全娟花 李 鵬 黃 瑞 楚佳奇**

(1. 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東湛江 524001；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院干細(xì)胞研發(fā)與細(xì)胞治療中心，廣東湛江 524001)

陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis，Tv)是一種寄生于男女泌尿、生殖道的鞭毛蟲，可引起滴蟲性陰道炎、前列腺炎和泌尿系統(tǒng)炎等多種生殖系統(tǒng)疾病。滴蟲病是常見的性傳播疾病，該病呈全球性分布，人群普遍易感(Van der Pol, 2007)。滴蟲的感染是引起女性宮頸癌、不孕不育以及促進(jìn)人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的危險(xiǎn)因素之一(Soper, 2004)。國外學(xué)者研究表明，陰道毛滴蟲感染能誘導(dǎo)活性氧(ROS)介導(dǎo)的caspase-3依賴性中性粒細(xì)胞凋亡(Songetal., 2008)。陰道毛滴蟲感染前列腺癌上皮細(xì)胞RWPE-1，可通過激活ROS，胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)和人核轉(zhuǎn)錄因子 (Nuclear factor kb, NF-kB)使白介素1β(IL-1β)分泌增多，進(jìn)而誘發(fā)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的遷移，導(dǎo)致炎癥反應(yīng) (Seoetal., 2014)。細(xì)胞內(nèi)ROS增多還可激活蛋白激酶C并刺激細(xì)胞增殖或死亡(Schrecketal., 1991；Chenetal., 1995; Lietal., 1997;)。NAC含有硫氫基，是一種ROS清除劑(Ishikawaetal., 2008)。寄生蟲在宿主體內(nèi)寄生過程中，其排泄分泌物在宿主體內(nèi)對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響(Lightowlersetal., 1988)。TvESP可誘導(dǎo)人子宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡，但機(jī)制還不明確。為此，本研究利用TvESP建立SiHa細(xì)胞凋亡模型，旨在探討：(1)NAC能否抑制TvESP引起的SiHa細(xì)胞毒性作用；(2)NAC是否通過降低胞內(nèi)ROS水平來抑制TvESP誘導(dǎo)的SiHa細(xì)胞凋亡，明確ROS清除劑對SiHa細(xì)胞保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步研制與開發(fā)治療陰道毛滴蟲的新型藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NAC和DCFH-DA購自美國Sigma-Aldrich公司，CellTiter 96 AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自美國Promega公司，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibico公司，cleaved caspase-3和PARP-1抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。人子宮頸癌SiHa細(xì)胞和陰道毛滴蟲(TrichomonasvaginalisT016分離株)由韓國忠南大學(xué)感染生物學(xué)教研室提供。

1.2 陰道毛滴蟲培養(yǎng)及Tv ESP的制備

參照Chang等(2004)的方法，將陰道毛滴蟲分離株TvT016接種到螺旋口玻璃瓶內(nèi)，用含10%馬血清的Diamond’s trypticase yeast-extract maltose (pH=6.2)培養(yǎng)液于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。

參照我們前期(Quanetal., 2014)使用的方法，收集對數(shù)生長期的陰道毛滴蟲，加入裝有PBS的試管內(nèi), 混勻(活蟲體密度為1x107/mL)，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，10 000 g 離心30 min 沉淀蟲體，取上清加入透析袋中，置于飽和聚蔗糖溶液中，透析后的濃縮液即為TvESP。TvESP經(jīng)0.2 μm濾膜過濾，Bradford法測定蛋白濃度后置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人子宮頸癌細(xì)胞SiHa在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，2～3天換液一次，用含0.25%胰蛋白酶消化液消化后傳代培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞存活率的檢測

SiHa細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞處于80%～90%融合狀態(tài)時(shí),根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行不同處理：100 μg/mLTvESP處理SiHa細(xì)胞16 h(實(shí)驗(yàn)組)；1 mmol/L NAC預(yù)處理30 min后，再添加100 μg/mLTvESP處理SiHa細(xì)胞16 h(實(shí)驗(yàn)組)；1 mmol/L NAC處理SiHa細(xì)胞30 min(對照組)。每組均包括3個(gè)復(fù)孔。利用CellTiter 96 AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑盒檢測活細(xì)胞數(shù)量。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ROS含量的檢測

利用熒光探針DCFH-DA活性氧檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ROS。SiHa細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞處于80%～90%融合狀態(tài)時(shí),根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行不同處理,16 h后用HBSS漂洗蓋玻片兩次, 加入10 μmol/L DCFH-DA染液于37℃孵育15 min。再用HBSS漂洗蓋玻片兩次，DAPI熒光封片劑封片，20 min后在熒光顯微鏡下攝片。

1.6 免疫印記法檢測cleaved caspase-3和PARP-1蛋白表達(dá)

按1.4中描述的方法將實(shí)驗(yàn)分組處理完成后收集各組細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，每組取40 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，分別用抗Cleaved caspase-3、PARP-1和α-Tubulin抗體于4℃孵育過夜，再用過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育，最后通過強(qiáng)化學(xué)發(fā)光可視劑曝光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用One-way ANOVA及LSD-t檢驗(yàn)，P

2 結(jié)果

2.1 體外成功培養(yǎng)陰道毛滴蟲T016分離株

將陰道毛滴蟲T016分離株進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，通過計(jì)數(shù)了解生長情況并觀察陰道毛滴蟲的形態(tài)。圖 1結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，陰道毛滴蟲達(dá)到生長高峰，蟲體呈現(xiàn)多分裂相、蟲體變大、呈圓形、內(nèi)含多個(gè)胞核、胞膜外緣可見數(shù)叢鞭毛。

圖1 陰道毛滴蟲T016分離株形態(tài)Fig.1 Morphology of Trichomonas vaginalis T016

2.2 NAC抑制Tv ESP引起的SiHa細(xì)胞毒性

如圖2所示，100 μg/mLTvESP處理SiHa細(xì)胞16 h后，細(xì)胞存活率明顯降低。1 mmol/L NAC預(yù)處理30 min，再用TvESP處理，可觀察到TvESP的細(xì)胞毒性作用減弱，提示ROS清除劑NAC能降低TvESP對SiHa細(xì)胞的毒性作用。1 mmol/L NAC本身不影響SiHa細(xì)胞存活率。

圖2 N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)滴蟲排泄分泌物對SiHa細(xì)胞引起的細(xì)胞毒性Fig.2 N-acetylcysteine(NAC) inhibits SiHa cell cytotoxicity induced by Trichomonas vaginalis excretory-secretory products (Tv ESP)

利用CellTiter 96 AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑盒檢測SiHa對照組(SiHa Control)、滴蟲排泄分泌物組(TvESP)、N-乙酰-L-半胱氨酸+滴蟲排泄分泌物組(NAC+TvESP)和N-乙酰-L-半胱氨酸組(NAC)細(xì)胞存活率?！?”表示與SiHa正常對照組比較有顯著性差異(P<0.05)；“#”表示與滴蟲排泄分泌物組比較有顯著性差異(P<0.05)。

Cell viability of SiHa Control、TvESP、NAC+TvESP and NAC group were analyzed by CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay System. * indicates the significant difference(P<0.05)as compared with SiHa control group; # indicates the significant difference(P<0.05)as compared withTvESP group(P<0.05).

圖3 N-乙酰-L-半胱氨酸抑制滴蟲排泄分泌產(chǎn)物生成的活性氧Fig.3 N-acetylcysteine(NAC) inhibits the production of reactive oxygen species(ROS)induced by Trichomonas vaginalis excretory-secretory products (ESP)

2.3 NAC抑制Tv ESP對ROS生成的作用

DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜。進(jìn)入細(xì)胞后，可被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH，因DCFH不能自由透過細(xì)胞膜，易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。胞內(nèi)ROS可將無熒光的DCFH氧化成發(fā)綠色熒光的DCF。綠色熒光的強(qiáng)弱可以間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。圖3結(jié)果顯示，TvESP作用人子宮頸癌SiHa細(xì)胞16 h，可使胞內(nèi)ROS生成增多。而應(yīng)用ROS清除劑NAC(1 mmol/L)預(yù)處理30 min后再用TvESP作用SiHa細(xì)胞16 h，能顯著減少TvESP誘導(dǎo)的胞內(nèi)ROS生成。

2.4 NAC抑制Tv ESP誘導(dǎo)的cleaved caspase-3和cleaved PARP-1表達(dá)

為了解TvESP誘發(fā)SiHa細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，采用免疫印記法檢測SiHa細(xì)胞cleaved caspase-3和PARP-1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照組比較，TvESP組SiHa細(xì)胞中procaspase-3被激活后產(chǎn)生的17、19 kDa的cleaved caspase-3顯著高于對照組，活化的cleaved caspase-3切割PARP-1產(chǎn)生的片段(cleaved PARP-1，89 kDa)也顯著高于對照組。而用NAC預(yù)處理后cleaved caspase-3和cleaved PARP-1表達(dá)顯著降低(圖4)。以上結(jié)果表明，TvESP誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的ROS可激活caspase-3并啟動(dòng)對其底物PARP-1的切割，而NAC可抑制此反應(yīng)。

圖4 免疫印記法檢測激活型半胱天冬酶-3和腺苷二磷酸核糖聚合酶-1的表達(dá)Fig.4 Detection of cleaved caspase-3 and(poly(ADP-ribose)polymerase-1)(PARP-1)by Western blot收集SiHa對照組(SiHa Control)、滴蟲排泄分泌物組(Tv ESP)、N-乙酰-L-半胱氨酸+滴蟲排泄分泌物組(NAC+ Tv ESP)和N-乙酰-L-半胱氨酸組(NAC)細(xì)胞并利用免疫印記法檢測激活型半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)蛋白表達(dá)。α微管蛋白(α-tubulin)作為內(nèi)參。SiHa Control, Tv ESP, NAC+ Tv ESP and NAC group cells were collected. Cleaved caspase 3 and PARP-1 protein levels were analyzed by Western blot. α-tubulin was used as loading control.

3 討論

本研究證實(shí)，TvESP對SiHa細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作用，使細(xì)胞存活率顯著降低。TvESP對SiHa細(xì)胞的毒性作用可能與其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，主要表現(xiàn)在能使SiHa細(xì)胞內(nèi)的ROS生成增多。本文觀察到ROS清除劑NAC預(yù)處理能明顯降低TvESP對SiHa細(xì)胞毒性作用，使細(xì)胞存活率升高，進(jìn)一步證實(shí)了上述推論。據(jù)報(bào)道，紫花牡荊素可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生并通過激活線粒體凋亡途徑誘發(fā)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡(Chenetal., 2011)。本研究結(jié)果表明，TvESP可使細(xì)胞ROS水平升高并具有細(xì)胞毒性作用，而NAC在抑制TvESP引起細(xì)胞毒性作用的同時(shí)，能顯著減少ROS生成，提示NAC抑制TvESP的細(xì)胞毒性作用可能與胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生減少有關(guān)。

Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子，通常以無活性的procaspase-3存在,當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)激活或各種外界有害物質(zhì)刺激時(shí)，procaspase-3被剪切激活后就轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腸leaved caspase-3,誘發(fā)細(xì)胞凋亡(Nicholsonetal., 1995)。PARP-1是一種存在于真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，催化聚ADP核糖化的細(xì)胞核酶，其主要作用是參與DNA的損傷修復(fù)(Satohetal., 1992)。PARP-1為caspase-3的底物，大小為116 kDa，在有些細(xì)胞凋亡過程中被裂解成89 kDa和24 kDa兩個(gè)片段，因此cleaved PARP-1裂解片段(89 kDa)經(jīng)常被作為細(xì)胞早期凋亡的證據(jù)(Kohetal., 2005)。本研究用TvESP處理SiHa細(xì)胞16 h后，cleaved caspase-3和cleaved PARP-1表達(dá)明顯升高。NAC預(yù)處理后可顯著下調(diào)cleaved caspase-3和cleaved PARP-1表達(dá)，提示NAC能顯著降低TvESP誘導(dǎo)的胞內(nèi)ROS水平，抑制SiHa細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果進(jìn)一步闡明了TvESP誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性的作用機(jī)制，為治療陰道毛滴蟲的新型藥物的研制與開發(fā)提供理論依據(jù)。