1%瓊脂和3%蔗糖的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，將種子鋪均勻；用移液槍吸干水，在超凈臺(tái)上用無(wú)菌風(fēng)吹干殘留在培養(yǎng)基上的水；點(diǎn)好種子的培養(yǎng)皿用封口膜封好；放到組培架上，垂直光照培養(yǎng)。培養(yǎng)室光周期14 h /10 h（光照/黑暗），光照強(qiáng)度5 000 lx，培養(yǎng)溫度為（22±2）℃。7~10 d后，打開培養(yǎng)皿，用鑷子把擬南芥幼苗移種到由Hoagland營(yíng)養(yǎng)液潤(rùn)濕的土壤培養(yǎng)基中（土?蛭石= 1?1），培養(yǎng)條件不變。每天澆水，每3 d澆1次Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。

為最大程度上保證植株生長(zhǎng)的微環(huán)境相同，進(jìn)而準(zhǔn)確對(duì)比分析Col野生型擬南芥與Atofp4缺失突變體、35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株間生長(zhǎng)和發(fā)育差異，在5×10的育苗穴盤中均勻分布種植野生型、Atofp4缺失突變體、35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因擬南芥。

采用CTAB法制備擬南芥基因組DNA。從T-DNA插入突變種子庫(kù)ABRC訂購(gòu)到SALK_ 022396可能帶有T-DNA插入的突變體，利用PCR方法確認(rèn)其T-DNA插入情況，待T-DNA插入確認(rèn)后將利用測(cè)序法確定其精確的插入位點(diǎn)，并利用RT-PCR驗(yàn)證其基因表達(dá)情況，篩選出基因表達(dá)缺失性突變體（見表1）。

對(duì)7周齡Col野生型擬南芥及35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因擬南芥莖、葉、花進(jìn)行大量取材，將材料避開葉脈切成5 mm×10 mm長(zhǎng)方形小塊，編號(hào)，快速置于改良的50% FAA固定液中，室溫下固定24 h以上。用0.1 mol·L-1pH 6.8磷酸緩沖液沖洗3次，每次10 min。分別用濃度為50%、70%、80%、90%乙醇進(jìn)行脫水，每次10~15 min；100%乙醇脫水3次，每次10 min。100%乙醇?叔丁醇=1?1；叔丁醇各1次，每次15 min。ES-2030（HITACHI）型冷凍干燥儀對(duì)樣品進(jìn)行干燥。大約需4 h。將樣品用導(dǎo)電膠帶粘貼在掃描電子顯微鏡樣品臺(tái)上。E-1010 （HITACHI）型離子濺射鍍膜儀在樣品表面鍍一層15 nm厚金屬膜（金或鉑膜）。置于S-3400N（Hita?chi）型掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀察并照像。

將Col野生型擬南芥與35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因擬南芥種子播種到含有0、0.1、1、10 μmol·L-1GA3的1/2MS培養(yǎng)基上（方法見擬南芥培養(yǎng)）。培養(yǎng)條件為21℃，光周期14 h/10 h（光照/黑暗），光照強(qiáng)度5 000 lx。7 d后，觀察擬南芥生長(zhǎng)情況，測(cè)量下胚軸長(zhǎng)度。

1.2.5 Col野生型、Atofp4缺失突變體與35S:HAOFP4轉(zhuǎn)基因植株表型觀察

對(duì)生長(zhǎng)在培養(yǎng)室的Col野生型擬南芥、Atofp4缺失突變體、35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行觀察，拍照。Col野生型擬南芥和35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)50 d時(shí)，觀察植株花序及完全開放的單朵花并拍照。

2　結(jié)果與分析

在NCBI上查詢到AtOFP4基因CDS區(qū)長(zhǎng)度為948 bp，CDS區(qū)全部為外顯子，編碼產(chǎn)物為315個(gè)氨基酸的蛋白。其蛋白序列C末端251~307 aa位置為OVATE結(jié)構(gòu)域（DUF623）。在TAIR上查詢到類型為T-DNA插入突變，插入位置在外顯子上，插入位點(diǎn)在109 bp處，插入旁側(cè)序列長(zhǎng)度為333 bp，型號(hào)為SALK_022396的Atofp4突變體，命名為Atofp4-1。

以Col野生型擬南芥為陽(yáng)性對(duì)照，以內(nèi)參基因Actin2為參照，進(jìn)行RT-PCR鑒定，由圖2可以看AtOFP4在突變體中沒有表達(dá)，說(shuō)明T-DNA插入Atofp4后阻斷該基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，即需要的基因敲除突變體植株，收集突變體Atofp4-1種子，用于下一步表型分析。

圖2　RT-PCR分析AtOFP4在缺失突變體中的表達(dá)Fig. 2　RT-PCR analysis of AtOFP4 expression in Atofp4-1mutant

經(jīng)過(guò)對(duì)子葉、蓮座葉，莖生葉、花朵、角果等觀察發(fā)現(xiàn)Atofp4-1缺失突變體表型與Col野生型擬南芥表型無(wú)明顯差異，在這里僅以25 d株齡植株作代表加以說(shuō)明（見圖3）。

圖3　25 d齡Col野生型擬南芥與Atofp4-1突變體表型Fig. 3　Phenotypes of 25-day-old Col and Atofp4-1 mutant plants

在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7 d時(shí)，Col野生型擬南芥子葉葉片平展光滑，子葉呈卵形（見圖4A），而35S: HA-OFP4子葉呈腎型（見圖4B）。

圖4　Col野生型擬南芥與35S:HA-OFP4植株子葉形態(tài)Fig. 4　Cotyledon phenotypes of Col and 35S:HA-OFP4 plants

由于35S:HA-OFP4植株子葉表型發(fā)生較大變化，因此進(jìn)一步觀察子葉表皮細(xì)胞變化。結(jié)果表明，35S:HA-OFP4植株子葉上表皮細(xì)胞形態(tài)與Col野生型擬南芥上表皮細(xì)胞無(wú)明顯差別，細(xì)胞形狀均不規(guī)則；但在細(xì)胞大小上差異明顯，35S:HA-OFP4植株上表皮細(xì)胞明顯小于Col野生型擬南芥，細(xì)胞表面積約為Col野生型擬南芥上表皮細(xì)胞的80%（見圖5）。2.2.2擬南芥35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株蓮座葉表型分析

根據(jù)對(duì)Col野生型和35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株的觀察發(fā)現(xiàn)兩種植株形態(tài)不同，35S:HA-OFP4植株小于Col野生型，主要體現(xiàn)在35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株葉柄明顯短于Col野生型（見圖6）。兩種植株葉片大小相似，但其形狀不同，Col野生型擬南芥葉片為卵圓形（見圖6A），而35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株葉片仍為腎形（見圖6B）。

圖5　Col野生型擬南芥與35S:HA-OFP4植株子葉上表皮細(xì)胞Fig. 5　Epidermal cell of cotyledon of Col and35S:HA-OFP4 plants

圖6　Col野生型擬南芥與35S:HA-OFP4植株幼苗表型Fig. 6　Phenotype of seedling in Col and 35S:HA-OFP4 plants

擬南芥株齡40 d時(shí)，35S:HA-OFP4植株形態(tài)與Col野生型相比，生長(zhǎng)較慢，植株較矮（見圖7）。對(duì)生長(zhǎng)40 d時(shí)Col野生型和35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因擬南芥隨機(jī)各取30棵植株，對(duì)植株株高進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果表明35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株株高比野生型低約20%（見圖8）。

觀察植株生長(zhǎng)時(shí)，注意到35S:HA-OFP4植株生長(zhǎng)緩慢，植株較矮。即對(duì)生長(zhǎng)40 d時(shí)35S:HAOFP4植株莖表皮細(xì)胞進(jìn)行掃描觀察，結(jié)果顯示35S:HA-OFP4植株細(xì)胞沿長(zhǎng)軸方向縮短。因此可以推測(cè)35S:HA-OFP4植株變矮由細(xì)胞延長(zhǎng)軸方向縮短引起（見圖9）。

圖7　Col野生型擬南芥與35S:HA-OFP4植株40 d齡植株形態(tài)Fig. 7　Phenotype of 40-day-old Col and 35S:HA-OFP4 plants

圖8　Col野生型與35S:HA-OFP4植株40 d齡植株株高Fig. 8　Aerial height of 40-day-old Col and 35S:HA-OFP4 plants

圖9　Col野生型擬南芥與35S:HA-OFP4植株40 d時(shí)莖表皮細(xì)胞形態(tài)Fig. 9　Phenotype of epidermal cell of 40-day-oldCol and 35S:HA-OFP4 plants

Col野生型與35S:HA-OFP4植株培養(yǎng)過(guò)程中，注意到35S:HA-OFP4植株花序發(fā)育時(shí)間晚于Col野生型。因此，對(duì)生長(zhǎng)45 d的植株頂端花序表型進(jìn)行觀察（見圖10A、B），結(jié)果顯示與Col野生型相比35S:HA-OFP4花序中花柄長(zhǎng)度明顯縮短，花蕾數(shù)目多，花朵數(shù)目少。對(duì)兩種植株單朵花進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示Col野生型擬南芥花蕾正常開放，花瓣伸出萼片，萼片呈橢圓形（見圖10C）。與Col野生型相比，35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株萼片變短，整個(gè)花朵變?。ㄒ妶D10D）。

圖10　Col野生型擬南芥與35S:HA-OFP4植株花表型Fig. 10　Phenotype of flower of Col and 35S:HA-OFP4 plants

Col野生型擬南芥柱頭表皮細(xì)胞沿縱軸明顯呈長(zhǎng)形，細(xì)胞表面有褶皺，柱頭乳突細(xì)胞較多（見圖11A）。35S:HA-OFP4柱頭表皮細(xì)胞與Col野生型擬南芥柱頭表皮細(xì)胞相似，細(xì)胞沿縱軸方向明顯呈長(zhǎng)形，細(xì)胞長(zhǎng)度與Col野生型擬南芥表皮細(xì)胞近相等，柱頭乳突細(xì)胞與Col野生型表型相似（見圖11B）。

圖11　Col野生型擬南芥與35S:HA-OFP4植株柱頭表型Fig. 11　Phenotype of stigma of Col and 35S:HA-OFP4 plants

對(duì)35S:HA-OFP4植株雄蕊進(jìn)行觀察，隨著花器官發(fā)育，Col野生型擬南芥與35S:HA-OFP4植株雄蕊也發(fā)生很大變化。Col野生型擬南芥花藥呈背著生，花粉囊呈心形，且正?？v裂釋放花粉粒（見圖12A）。35S:HA-OFP4雄蕊形態(tài)與Col野生型擬南芥有顯著差異，花粉囊縮短，背面觀呈腎型；花藥壁增厚，背著藥，縱裂釋放花粉粒（見圖12B）。擬南芥花粉粒能夠與柱頭細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別，一旦花粉粒被柱頭識(shí)別，水合過(guò)程很快進(jìn)行。成熟花粉粒長(zhǎng)形，三溝，花粉表面具網(wǎng)狀紋飾；花粉水合后近乎球形。對(duì)所取材料進(jìn)行觀察，這里僅例舉水合后花粉粒形態(tài)，觀察結(jié)果表明35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株花粉粒與Col野生型擬南芥花粉粒形態(tài)相似，水合后都呈球形，具三溝，花粉表面具網(wǎng)狀紋飾（見圖13）。

圖12　Col野生型擬南芥與35S:HA-OFP4植株雄蕊表型Fig. 12　Phenotype of stamen of Col and 35S:HA-OFP4 plants

圖13　Col野生型擬南芥與35S:HA-OFP4植株花粉粒表型Fig. 13　Phenotype of pollen grain of Col and 35S:HA-OFP4 plants

35S:HA-OFP4植株結(jié)實(shí)后，對(duì)其角果進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)野生型擬南芥角果為正常飽滿的長(zhǎng)角果，與野生型相比，35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株角果大小形態(tài)發(fā)生明顯變化（見圖14A）。35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株角果長(zhǎng)度明顯減小，飽滿程度下降。為探究如此瘦小的角果中可否產(chǎn)生正常種子，進(jìn)一步對(duì)其角果內(nèi)種子形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)35S: HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株種子與野生型種子相比其大小形態(tài)并未發(fā)生明顯改變，均為橢圓形飽滿種子（見圖14B）。

圖14　b　 Cola野生型擬南芥與35S:HA-OFP4植株果實(shí)形態(tài)Fig. 14　Phenotype of fruit of Col and 35S:HA-OFP4 plants

對(duì)在未添加外源GA3的1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d時(shí)的擬南芥幼苗進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在沒有外源GA3處理時(shí)，Col野生型擬南芥下胚軸正常生長(zhǎng)。與野生型相比，35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株下胚軸生長(zhǎng)較慢，下胚軸較粗，較短。兩者子葉葉柄長(zhǎng)度也發(fā)生變化，Col野生型擬南芥葉柄較長(zhǎng)，而35S: HA-OFP4子葉葉柄較短（見圖15A）。

為探究其下胚軸變短原因，對(duì)35S:HA- OFP4植株下胚軸進(jìn)行顯微鏡觀察。結(jié)果表明，35S: HA-OFP4下胚軸表皮細(xì)胞在長(zhǎng)軸方向上縮短，表明在單位長(zhǎng)度上細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯增加，表明35S: HA- OFP4下胚軸變短因表皮細(xì)胞變短所致。進(jìn)一步觀察到35S:HA-OFP4下胚軸表皮細(xì)胞長(zhǎng)度僅為Col野生型擬南芥表皮細(xì)胞1/2（見圖16）；

正常條件下，7 d齡Col野生型擬南芥下胚軸最長(zhǎng)可以達(dá)到2.3 mm，而35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株下胚軸最長(zhǎng)為1.7 mm，長(zhǎng)度約為野生型的74%。隨著GA3濃度增加，無(wú)論野生型還是35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株下胚軸生長(zhǎng)均加快，下胚軸長(zhǎng)度均增加（見圖15）。

圖15　GA3對(duì)Col野生型擬南芥與35S:HA-OFP4植株下胚軸表型的影響Fig. 15　Effect of GA3on hycopotyls of Col and 35S:HA-OFP4 plants

圖16　Col野生型擬南芥與35S:HA-OFP4植株下胚軸表皮細(xì)胞Fig. 16　Epidermic cell of hycopotyls of Col and35S:HA-OFP4 plants

在GA3濃度為0.1 μmol·L-1時(shí)，野生型下胚軸長(zhǎng)度約增加6%，而35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株下胚軸約增加21%（見圖17）；在GA3濃度為1 μmol·L-1時(shí)，野生型下胚軸長(zhǎng)度約增加14%，而35S: HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株下胚軸約增加37%，此時(shí)，35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株下胚軸長(zhǎng)度均值約為2.3 mm（見圖17），與自然狀態(tài)下野生型下胚軸長(zhǎng)度基本相等，即在1 μmol·L-1GA3濃度下可使35S: HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株下胚軸長(zhǎng)度恢復(fù)正常；在GA3濃度為10 μmol·L-1時(shí)，兩種植株下胚軸仍然可以伸長(zhǎng)，只是伸長(zhǎng)長(zhǎng)度不很明顯。此時(shí)，35S: HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株下胚軸仍短于Col野生型，長(zhǎng)度約為Col野生型的84%（見圖17）。相比較而言，35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株下胚軸生長(zhǎng)加快幅度大于野生型擬南芥。即GA3對(duì)35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株下胚軸伸長(zhǎng)的影響更為明顯。

圖17　GA3對(duì)Col野生型擬南芥與35S:HA-OFP4植株下胚軸的影響Fig. 17　Effect of GA3on length of hypocotyls of Col and 35S:HA-OFP4 plants

3　討論

轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是指一類稱為轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)特異地結(jié)合到靶基因調(diào)控區(qū)的順式作用元件上，或調(diào)節(jié)基因表達(dá)強(qiáng)度，或控制靶基因的時(shí)空特異性表達(dá)，或應(yīng)答外界激素和環(huán)境脅迫[12]。AtOFPs轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的調(diào)控蛋白。AtOF?Ps轉(zhuǎn)錄因子以蛋白家族的形式存在于擬南芥中，其蛋白家族包括18個(gè)成員。Wang等發(fā)現(xiàn)擬南芥AtOFPs基因家族中，基因成員之間存在功能冗余現(xiàn)象，將其分成3個(gè)亞組[6]。近年學(xué)者主要集中于對(duì)第Ⅰ亞組成員AtOFP1的研究，已證實(shí)AtOFP1為轉(zhuǎn)錄抑制因子，定位于細(xì)胞核中，通過(guò)調(diào)控赤霉素合成酶中一個(gè)關(guān)鍵基因AtGA20ox1的表達(dá)抑制細(xì)胞伸長(zhǎng)[7]。AtOFP4與AtOFP1同屬于第Ⅰ亞組，AtOFP4通過(guò)與KNAT7相互作用參與調(diào)節(jié)次生細(xì)胞壁的形成[5]。由于GA和細(xì)胞伸長(zhǎng)有關(guān)聯(lián)，而且已有研究表明，AtOFP1與GA相關(guān)，對(duì)野生型與35S: HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行不同濃度GA3處理，探究AtOFP4與GA3關(guān)系。認(rèn)為比較傳統(tǒng)但最具有說(shuō)服力研究基因功能的方法是利用基因敲除技術(shù)或轉(zhuǎn)基因技術(shù)[13]。本試驗(yàn)采取基因敲除與轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄因子AtOFP4在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能。結(jié)果表明經(jīng)基因敲除獲得的缺失突變體表型與野生型很相似，幾乎無(wú)特殊表型，再次驗(yàn)證AtOFPs基因家族中各基因之間功能冗余。而35S: HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株表型發(fā)生很大變化。

子葉在傳統(tǒng)研究中被作為種子的一部分，近年來(lái)植物發(fā)育生物學(xué)研究結(jié)果表明，子葉形態(tài)構(gòu)建是由不同基因控制的建成過(guò)程，與種子發(fā)育過(guò)程調(diào)控基因不一致。例如擬南芥Leafy cotyledon1 （lec1）突變體子葉失去儲(chǔ)藏養(yǎng)分的功能，在形態(tài)上表現(xiàn)出真葉的特征，但幼胚加以適當(dāng)培養(yǎng)仍可發(fā)育成正常植株[14-16]。因此本試驗(yàn)認(rèn)為子葉形態(tài)調(diào)控與營(yíng)養(yǎng)葉形態(tài)調(diào)控應(yīng)屬同一范疇。

根據(jù)35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株可使擬南芥子葉由卵圓形轉(zhuǎn)變成腎型，推測(cè)AtOFP4是子葉形態(tài)建成的相關(guān)基因。經(jīng)過(guò)對(duì)表皮細(xì)胞的觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表皮細(xì)胞在長(zhǎng)軸方向上縮短導(dǎo)致細(xì)胞排列形態(tài)發(fā)生改變，子葉長(zhǎng)寬比顯著降低，宏觀表現(xiàn)為子葉腎型。對(duì)35S:HA-OFP4植株蓮座葉進(jìn)行表型觀察，結(jié)果顯示葉面積變小，葉片發(fā)生褶皺。通過(guò)分析推測(cè)35S:HA-OFP4植株蓮座葉形態(tài)改變由細(xì)胞長(zhǎng)寬比例改變引起。因此推測(cè)AtOFP4可能通過(guò)改變細(xì)胞長(zhǎng)寬比影響子葉及葉片形態(tài)建成。

植物細(xì)胞長(zhǎng)度增加是植物莖伸長(zhǎng)原因之一，赤霉素最顯著作用是促進(jìn)莖伸長(zhǎng)[17]。根據(jù)植物矮化突變體對(duì)外源施加激素表現(xiàn)，將其分為激素缺陷型和激素不敏感型兩類[18]。本研究中35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比，出現(xiàn)明顯矮化現(xiàn)象，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出來(lái)的這種矮化表型，對(duì)外源添加的激素能夠產(chǎn)生哪種反應(yīng)呢？GAs是一類生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)，對(duì)其功能的研究主要體現(xiàn)在突變體表型上，當(dāng)把GAs生物合成過(guò)程中有關(guān)基因敲除或過(guò)表達(dá)之后，會(huì)呈現(xiàn)出相應(yīng)短或長(zhǎng)的下胚軸表型[19 -20]。GAs家族中GA3對(duì)下胚軸生長(zhǎng)作用較大，內(nèi)源GA3含量變化趨勢(shì)與油菜下胚軸伸長(zhǎng)趨勢(shì)一致，外施GA3能明顯增加油菜幼苗下胚軸細(xì)胞長(zhǎng)度，促進(jìn)突變體下胚軸伸長(zhǎng)[21]。本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)莖表皮細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn)，35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株表皮細(xì)胞長(zhǎng)度明顯短于野生型，推測(cè)莖的縮短可能與表皮細(xì)胞沿長(zhǎng)軸面上縮短有關(guān)。為進(jìn)一步探究轉(zhuǎn)基因植株矮化是否與GA3有關(guān)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)外源添加不同濃度GA3對(duì)下胚軸影響的試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明外源GA3對(duì)35S:HA-OFP4植株下胚軸生長(zhǎng)起到補(bǔ)償作用。這與Wang等對(duì)AtOFP1研究結(jié)果一致，即AtOFP4與AtOFP1在植物生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)面功能相似。在GA3濃度為1 μmol·L-1時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株下胚軸長(zhǎng)度基本恢復(fù)到正常野生型，即AtOFP4蛋白對(duì)植株下胚軸的影響類似于激素缺陷型矮化突變體，通過(guò)外源施加GA3能夠使其恢復(fù)野生型表型，推測(cè)AtOFP4可能通過(guò)抑制GA3生物合成影響下胚軸伸長(zhǎng)。而本研究中35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株高度與野生型相比，明顯下降，與GA3生物合成相關(guān)，抑制GA3生物合成，使植物體內(nèi)源GA3含量降低，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株矮化。

3.2擬南芥AtOFP4基因?qū)ㄆ鞴偕L(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控

根據(jù)花器官發(fā)育的“ABC模型”，被子植物四輪花器官的特征由A、B、C三類同源異型基因的功能決定。每類基因均在相鄰的兩輪花器官中表達(dá)，A類和C類基因相互拮抗。A類基因單獨(dú)作用決定萼片特征，A類和B類基因作用決定花瓣產(chǎn)生，B類和C類基因共同決定雄蕊形成，而心皮特征由C類基因功能決定[22]。在擬南芥中，APETALA1 （AP1）和APETALA2（AP2）屬于A類功能基因，在第1輪中產(chǎn)生萼片[23-24]。AP1既是花分生組織的特征基因，又是花器官的特征基因。在花分化初期，其在整個(gè)花原基里表達(dá)；在花器官分化階段，AP1在萼片和花瓣中表達(dá)[25-26]。決定花器官突變體基因研究表明，除AP2外，所有與花器官發(fā)育相關(guān)的功能基因都是轉(zhuǎn)錄因子，含高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，屬于MADS-box家族。這些轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)DNA區(qū)域結(jié)合調(diào)控該基因轉(zhuǎn)錄[23-24]。本研究中，AtOFP4是一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子，而35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株花的萼片短小，推測(cè)，AtOFP4可能與AP1相互作用，調(diào)控萼片發(fā)育。

原位雜交檢測(cè)花粉囊結(jié)果顯示，OsGA3ox1在絨氈層有表達(dá)，表明GA也具有調(diào)控花粉囊發(fā)育作用[27]。擬南芥中GA20-氧化酶基因家族中有5個(gè)成員，即AtGA20ox1、AtGA20ox2、AtGA20ox3、AtGA 20ox4和AtGA20ox5。AtGA20ox1在莖和花序中表達(dá)，AtGA20ox2在花序和發(fā)育中的莢果中表達(dá)，過(guò)量表達(dá)GA20-氧化酶促進(jìn)擬南芥提前開花[28]。研究發(fā)現(xiàn)，AtGA20ox2突變體表現(xiàn)出開花時(shí)間稍有延遲，而GA20ox1GA20ox2雙突變體表現(xiàn)為開花時(shí)間顯著延遲[29]。

根據(jù)本試驗(yàn)觀察結(jié)果顯示，35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株花粉囊干癟，可能與GA有關(guān)。為探究在這種情況下，35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株能否正常受精結(jié)實(shí)。經(jīng)過(guò)觀察，發(fā)現(xiàn)35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株受精結(jié)實(shí)，可產(chǎn)生種子（見圖14B），種子可正常萌發(fā)生長(zhǎng)，但角果十分瘦小（見圖14A），種子產(chǎn)量很低。這可能與花粉囊干癟相關(guān)。同一時(shí)期35S: HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株的花期遲于野生型（見圖10A）。這與Rieu等對(duì)擬南芥ga20ox2突變體研究結(jié)果相似[29]，即在35S:HA-OFP4轉(zhuǎn)基因植株中，GA20-氧化酶基因表達(dá)受到抑制。推測(cè)AtOFP4通過(guò)抑制GA合成過(guò)程中關(guān)鍵基因的表達(dá)，降低植物體內(nèi)GA含量，影響擬南芥花發(fā)育及其角果形成。

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Effect of transcription factor AtOFP4 on epidermal cells elongation in

Arabidopsis thaliana

(1. School of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. School of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:In order to explore the function of Arabidopsis thaliana transcription factor AtOFP4 in plant growth and development, we screened T-DNA insertion mutant of AtOFP4 which is one of Class I of Arabidopsis thaliana OVATE family protein AtOFPs. Phenotype of the Atofp4 mutant and 35S:HA-OFP4 transgenic plants we got before was analyzed. The results showed that Atofp4 mutants were similar to wild type plants, no visible difference in morphologic phenotype. However 35S:HA-OFP4 transgenic plants showed multi-effect distortion in organ shape and structure. Further analysis found that the epidermal cells of ground organs in plants overexpressing AtOFP4 were significantly shortened on the long axis, leading to significant change in shape and structure of plant organs. Exogenous GA3could partially restore defects in hypocotyl elongation in 35S:HA-OFP4 transgenic plants, suggesting a connection between AtOFP4 and GA3. Taken together, our results showed that over expression of AtOFP4 gene could influence epidermic cell elongation, resulting in deficiency in growth and development of transgenic plants.

作者簡(jiǎn)介：常纓（1970-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参镔Y源學(xué)與植物分子生物學(xué)。E-mail: changying@neau.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31370221）

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轉(zhuǎn)錄因子AtOFP4影響擬南芥表皮細(xì)胞的伸長(zhǎng)

1 材料與方法

2 結(jié)果與分析

3 討論

1　材料與方法

2　結(jié)果與分析

3　討論