宋潤(rùn)波 馬建亭 孟增智 賈慶雨 董耀 劉偉

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，也是頭頸部常見的惡性腫瘤之一。研究資料表明，甲狀腺癌占頭頸部惡性腫瘤的5.11%，占全身惡性腫瘤的0.22%～1.0%［1］。甲狀腺癌也是近年來(lái)發(fā)病率增長(zhǎng)較快的惡性腫瘤。據(jù)來(lái)自國(guó)際癌癥學(xué)會(huì)資料的統(tǒng)計(jì)顯示:甲狀腺癌在世界各國(guó)的發(fā)病率逐年上升。在我國(guó)，通過流行病學(xué)的調(diào)查，甲狀腺癌的發(fā)病率也逐年上升。不同于一般癌腫多發(fā)生于老年人，甲狀腺癌較多發(fā)生于年輕女性，年齡35 ～50 歲，男女比為1∶2.6。甲狀腺癌中最常見的是分化型甲狀腺癌(differentiated thyroidcarcinoma，DTC)，占所有甲狀腺癌的95%。分化型甲狀腺癌又分為乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)占DTC 的85%和濾泡狀甲狀腺癌(follictalar thyroid carcinoma，F(xiàn)TC)，占DTC 的15%［1］。當(dāng)前，甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制不甚明了。PTEN 蛋白是1997 年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，研究顯示PTEN 蛋白與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)密切相關(guān)。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，對(duì)腫瘤具有調(diào)控作用［2］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)PTEN 蛋白和TNF-α 在甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺腺瘤中的表達(dá)，檢測(cè)PTEN 蛋白和TNF-α 與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理因素的關(guān)系。探索PTEN 蛋白和TNF-α在甲狀腺癌的病因、檢查、治療、預(yù)后等方面的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取石家莊市第三醫(yī)院2009 至2014 年甲狀腺乳頭狀癌切除標(biāo)本共60 例，患者進(jìn)行手術(shù)前沒有應(yīng)用放療和化療，所切取標(biāo)本均有病理診斷。其中男24 例，女36 例;年齡25 ～76 歲，平均年齡(40.5±8.4)歲。甲狀腺腺瘤切除標(biāo)本60 例，男28 例，女32 例;年齡22 ～78 歲，平均年齡(46.7±5.6)歲。2 組所切取標(biāo)本患者的年齡、性別比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

1.2 試劑及方法免疫組化染色所用試劑為鼠抗人PTEN 蛋白免疫組化單克隆抗體(即用型)、鼠抗人TNF-α 免疫組化單克隆抗體(即用型)及SP 法試劑盒，購(gòu)于上海華東生物工程有限公司。DAB 顯色劑(氨基聯(lián)苯胺試劑盒)、PBS(磷酸鹽緩沖液)、檸檬酸緩沖液及其他免疫組化試劑均由石家莊市第三醫(yī)院病理科提供。操作原理為抗原結(jié)合抗體，通過已知抗體檢測(cè)抗原。按照SP 試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行操作。陰性對(duì)照用PBS 代替一抗，陽(yáng)性對(duì)照為試劑盒中陽(yáng)性片。所有切片來(lái)自石家莊市第三醫(yī)院病理科，使用同一批號(hào)試劑來(lái)完成免疫組化染色。

1.3 結(jié)果判定PTEN 蛋白和TNF-α 的免疫組化結(jié)果通過DAB 顯色系統(tǒng)顯色，陽(yáng)性表現(xiàn)為深淺不一的黃色顆粒位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。依照參考文獻(xiàn)［3］免疫組化的結(jié)果通過半定量積分的方式進(jìn)行判斷，隨機(jī)確定染色較為清楚的高倍視野6 ～7 個(gè)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞占同類計(jì)數(shù)細(xì)胞比例＜5%記為0 分，6%～25%記為1 分，26%～50%記為2 分，51%～75%記為3 分，＞75%記為4 分。染色強(qiáng)度以陽(yáng)性細(xì)胞顏色為衡量標(biāo)準(zhǔn):不染色=0 分，淡黃色=1 分，黃色=2 分，棕黃色=3 分。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例與染色強(qiáng)度的乘積作為細(xì)胞的表達(dá)水平:0 分=陰性(－)，1 ～4分=弱陽(yáng)性(+)，5 ～8 分=中度陽(yáng)性(++)，9 ～12分=強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。(－)～(+)視為陰性表達(dá)，(++)～(+++)視為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，各組間比較應(yīng)用pearson χ2檢驗(yàn)和Fisher 確切概率檢驗(yàn)。PTEN 蛋白和TNF-α 的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的關(guān)系采用Spearson 秩相關(guān)分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺腺瘤中PTEN 蛋白和TNF-α 的表達(dá)甲狀腺乳頭狀癌組織中PTEN 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于在甲狀腺腺瘤中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。甲狀腺乳頭狀癌組織中TNFα 陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于甲狀腺腺瘤中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1。

表1 甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺腺瘤中PTEN 蛋白和TNF-α 的表達(dá)n=60

2.2 PTEN 蛋白和TNF-α 的表達(dá)與甲狀腺癌臨床病理因素的關(guān)系不同性別、年齡、腫瘤大小的患者，癌組織中二者的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。而有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)漿膜浸潤(rùn)、不同TNM臨床分期的患者，癌組織中PTEN 蛋白和TNF-α 的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 PTEN 蛋白和TNF-α 的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理因素的關(guān)系 例

2.3 相關(guān)性檢驗(yàn)60 例甲狀腺乳頭狀癌中PTEN 蛋白和TNF-α 同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性的例數(shù)為6 例，同時(shí)表達(dá)陰性的例數(shù)18 例，PTEN 蛋白表達(dá)陽(yáng)性而TNF-α 表達(dá)陰性者10 例，PTEN 蛋白表達(dá)陰性而TNF-α 表達(dá)陽(yáng)性者15 例。通過Spearson 秩相關(guān)分析顯示:兩者在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r = －0.338，P ＜0.05)。

3 討論

PTEN 蛋白定位于人染色體10q23.3 位點(diǎn)，全長(zhǎng)約200 kb［4］，是由Li 等［4］3 個(gè)研究小組在1997 年發(fā)現(xiàn)并克隆到的一種抑癌基因，具有較高的突變率和缺失率。通過對(duì)PTEN 蛋白開放讀碼框架序列分析表明:細(xì)胞骨架蛋白張力蛋白(tensin)與PTEN 蛋白有176 個(gè)氨基酸序列與同源，所以被命名PTEN 蛋白。PTEN 蛋白中由403 個(gè)氨基酸組成的一條多肽鏈構(gòu)成氨基端的磷酸酶結(jié)構(gòu)域，其末端區(qū)域具有雙特異性磷酸酶功能，是到目前為止發(fā)現(xiàn)并確定的唯一具有蛋白酪氨酸磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶活性的雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因。它不但具有抑癌基因的特性，還具有磷酸酶活性。而PTEN 蛋白的氨基端的磷酸酶結(jié)構(gòu)域易發(fā)生突變而失活?，F(xiàn)已證實(shí):正是該結(jié)構(gòu)域的突變、失活與多種腫瘤如頭頸部腫瘤、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤及前列腺癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

PTEN 蛋白的生物學(xué)功能如下:(1)通過PTEN/PI3K/AKT 信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。PI3K 受到特定細(xì)胞因子(如IGF，TNF)的刺激，在細(xì)胞膜上生成磷脂酰肌醇-3，4，5-磷酸［phosph atidylinositol(3，4，5)-trisphosphate，PIP3］，作為細(xì)胞第二信使，PIP3 與絲、蘇氨酸激酶(AKT)或蛋白激酶B(PKB)結(jié)合，使其被磷酸化而活化?；罨腁KT 再進(jìn)一步活化其下游因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、凋亡。在該信號(hào)通路中，PTEN 蛋白對(duì)PI3K/AKT 通路起著拮抗作用。PTEN 蛋白使PIP3 去磷酸化為PIP2，從而抑制PI3K 的磷酸化作用，使PI3K/AKT 通路活化受到抑制，阻斷PKA 及其下游激酶的活性，使細(xì)胞周期阻滯在G1 期，干擾細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。(2)PTEN/ERK/MARK 途徑，PTEN 通過抑制ERK 的激活，阻斷MARK 途徑的磷酸化，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化［5，6］。(3)PTEN 下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF-C)的表達(dá)并影響其分泌，從而抑制血管生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲［7］。(4)PTEN 蛋白可抑制一些肌動(dòng)蛋白張力纖維的形成，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移及浸潤(rùn)。對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)起到抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)中，PTEN 蛋白在甲狀腺瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)率與在甲狀腺乳頭狀癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率比較有顯著差異，提示甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生可能與PTEN 的表達(dá)下調(diào)緊密相關(guān)。提示PTEN 蛋白表達(dá)下調(diào)和缺失可能在甲狀腺腫瘤發(fā)生過程中起到重要作用。

我們分析甲狀腺乳頭狀癌臨床病理因素與PTEN蛋白的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，PTEN 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜浸潤(rùn)、TNM 分期相關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的PTEN 蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率(10.1%)顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTEN 蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率(31.2%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。伴漿膜浸潤(rùn)的PTEN 蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率(10.8%)顯著低于不伴漿膜浸潤(rùn)的PTEN 蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率(39.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。Ⅲ、Ⅳ期甲狀腺乳頭狀癌組織PTEN 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(8.6%)顯著低于Ⅰ、Ⅱ期甲狀腺乳頭狀癌組織 PTEN 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(32.4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。提示PTEN 蛋白的表達(dá)下調(diào)及缺失可能與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲、轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)。由此推斷PTEN 蛋白表達(dá)的下調(diào)及缺失可能既是甲狀腺惡性腫瘤發(fā)生的原因之一，而且也與甲狀腺乳頭狀癌的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)和預(yù)后緊密相關(guān)。

TNF-α 是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，它既具有抗腫瘤作用，可導(dǎo)致炎癥、細(xì)胞壞死，并能夠抑制腫瘤新生血管的形成，影響腫瘤細(xì)胞膜的滲透性，從而引起細(xì)胞凋亡。TNF-α 也可與白介素、干擾素等一起對(duì)腫瘤細(xì)胞起到殺傷作用，使腫瘤生長(zhǎng)受到抑制，使機(jī)體抗腫瘤能力得到提升［8］。適量存在的TNFα 對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用。而過量分泌的TNF-α 則會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生副作用。TNF-α 可刺激單核巨噬細(xì)胞分泌白介素、前列腺素等大量血管活性介質(zhì)，這些血管活性介質(zhì)既可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)也明顯降低機(jī)體的免疫功能。同時(shí)，TNF-α 誘導(dǎo)VEGFmRNA 的表達(dá)增加，促進(jìn)VEGF 合成增加，VEGF 可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖并改變淋巴管的生理特性，為腫瘤經(jīng)淋巴管轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌患者較甲狀腺瘤患者具有較高水平TNF-α 表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。甲狀腺乳頭狀癌臨床病理因素與TNFα 的關(guān)系顯示:有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的TNF-α 表達(dá)的陽(yáng)性率(92.8%)顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TNF-α 表達(dá)的陽(yáng)性率(53.2%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。伴漿膜浸潤(rùn)的TNF-α 表達(dá)的陽(yáng)性率(81.1%)顯著高于不伴漿膜浸潤(rùn)的TNF-α 表達(dá)的陽(yáng)性率(56.5%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。Ⅲ、Ⅳ期甲狀腺乳頭狀癌組織TNF-α 表達(dá)陽(yáng)性率(86.9%)顯著高于Ⅰ、Ⅱ期甲狀腺乳頭狀癌組織TNF-α 表達(dá)陽(yáng)性率(62.2%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。結(jié)果表明:甲狀腺腫瘤的發(fā)生，可激活體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞過分釋放TNF-α，另一方面腫瘤細(xì)胞也可通過自分泌方式分泌TNF-α，并且TNF-α 隨著腫瘤的負(fù)荷的不斷增加，腫瘤的分期惡化而進(jìn)一步升高，過度升高的TNF-α 不但促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，同時(shí)也使機(jī)體的免疫功能受到損害［9］，促進(jìn)甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺乳頭狀癌組織中PTEN 蛋白與TNF-α 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。分析甲狀腺乳頭狀癌中，TNF-α 可能抑制PTEN 蛋白的活性。促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［10］。而腫瘤的發(fā)生，反過來(lái)又使TNF-α 生成增多。由此推測(cè)PTEN 和TNF-α 可能協(xié)同參與并促進(jìn)甲狀腺癌的發(fā)展。

綜上所述，PTEN 蛋白和TNF-α 在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過程中具有重要意義，二者之間的相關(guān)性還有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。就目前而言，應(yīng)用二者的聯(lián)合檢測(cè)，有利于甲狀腺乳頭狀癌的早期發(fā)現(xiàn)、診斷及預(yù)后判斷。

1 Dahia PL.A unique tumor suppressor gene.Endoerrola Cancer，2000，7:115-129.

2 Lo SZ，Steer JH，Joyce DA.TNF-α renders macrophages resistant to a range of cancer chemotherapeutic agents through NF-κ B mediated antagosis signoling.Cancer Lett，2011，307:80-92.

3 許良中，楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn).中國(guó)癌癥雜志，1996，6:229-311.

4 Li J，Yen C，Liaw D，et al.PTEN，a putative protein tyrosine phosphatase gene mu-rated in human brain，breast，and prostate cancer.Science，1997，275:1943.

5 王亞明，田增民.PTEN 腫瘤抑制基因和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)研究進(jìn)展.海軍總醫(yī)院學(xué)報(bào)，2004，9:167-172.

6 Wen LP，Jessica LB，Charis E.PTEN blocks insulin-mediate EST-2 Phosphorylation through Map kinase，Independent of the phosphoinositide 3-kinas-e way.Hum Mol genet，2002，11:1687.

7 Tammela T，Zarkada G，Wallgard E，et al.Blocking VEGFR-3 suppresses angiogenic sprouting and vascular net-work formation.Nature，2008，454:656-660.

8 Wu GX，Wu ZS，He BL，et al.Epidemiological characteristics of stroke in 16 provinces of China.Natl Med J China，1994，74:281-325.

9 Lo SZ，Steer JH，Joyce DA.TNF-α renders macrophages resistant to a range of cancer chemo-therapeutic agents through NF-κB-madiated antogonism of apophosis sigaling.Cancer Lett，2011，307:80-92.

10 Pan L.Histone deacetylase inhibitor trichostatin a potentiatesdoxorubicin-induced apoptosis by up-regulating PTEN expression.Cancer，2007，109:1676-1688.